雌、孕激素和血管內(nèi)皮生長因子在子癇前期胎盤中的表達

葉蔚，王明蕊，范可心，張穎

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，湛江 524000）

子癇前期（preeclampsia，PE），是一種十分常見的妊娠并發(fā)癥，多發(fā)生在妊娠20 周胎盤功能成熟后，其發(fā)病率約為5%～7%［1］，臨床表現(xiàn)以蛋白尿和高血壓為主，并伴有周身小血管痙攣和多臟器損傷，是造成圍生期母嬰死亡的主要原因之一［2］。臨床上通常采用解除血管痙攣和降血壓等對癥治療，其預(yù)后并不理想。

目前，對于PE 的病因及發(fā)病機制并不十分清楚，妊娠期激素水平異常和血管內(nèi)皮功能受損被認(rèn)為是導(dǎo)致PE 的重要致病機制［3-4］。妊娠期胎盤分泌的激素可以維持胎兒的正常生長發(fā)育，異常的激素分泌可能導(dǎo)致妊娠期病變，其中雌、孕激素在妊娠期中扮演著十分重要的角色［5］。此外，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在促進血管生成特別是胎盤血管生成中發(fā)揮著十分重要的功能，其表達和功能異常也是導(dǎo)致PE 發(fā)生的重要原因［6］。本研究通過檢測PE患者和正常孕婦胎盤組織中雌、孕激素和VEGF的表達并分析其與胎盤血管損傷的相關(guān)性，探討PE的發(fā)病機制。

資料和方法

一、一般資料

選取2013年5月至2014年5月入住我院分娩被確診為PE 的患者50例，作為觀察組，患者年齡23～32 歲，平均年齡（26.1±2.5）歲，平均孕期（35.3±2.3）周。PE 診斷參照樂杰主編的《婦產(chǎn)科學(xué)（第七版）》中的標(biāo)準(zhǔn)：妊娠20 周后，患者血壓≥140／90mmHg，患者尿蛋白≥300mg／24h，并伴有頭痛和上腹部不適等臨床癥狀［7］。

同時，選取同期入住我院分娩的正常孕婦50例為對照組，年齡24～32 歲，平均年齡（25.6±2.2）歲，平均孕期（39.7±2.1）周。兩組孕婦年齡和孕周等一般資料比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①有先天性遺傳性疾?。虎谟凶訉m肌瘤等婦科疾?。虎鄱嗵?；④有其他妊娠期并發(fā)癥；⑤有高血壓、心臟病，腎炎、內(nèi)分泌失調(diào)等原有基礎(chǔ)病。

所有標(biāo)本均在本院倫理委員會批準(zhǔn)和研究對象知情同意后收集。

二、主要試劑

雌激素CLIA 試劑盒、孕激素CLIA 試劑盒購自美國Uscn Life Science公司；兔抗人VEGF多克隆抗體、鼠抗兔免疫組化檢測試劑購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；二氨基聯(lián)苯胺DAB 試劑盒購自北京中杉金橋公司。

三、方法

1.標(biāo)本采集：所有標(biāo)本均取自分娩后胎盤近臍帶附近組織。標(biāo)本取材后用無菌PBS（pH＝7.2）淋洗3次，置于10%甲醛中固定。所有孕婦于產(chǎn)前取空腹外周靜脈血4ml，3 500r／min離心5min，取血清于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.化學(xué)熒光免疫法檢測雌、孕激素水平：基于競爭法原理。按試劑盒說明操作。孵育后，洗掉未結(jié)合酶聯(lián)物，加入底液后，用儀器讀取相對光單位（OD 值），光強度與樣本中雌孕激素的濃度成反比。分別根據(jù)雌、孕激素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD 值計算出雌、孕激素標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD 值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。

3.免疫組化法檢測VEGF 表達：采用二步法。4μm 組織切片常規(guī)脫蠟后，60℃烤箱過夜，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；采用檸檬酸鹽緩沖液（pH＝6.0）高壓抗原修復(fù)法進行抗原修復(fù)，PBS 淋洗；滴加過氧化物酶阻斷液，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育10 min；滴加一抗，4℃下孵育過夜，PBS淋洗；滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；梯度酒精脫水。

光學(xué)顯微鏡下觀察判定免疫組化結(jié)果。結(jié)果根據(jù)陽性細胞顯色比例和染色強度做半定量判定［8］：按陽性細胞率評分，陽性細胞所占百分比11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；按染色程度，采用Image-Pro 6.0軟件行光密度值評分，較弱者為1分，中度為2分，強染色為3分；綜合兩種評分，6～7分為強陽性（＋＋＋），4～5分為中度陽性（＋＋），2～3分為弱陽性（＋）。只要細胞陽性率＜10%而不論染色強度如何均視為陰性。

4.HE染色觀察組織學(xué)變化：4μm 組織切片行HE染色，觀察標(biāo)本的組織學(xué)特點。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組胎盤組織形態(tài)學(xué)觀察

對照組胎盤組織的絨毛形態(tài)完整，可見間質(zhì)和血管正常；觀察組胎盤組織絨毛形態(tài)不規(guī)則，絨毛間可見類似纖維素樣壞死或滲出沉積，胎盤血管出現(xiàn)損傷，間質(zhì)出現(xiàn)水腫和增生，血管減少并伴有淤血（圖1）。

二、兩組胎盤組織雌、孕激素水平

采用化學(xué)熒光免疫法檢測兩組胎盤組織中雌孕激素的表達。觀察組胎盤組織雌激素（E2）表達量顯著低于對照組（P＜0.05），而觀察組胎盤組織孕激素（Pg）表達量顯著高于對照組（P＜0.05）；觀察組胎盤組織E2／Pg比值顯著低于對照組（P＜0.05）（表1）。

圖1 兩組胎盤組織形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，×200）

表1 兩組胎盤組織雌、孕激素水平和E2／Pg比值（±s）

表1 兩組胎盤組織雌、孕激素水平和E2／Pg比值（±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) E2（pmol／L） Pg（nmol／L） E2／Pg觀察組 50 40.81±6.88＊595.77±66.59＊ 0.068±0.05＊對照組50 79.20±7.23 328.40±59.56 0.241±0.18

三、兩組胎盤組織VEGF表達

觀察組和對照組VEGF 蛋白陽性表達分別為96%和46%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。觀察組VEGF 蛋白染色呈深黃色，主要分布在胎盤的絨毛滋養(yǎng)細胞，其次分布在血管內(nèi)皮細胞，偶見部分間質(zhì)細胞表達；對照組VEGF蛋白表達部位與觀察組無異，但是染色較弱，呈淺黃色（圖2）。

表2 兩組胎盤組織VEGF表達

圖2 免疫組化檢測兩組胎盤組織中VEGF表達情況（×200）

討 論

妊娠期雌、孕激素主要由胎盤組織產(chǎn)生。雌、孕激素是重要的妊娠期激素，對胚胎著床、胎兒發(fā)育以及分娩起著至關(guān)重要的作用。妊娠期婦女雌孕激素分泌異常可能引起各種妊娠期疾病。

有研究認(rèn)為雌激素在子癇前期中起保護作用，其機制在于影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)增加血容量和影響內(nèi)源性一氧化氮和酶的活性增加舒血管物質(zhì)的釋放［9］。曹衛(wèi)平等［10］通過對26例子癇前期產(chǎn)婦的研究，發(fā)現(xiàn)子癇前期患者血清雌二醇水平明顯低于正常妊娠婦女。本研究結(jié)果顯示，子癇前期產(chǎn)婦和正常產(chǎn)婦雌二醇水平分別為（40.81±6.88）pmol／L和（79.20±7.23）pmol／L，前者明顯低于后者，提示血清雌二醇水平降低與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)。

孕激素在妊娠的保護作用，其機制在于降低內(nèi)皮素-1引起的胎盤缺血和增加舒血管物質(zhì)松弛肽的分泌［11］。然而對于孕激素在子癇前期中的作用尚存爭議。子癇前期患者血清孕激素水平在不同研究中結(jié)果不一，有升高者也有降低者［12-13］。曹衛(wèi)平等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者血清孕激素水平明顯高于正常妊娠婦女。本研究結(jié)果也顯示，子癇前期產(chǎn)婦和正常產(chǎn)婦血清孕激素水平分別 為（595.77±66.59）nmol／L 和（328.40±59.56）nmol／L，前者顯著高于后者。我們推測子癇前期病理作用與孕激素是相關(guān)的，其增加可能加重子癇前期的病情。其機制可能是通過抑制人基質(zhì)金屬蛋白酶-2 和人基質(zhì)金屬蛋白酶-9 的分泌，減少滋養(yǎng)細胞數(shù)目，不利于胎盤的著床；可能通過增加內(nèi)源性洋地黃樣因子，收縮血管，升高血壓，加重子癇前期病情；可能通過PI3K／Akt途徑抑制減少雌激素增加的舒血管物質(zhì)的釋 放［14-15］。

VEGF主要表達于胎盤組織的滋養(yǎng)細胞中，能夠參與胎盤血管網(wǎng)的形成、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞通透性、影響滋養(yǎng)細胞的分化和浸潤。VEGF 及其受體在早孕期主要表達于細胞滋養(yǎng)細胞，而在中、晚孕期主要表達于合體滋養(yǎng)細胞，并且滋養(yǎng)細胞源性VEGF可通過旁分泌調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞的分化和代謝［16］。作為重要的血管誘生因子，VEGF在妊娠早期參與胎盤血管網(wǎng)的形成，而在妊娠晚期主要調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的通透性，有利于胎兒生長發(fā)育［17］。孫曙光等［18］通過對25 例重度子癇前期患者的研究，發(fā)現(xiàn)子癇前期患者VEGF蛋白及其受體表達均明顯高于正常妊娠孕婦，提示VEGF可能與子癇前期的發(fā)病有一定關(guān)系。本研究表明，子癇前期產(chǎn)婦和正常產(chǎn)婦胎盤組織中VEGF 蛋白表達陽性率分別為96%和46%，前者明顯高于后者。說明VEGF有可能參與子癇前期的發(fā)病機制。

總之，妊娠期雌、孕激素和血管內(nèi)生長因子與子癇前期的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其具體機制尚待進一步研究。

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