941例胚胎玻璃化冷凍保存不同時間復(fù)蘇后臨床結(jié)局分析

趙靜，吳曉云，朱玉蓉，劉春玲，邱慧麒，方路

（浙江省湖州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖州 313000）

1983年澳大利亞首例凍融胚胎移植（FET）獲得臨床妊娠［1］，1984年世界首例凍融胚胎移植活產(chǎn)嬰兒出生［2］?，F(xiàn)在胚胎凍融技術(shù)在輔助生殖技術(shù)中不可或缺。胚胎凍融技術(shù)不僅提高累計臨床妊娠率，還能降低多胎妊娠［3］與卵巢過度刺激綜合征（OHSS）發(fā)生率［4］。目前，胚胎凍融技術(shù)主要分為兩類：程序化凍融和玻璃化凍融。1985年美國首例玻 璃 化 凍 融 鼠 胚 成 功［5］，1990 年Gordts 等［6］玻 璃化凍融人胚胎，成功獲得妊娠。目前玻璃化凍融方法較程序化凍融胚胎復(fù)蘇率高［7］，但由于玻璃化冷凍試劑中的二甲基亞砜（DMSO）對胚胎有一定的毒性，胚胎長期保存后其安全性仍需要進(jìn)一步研究。本文對我中心941 例玻璃化胚胎解凍周期進(jìn)行回顧，分析玻璃化胚胎保存時間對解凍后胚胎質(zhì)量與妊娠結(jié)局的影響。

材料與方法

一、研究對象

回顧性分析我中心2011年3 月至2014 年10月941例玻璃化冷凍胚胎解凍周期的患者資料。女方年齡20～40歲，平均（30.23±4.00）歲，不孕原因主要為男方因素與女方輸卵管因素，排除患子宮內(nèi)膜異位癥與干擾胚胎著床疾病的患者。本研究僅納入促排方案為常規(guī)長方案與超長方案所獲的玻璃化冷凍胚胎，排除行FET 三個周期以上患者。其中IVF周期762 例，ICSI周期179 例，均采用開放式玻璃化載桿冷凍第3天胚胎。

二、研究方法

1.分組：根據(jù)胚胎玻璃化冷凍保存時間不同將941 例FET 周 期 分 為3 組：1～＜9 個 月 組（749例）、9～＜16 個月組（144 例）與≥16 個月組（48例，冷凍時間最長為38.4個月）。

2.胚胎冷凍：根據(jù)Edwards評分方法［8］對第3天胚胎進(jìn)行評估，分裂胚形態(tài)學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)分為4級。Ⅰ級：卵裂球大小均等，透亮且無碎片；Ⅱ級：卵裂球大小不均，碎片＜10%；Ⅲ級：卵裂球大小不均，碎片在10%～50%之間；Ⅳ級：卵裂球大小不均，碎片＞50%。Ⅰ～Ⅲ級定義為優(yōu)質(zhì)胚胎，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍。冷凍前將冷凍試劑盒（JY公司，加拿大）置常溫預(yù)溫30 min。根據(jù)冷凍試劑盒說明書將胚胎移至冷凍試劑V1后，胚胎迅速皺縮，之后逐漸恢復(fù)，待胚胎膨脹至最飽滿時（約5min），將胚胎轉(zhuǎn)移至冷凍試劑V2，放置30s 后，將胚胎以最小液滴裝入載桿（JY 公司，加拿大）并浸沒于液氮1min。

3.胚胎復(fù)蘇：解凍前將解凍試劑盒（JY 公司，加拿大）置常溫預(yù)溫30min。根據(jù)解凍試劑盒說明將冷凍胚胎依次經(jīng)過試劑T1、T2、T3 清洗各2min、3min、3min，每次胚胎轉(zhuǎn)移均應(yīng)充分洗凈，轉(zhuǎn)入試劑T4后將培養(yǎng)皿放于37℃熱臺，3min后將胚胎轉(zhuǎn)移至G2培養(yǎng)液（Vitrolife，瑞典）中洗凈，最后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)G2 液。復(fù)蘇胚胎在37℃、6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后用于移植。

胚胎復(fù)蘇后無卵裂球融解為完整胚胎存活，1～2個卵裂球融解為基本完整胚胎存活，一半以上卵裂球融解定義為胚胎死亡；胚胎存在率＝解凍后胚胎存在數(shù)／胚胎冷凍數(shù)；復(fù)蘇存活率＝復(fù)蘇存活胚胎數(shù)／解凍后胚胎存在數(shù)；完整胚胎存活率＝完整胚胎數(shù)／解凍后胚胎存在數(shù)；基本完整胚胎率＝基本完整胚胎數(shù)／解凍后胚胎存在數(shù)。

4.移植前內(nèi)膜準(zhǔn)備：（1）自然周期，適用月經(jīng)周期正常、排卵規(guī)律并且內(nèi)膜形態(tài)較好患者。月經(jīng)周期9～10d陰道B超監(jiān)測卵泡大小與子宮內(nèi)膜發(fā)育情況，同時監(jiān)測血E2、LH 及孕酮（P）值，排卵后3～4d且內(nèi)膜厚度≥8mm 進(jìn)行復(fù)蘇胚胎移植。（2）人工周期，適用月經(jīng)周期不正常、排卵不規(guī)律等患者。月經(jīng)周期第3 天口服雌激素（補(bǔ)佳樂，拜耳，德國）6mg／d連續(xù)服用7d，8mg／d連續(xù)服用7d，14d時B超監(jiān)測內(nèi)膜厚度與形態(tài)，并檢測E2水平。當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8mm 時，E2＞750pmol／L時，肌肉注射黃體酮（60mg／d，浙江仙琚）進(jìn)行黃體支持，第3天復(fù)蘇胚胎并移植。

5.胚胎移植與妊娠檢測：移植前將胚胎轉(zhuǎn)移至移植膠（Vitrolife，瑞典）中，三段法將胚胎移至移植管（COOK，美國）中段，腹部B超監(jiān)測下將胚胎置于距宮底1～1.5cm 處。移植后14d檢測HCG 確定妊娠情況，HCG 陽性為生化妊娠，生化妊娠患者于胚胎移植4 周后進(jìn)行B 超檢查，有孕囊者為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料

3組患者冷凍時間分別為1～＜9個月、9～＜16個月與≥16個月，女方平均年齡分別為（30.20±3.95）歲、（30.24±4.29）歲與（30.94±3.78）歲，3組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；IVF比例分別為81.04%、80.56%與81.25%，授精方式無顯著性差異（P＞0.05）；3 組患者的平均解凍胚胎個數(shù)（玻璃化冷凍胚胎解凍數(shù)）和平均移植胚胎個數(shù)（玻璃化冷凍胚胎移植數(shù)）相比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

二、各組復(fù)蘇胚胎質(zhì)量比較

3組患者的胚胎存在率、基本完整胚胎率相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3組復(fù)蘇后存活率分別為98.22%、98.06%與96.33%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；≥16個月組完整胚胎存活率高達(dá)88.07%，但與其他兩組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

三、復(fù)蘇胚胎移植后妊娠結(jié)局比較

1～＜9 個月組移植749 例，其中生化妊娠466例（62.22%），臨 床 妊 娠440 例（58.74%）；9～＜16 個 月 組 移 植144 例，生 化 妊 娠78 例（54.17%），臨床妊娠71例（49.31%）；≥16個月組移植48 例，生 化 妊 娠26 例（54.17%），臨 床 妊 娠25例（52.08%）。3組間生化妊娠率與臨床妊娠率均無顯著性差異（P＞0.05）。3組種植率和異位妊娠率分別相比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 3組患者一般資料比較（±s）］

表1 3組患者一般資料比較（±s）］

組 別 周期數(shù) 女方年齡（歲） IVF比例（%）平均解凍胚胎個數(shù) 平均移植胚胎個數(shù)1～＜9個月749 30.20±3.95 81.04 2.17±0.58 1.97±0.16 9～＜16個月 144 30.24±4.29 80.56 2.16±0.59 1.97±0.18≥16個月48 30.94±3.78 81.25 2.29±0.46 1.96±0.29

表2 玻璃化冷凍保存不同時間復(fù)蘇胚胎質(zhì)量比較（%）

表3 玻璃化冷凍保存不同時間胚胎復(fù)蘇移植后妊娠結(jié)局比較（%）

討 論

胚胎冷凍技術(shù)在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用。胚胎冷凍技術(shù)不僅有助于預(yù)防卵巢過激反應(yīng)，為臨床選擇促排卵方案提供保障，也能夠提高患者累計臨床妊娠率。近年玻璃化凍融得到廣泛的應(yīng)用。1998年Mukaida等［9］成功使用玻璃化冷凍方法冷凍鼠胚與人胚。與程序化凍融相比，玻璃化凍融因操作簡單、費(fèi)用低、復(fù)蘇存活率高以及成功率較高等優(yōu)越性已逐漸取代程序化冷凍［10-11］。

玻璃化冷凍試劑采用滲透性冷凍保護(hù)劑，如DMSO 與乙二醇（EG），這些小分子物質(zhì)能夠快速穿過細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，降低細(xì)胞內(nèi)外液體之間滲透壓，減緩細(xì)胞內(nèi)水分滲出從而減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。高濃度DMSO 對細(xì)胞有一定的毒性，可能是由于DMSO 能夠與蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆性結(jié)合［12］。但是冷凍保存胚胎于-196℃液氮中對胚胎影響尚不可知，因此對玻璃化冷凍胚胎長期保存后胚胎質(zhì)量與解凍后妊娠結(jié)局進(jìn)行回顧性分析是必要的。

現(xiàn)在對于胚胎冷凍保存時間是否影響胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局觀點不一。1987 年Testart等［13］指出冷凍胚胎保存時間在1～2個月內(nèi)解凍移植有助于提高妊娠率，但認(rèn)為胚胎長時間保存于液氮中會降低胚胎存活率。而Riggs等［14］在2010年對11 768枚冷凍合子與胚胎回顧性分析發(fā)現(xiàn)，隨著冷凍時間的延長，無論是普通IVF 周期還是供卵周期，臨床妊娠率、流產(chǎn)率、胚胎種植率以及活產(chǎn)率均無顯著性差異，但是解凍后妊娠結(jié)局與取卵時患者年齡、解凍后胚胎存活率以及移植胚胎數(shù)均有關(guān)。2011年趙慶紅等［15］將胚胎保存時間分為3組，發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍胚胎保存時間對復(fù)蘇胚胎質(zhì)量與FET 結(jié)局沒有影響。2013年Aflatoonian等［16］根據(jù)玻璃化冷凍胚胎保存時間不同，將651枚胚胎分為5組，發(fā)現(xiàn)5組患者胚胎種植率與臨床妊娠率均無明顯差異，但認(rèn)為仍需對長期保存胚胎種植后出生嬰兒進(jìn)一步跟蹤研究。

2011年Dowling-Lacey等［17］報道冷凍保存時間長達(dá)20年的合子獲得新生兒1例。1990年34歲患者成功妊娠后捐獻(xiàn)了剩余5枚冷凍合子，20年后42歲受體患者因卵巢反應(yīng)低下接收捐贈：5枚合子解凍后存活2枚，培養(yǎng)至第2天移植到受者體內(nèi)并成功獲得一健康男嬰。這是目前人胚胎保存最長并獲得成功的案例。另外2011 年Lavara等［18］報道玻璃化冷凍保存兔胚，于液氮中保存15年后，存活率、種植率以及活產(chǎn)率均未降低。2013年Wirleitner等［19］對1 077枚解凍囊胚進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍囊胚6 年其解凍存活率與妊娠結(jié)局沒有降低，出生嬰兒畸形率也沒有顯著上升。上述研究表明冷凍保存不降低合子、分裂胚或者囊胚的質(zhì)量。Wong等［20］認(rèn)識到胚胎冷凍技術(shù)發(fā)展迅速，F(xiàn)ET 成功率與新鮮胚胎移植成功率接近，因而提出全胚胎冷凍策略，他認(rèn)為全胚胎冷凍可以完全避免卵巢過激反應(yīng)。

胚胎冷凍在ART 中具有重要的地位，因此有必要尋找影響玻璃化凍融胚胎質(zhì)量的因素。趙慶紅等［21］分析了323個玻璃化胚胎凍融周期，發(fā)現(xiàn)隨著患者年齡增加，妊娠率明顯降低?？赡芘c高齡婦女卵巢儲備功能降低、子宮內(nèi)膜容受性差有關(guān)。另外胚胎復(fù)蘇存活比例也是重要影響因素，解凍胚胎完全存活組種植率與臨床妊娠率均顯著高于非完全存活組。Cercas等［22］提出玻璃化冷凍胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)1d，有胚胎發(fā)育成桑椹胚或者囊胚的患者比仍處于分裂期胚胎患者妊娠率高。胚胎繼續(xù)發(fā)育潛能也是影響胚胎妊娠結(jié)局的重要因素。

由于玻璃化法冷凍采用高濃度的冷凍保護(hù)劑，這些冷凍劑對胚胎的毒性作用是否會對子代造成不良影響，目前尚無定論。有必要對胚胎冷凍安全性進(jìn)一步研究。Yao等［23］發(fā)現(xiàn)綿羊胚胎保存0.5 年后，胚胎解凍后綿羊活產(chǎn)率、后代死亡率以及出生時體重較冷凍保存7.5d者無統(tǒng)計學(xué)差異。

本文研究結(jié)果顯示胚胎玻璃化冷凍保存時間延長未降低胚胎復(fù)蘇存活率與完整胚胎率，同時，F(xiàn)ET周期生化妊娠率、臨床妊娠率以及胚胎種植率未隨胚胎保存時間延長而降低。提高解凍胚胎質(zhì)量與妊娠結(jié)局，不僅需要獲得優(yōu)質(zhì)胚胎，還要與患者溝通，盡早移植。玻璃化凍融胚胎移植技術(shù)不僅安全可靠，還能降低患者費(fèi)用，預(yù)防OHSS，提高累計臨床妊娠率，值得臨床上推廣應(yīng)用。

［1］ Trounson A， Mohr L. Human pregnancy following cryopreservation，thawing and transfer of an eight-cell embryo［J］.Nature，1983，305：707-709.

［2］ Zeilmaker GH，Alberda AT，van Gent I，et al.Two pregnancies following transfer of intact frozen-thawed embryos［J］.Fertil Steril，1984，42：293-296.

［3］ Trounson A.Preservation of human eggs and embryos［J］.Fertil Steril，1986，46：1-12.

［4］ Bergh C，Werner C，Nilsson L，et al.Cumulative birth rates following cryopreservation of all embryos in stimulated in vitro fertilization（IVF）cycles［J］.J Assist Reprod Genet，1995，12：191-194.

［5］ Rall WF，F(xiàn)ahy GM.Ice-free cryopreservation of mouse embryos at-196℃by vitrification［J］.Nature，1985，313：573-575.

［6］ Gordts S，Roziers P，Campo R，et al.Survival and pregnancy outcome after ultrarapid freezing of human embryos［J］.Fertil Steril，1990，53：469-472.

［7］ Kuleshova LL，Lopata A.Vitrification can be more favorable than slow cooling［J］.Fertil Steril，2002，78：449-454.

［8］ Steer CV，Mills CL，Tan SL，et al.The cumulative embryo score：a predictive embryo scoring technique to select the optimal number of embryos to transfer in an in-vitro fertilization and embryo transfer programme［J］. Hum Reprod，1992，7：117-119.

［9］ Mukaida T，Wada S，Takahashi K，et al.Vitrification of human embryos based on the assessment of suitable conditions for 8-cell mouse embryos［J］.Hum Reprod，1998，13：2874-2879.

［10］ Rezazadeh Valojerdi M，Eftekhari-Yazdi P，Karimian L，et al.Vitrification versus slow freezing gives excellent survival，post warming embryo morphology and pregnancy outcomes for human cleaved embryos［J］.J Assist Reprod Genet，2009，26：347-354.

［11］ Liebermann J，Nawroth F，Isachenko V，et al.Potential importance of vitrification in reproductive medicine［J］.Biol Reprod，2002，67：1671-1680.

［12］ 黃國寧 主編.輔助生殖實驗室技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：182.

［13］ Testart J，Lassalle B，F(xiàn)orman R，et al.Factors influencing the success rate of human embryo freezing in an in vitro fertilization and embryo transfer program［J］.Fertil Steril，1987，48：107-112.

［14］ Riggs R，Mayer J，Dowling-Lacey D，et al.Does storage time infiuence postthaw survival and pregnancy outcome？An analysis of 11，768cryopreserved human embryos［J］.Fertil Steril，2010，93：109-115.

［15］ 趙慶紅，楊菁，尹太郎，等.玻璃化凍融胚胎保存時間對胚胎復(fù)蘇結(jié)局的影響［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2011，20：257-260.

［16］ Aflatoonian N，Pourmasumi S，Aflatoonian A，et al.Duration of storage does not influence pregnancy outcome in cryopreserved human embryos［J］.Iran J Reprod Med，2013，11：843-846.

［17］ Dowling-Lacey D，Mayer JF，Jones E，et al.Live birth from a frozen-thawed pronuclear stage embryo almost 20years after its cryopreservation［J］.Fertil Steril，2011，95：1120.e1-e3.

［18］ Lavara R，Baselga M，Vicente JS.Does storage time in LN2 infiuence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos？［J］.Theriogenology，2011，76：652-657.

［19］ Wirleitner B，Vanderzwalmen P，Bach M，et.al.The time aspect in storing vitrified blastocysts：its impact on survival rate，implantation potential and babies born［J］. Hum Reprod，2013，28：2950-2957.

［20］ Wong KM，Mastenbroek S，Repping S.Cryopreservation of human embryos and its contribution to in vitro fertilization success rates［J］.Fertil Steril，2014，102：19-26.

［21］ 趙慶紅，楊菁，尹太郎，等.玻璃化凍融胚胎移植323個周期臨床分析［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2010，19：486-489.

［22］ Cercas R，Villas C，Pons I，et al.Vitrification can modify embryo cleavage stage after warming.Should we change endometrial preparation？［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29：1363-1368.

［23］ Yao YC，Qi MY，Lu MH，et al.Long-term cryopreservation had no adverse effect on viability of embryos and their offspring in sheep［J］.Anim Reprod Sci，2012，136：42-46.