Y 染色體AZFc區(qū)完全缺失患者ICSI治療妊娠結(jié)局分析

李明昭，趙小利，任文娟，師娟子

（西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心，西安 710003）

不育影響著大約10%～15%的育齡夫婦，其中由男性因素導(dǎo)致者約占50%，而男性因素中Y 染色體微缺失是一個(gè)重要的致病因素［1］。Y 染色體微缺失被認(rèn)為是男性特發(fā)性不育最重要的遺傳學(xué)病因，這種微小缺失可以造成不同程度的生精障礙，如無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥等［2］。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的Y 染色體微缺失主要發(fā)生于AZFc區(qū)，約占各類缺失的60%［3］。AZFc區(qū)缺失者表型多樣，從輕度少精子癥到無(wú)精子癥等，約2／3的患者表現(xiàn)為無(wú)精子癥，其中約50%的患者經(jīng)睪丸穿刺可獲得精子，余下1／3的患者多表現(xiàn)為少精子癥。因此，理論上AZFc區(qū)缺失可以通過(guò)卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）技術(shù)獲得自己的后代。但是關(guān)于Y 染色體AZFc區(qū)缺失是否影響患者ICSI助孕治療的妊娠結(jié)局，目前報(bào)道較少，且研究結(jié)果存在爭(zhēng)議［4］。本研究對(duì)我中心確診的AZFc區(qū)完全缺失患者的精子獲得率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析其中行ICSI鮮胚移植的患者（研究組）和同期行ICSI治療、無(wú)AZFc區(qū)缺失的無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者（對(duì)照組）的臨床資料，比較兩組患者的妊娠結(jié)局。

一、資料與方法

1.研究對(duì)象：收集2013年6月至2014年8月在我中心確診的79例Y 染色體AZFc區(qū)完全缺失的患者資料。其中行ICSI治療鮮胚移植的27例患者為研究組，均為嚴(yán)重少精子或無(wú)精子癥患者；另外，選擇同期在我中心行ICSI治療、無(wú)Y 染色體微缺失的嚴(yán)重少精子癥和無(wú)精子癥患者58例為對(duì)照組。我中心診斷為嚴(yán)重少精子癥或無(wú)精子癥的患者均行Y 染色體微缺失檢測(cè)。

研究組患者年齡25～42 歲，對(duì)照組患者年齡27～46 歲，均為婚后夫妻生活正常、未采取避孕措施1年以上未育者。排除梗阻性無(wú)精子癥及合并其他全身性疾病或嚴(yán)重感染的患者。女方不育因素主要包括：輸卵管因素、子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔粘連等。

2.診療回顧：（1）取精：AZFc區(qū)完全缺失患者獲取精液的方式包括手淫射精、睪丸穿刺和顯微手術(shù)取精。一般AZFc區(qū)完全缺失患者進(jìn)行不育治療前先通過(guò)手淫方式留取新鮮精液，行精液常規(guī)檢測(cè)，確認(rèn)精液質(zhì)量是否符合ICSI標(biāo)準(zhǔn)［精液常規(guī)處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)低于（0.3～2）×106／ml］。如取卵當(dāng)日男方精液處理后符合ICSI標(biāo)準(zhǔn)，則行ICSI治療；如精液標(biāo)本不符合ICSI標(biāo)準(zhǔn)，則行睪丸穿刺取精進(jìn)一步確定是否符合ICSI標(biāo)準(zhǔn)；部分睪丸穿刺后仍不符合ICSI標(biāo)準(zhǔn)的患者，遵循患者意愿嘗試顯微手術(shù)取精。本研究中研究組27例患者和對(duì)照組58例患者的精液均來(lái)自手淫射精。（2）精液分析：按照世界衛(wèi)生組織（WHO）精液評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)3次精液分析并經(jīng)離心沉淀均無(wú)精子者視為無(wú)精子癥，精子濃度＜5×106／ml者視為嚴(yán)重少精子癥［5］。（3）AZF檢測(cè)：使用深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供的Y 染色體微缺失檢測(cè)試劑盒，通過(guò)多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，檢測(cè)Y 染色體AZFc區(qū)SY254、SY255、SY242、SY239 的表達(dá)情況，內(nèi)控對(duì)照為雄性性別決定基因（SRY），每次檢測(cè)均以已育健康男性基因組DNA 作為陽(yáng)性對(duì)照。PCR 反應(yīng)體系及操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性6min，95℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V 電壓下電泳90min，使用凝膠成像系統(tǒng)（上海天能）觀察并照相，分析條帶結(jié)果。SY254、SY255、SY242、SY239表達(dá)均為陽(yáng)性，則判定為AZFc區(qū)完全缺失。（3）控制性促排卵（COH）：所有患者的女性配偶從黃體中期開(kāi)始給予短效曲普瑞林（博福-益普生，法國(guó)）降調(diào)節(jié)，0.1mg／d，14d后，測(cè)定血清雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）及黃體生成素（LH）水平，當(dāng)達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)（FSH＜5 U／L，LH＜5 U／L，E2＜110pmol／L）后，使用促性腺激素（Gn）促排卵，當(dāng)3個(gè)以上卵泡直徑≥18mm 時(shí)，注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，珠海麗珠）5 000～10 000U 誘導(dǎo)排卵，注射后36h左右取卵。（4）ICSI：精液處理采用密度梯度離心法，卵母細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)液充分洗滌后置受精液G-IVF（Vitrolife，瑞典）中預(yù)培養(yǎng)3h，用透明質(zhì)酸酶消化顆粒細(xì)胞，將去除顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞置G-IVF 培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)0.5h。在400倍放大倍數(shù)下挑選形態(tài)相對(duì)正常的精子，常規(guī)精子制動(dòng)后行ICSI。（5）胚胎移植及妊娠判斷：按照Peter卵裂期胚胎評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估第3天（D3）胚胎質(zhì)量，Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)胚胎視為可用胚胎，Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)胚胎視為優(yōu)質(zhì)胚胎［6-7］。胚胎移植后2 周尿HCG 檢測(cè)陽(yáng)性者為生化妊娠，移植后5周B 超檢查可見(jiàn)孕囊及胎心搏動(dòng)者為臨床妊娠。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

二、結(jié)果

1.Y 染色體AZFc區(qū)完全缺失患者的精子獲得情況：79例AZFc區(qū)完全缺失患者中，38例患者取到精子，精子獲得率為48.10%，其中手淫射精33例，占86.84%；睪丸穿刺2 例，占5.27%；顯微手術(shù)取精3例，占7.89%。

2.兩組患者一般情況比較：兩組患者平均年齡、女性配偶年齡、不育年限、精液濃度、基礎(chǔ)FSH值、基礎(chǔ)E2值、促排卵周期獲卵數(shù)、注射MⅡ卵數(shù)、移植日子宮內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

3.兩組妊娠結(jié)局比較：兩組受精率（65.05%vs.70.07%）、卵裂率（97.34%vs.96.02%）、優(yōu)胚率（44.81% vs.40.88%）、可 用 胚 胎 率（79.23%vs.78.45%）、種植率（39.13%vs.43.27%）、臨床妊娠率（51.85%vs.58.62%）、流產(chǎn)率（7.14%vs.5.88%）及異位妊娠率（0%vs.2.94%）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表1 兩組患者一般情況比較（±s）

表1 兩組患者一般情況比較（±s）

組 別 周期數(shù) 男方年齡（歲） 女方年齡（歲） 不育年限（年） 精液濃度（106／ml） 基礎(chǔ)FSH（U／L）研究組 27 31.26±4.02 28.77±3.55 3.74±2.52 3.81±1.45 6.44±1.65對(duì)照組 58 30.81±3.76 28.12±3.81 3.66±2.68 4.66±2.31 6.75±1.83組 別 周期數(shù) 基礎(chǔ)E2（pmol／L） 獲卵數(shù)（個(gè)） 注射MⅡ卵數(shù)（個(gè)） 內(nèi)膜厚度（mm） 移植胚胎數(shù)（枚）研究組 27 145.74±68.17 13.22±4.52 10.56±5.78 11.28±2.41 1.81±0.42對(duì)照組 58 137.98±63.14 12.41±4.92 9.62±4.39 11.71±2.08 1.83±0.50

表2 兩組患者妊娠結(jié)局比較［n（%）］

三、討論

近年來(lái)，眾多研究表明男性不育的遺傳學(xué)病因主要包括基因突變、染色體畸變、單核苷酸多態(tài)性及Y 染色體微缺失，其中Y 染色體微缺失較為常見(jiàn)［8］，有研究表明中國(guó)男性不育患者中Y 染色體缺失率約為10.8%，其中無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者中缺失率分別為11.75%和8.51%［3］。Y 染色體長(zhǎng)臂的AZF區(qū)是微缺失的高發(fā)區(qū)域，該區(qū)域的基因微缺失可引起不同程度的精子發(fā)生障礙，繼而導(dǎo)致男性不育。AZF區(qū)域存在4個(gè)亞區(qū)，分別為AZFa、AZFb、AZFc和AZFd，不同區(qū)域的缺失所導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)也各不相同：AZFa區(qū)微缺失，臨床表現(xiàn)一般為無(wú)精子癥，伴隨睪丸體積稍小；AZFb區(qū)微缺失，生精過(guò)程阻滯在精母細(xì)胞階段，亦無(wú)精子生成；AZFc區(qū)微缺失，表現(xiàn)為偶見(jiàn)少量的活動(dòng)精子，其中精子畸形數(shù)量明顯增多；AZFd區(qū)微缺失，表現(xiàn)為輕度少精子癥或精子數(shù)量正常，但形態(tài)異常［9-10］。

國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道的Y 染色體微缺失主要發(fā)生在AZFc區(qū)，約占總?cè)笔У?0%［11］。我們先前的研究對(duì)616名無(wú)精子癥和重度少精子癥患者進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)，其中AZFc 區(qū)缺失率為60.9%［12］，和 文 獻(xiàn)［11］報(bào) 道 基 本 一 致。隨 著 精 子 獲取技術(shù)和ICSI技術(shù)的發(fā)展，一部分AZFc區(qū)完全缺失的患者可以獲得精子并通過(guò)ICSI技術(shù)使女性配偶受孕成功，Choi等［13］在研究中對(duì)21 名AZFc區(qū)完全缺失的無(wú)精子癥患者進(jìn)行睪丸穿刺，其中8名患者獲得了滿足ICSI操作質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的精子，精子獲得率為38%。本研究中我們對(duì)79名AZFc區(qū)完全缺失的患者進(jìn)行取精，其中38名患者獲得精子，獲得率（48.1%）高于Choi等的研究，且大部分患者是手淫射精，這可能與該79名患者中無(wú)精子癥患者所占比率較少有關(guān)系，該79例患者大部分為嚴(yán)重少精子癥。Liu等［4］比較了AZFc區(qū)完全缺失和無(wú)Y 染色體缺失患者的ICSI結(jié)局，發(fā)現(xiàn)AZFc區(qū)完全缺失會(huì)降低受精率，但不影響妊娠率。吳畏等［14］選取Y染色體微缺失的患者48例56個(gè)周期和同期治療的未發(fā)現(xiàn)Y 染色體微缺失的嚴(yán)重少弱精子或無(wú)精子癥患者90 例94個(gè)周期，兩組妊娠率分別為37.5%和35.1%，差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究比較了AZFc區(qū)完全缺失患者和無(wú)Y染色體微缺失的無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者的受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、可用胚胎率、種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率及異位妊娠率等，結(jié)果表明兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Y 染色體AZFc區(qū)完全缺失可能并不影響ICSI的妊娠結(jié)局。已有研究表明AZFc區(qū)缺失會(huì)遺傳給男性后代，但女性后代不孕的風(fēng)險(xiǎn)通常不會(huì)增加，患者可以選擇進(jìn)行種植前遺傳學(xué)診斷（PGD），選擇女胚進(jìn)行移植［15］。由于Y 染色體AZFc區(qū)完全缺失行ICSI治療的病例資料仍然有限，分析結(jié)果可能存在一定的片面性，因此之后的研究應(yīng)進(jìn)一步積累資料，擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入探討。

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