影響D3非優(yōu)質(zhì)胚胎的囊胚培養(yǎng)結(jié)局的相關(guān)因素分析

尹太郎，丁錦麗，李潔，閆文杰，吳庚香，李風(fēng)和，謝青貞，龍文，徐望明，楊菁

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060）

隨著胚胎培養(yǎng)技術(shù)的成熟，囊胚培養(yǎng)及囊胚移植已成為部分生殖中心的常規(guī)應(yīng)用技術(shù)之一。囊胚培養(yǎng)能夠有效地在體外淘汰部分染色體異常、發(fā)育潛能差的胚胎。因此，囊胚培養(yǎng)不僅提高胚胎種植率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率，還能減少胚胎移植數(shù)，從而減少多胎妊娠及后續(xù)的減胎手術(shù)帶來的風(fēng)險［1-2］。對于如何處理卵裂期胚胎形態(tài)學(xué)評估為非優(yōu)質(zhì)的胚胎，臨床上尚無定論，多數(shù)學(xué)者建議行囊胚培養(yǎng)進(jìn)行篩選［3］。盡管非優(yōu)質(zhì)胚胎的囊胚形成率較優(yōu)質(zhì)胚胎低，但體外培養(yǎng)時間的延長為非優(yōu)質(zhì)胚胎的自我選擇提供了機(jī)會［4］。有學(xué)者建議將這些非優(yōu)質(zhì)胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，用于建立人類干細(xì)胞［5-6］，但盲目的培養(yǎng)會占用培養(yǎng)箱資源，也增加了實驗室工作人員的工作量［7］。因此，探索影響囊胚形成的相關(guān)因素以便更好地選擇性培養(yǎng)囊胚也就具有重要意義。影響卵裂期胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)結(jié)局的因素是多方面的。本研究擬通過回顧性分析行囊胚培養(yǎng)無囊胚形成患者的臨床資料，探討卵裂期非優(yōu)質(zhì)胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)但無囊胚形成的相關(guān)因素，為臨床提供參考。

資料與方法

一、研究對象

收集2011年1月至2013年12月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖中心行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）助孕且行囊胚培養(yǎng)的443個周期的患者資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）在IVF-ET 治療中移植新鮮優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎；（2）剩余優(yōu)質(zhì)胚胎凍存，非優(yōu)質(zhì)胚胎行囊胚培養(yǎng)。

根據(jù)非優(yōu)質(zhì)胚胎行囊胚培養(yǎng)后有／無囊胚形成分為觀察組和對照組。患者年齡20～44歲，不孕時間1～18年。

二、治療方法回顧

1.促排卵、受精及胚胎移植：根據(jù)患者具體情況決定使用短方案、長方案、超長方案促排，具體用藥參考我中心常規(guī)方案［8］。陰道超聲檢查發(fā)現(xiàn)直徑≥18mm 的卵泡數(shù)≥3個時，予以5 000～10 000U劑量的人絨毛膜促性腺激素（HCG，雪蘭諾，瑞士），36～37h后在陰道超聲引導(dǎo)下采卵。根據(jù)男方精子質(zhì)量決定自然受精（IVF）、卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）受精、half-ICSI受精，再根據(jù)IVF 受精情況決定是否行早期補(bǔ)救ICSI。

2.胚胎移植：采卵后第2～3天行胚胎移植，移植過程在腹部B 超監(jiān)測下完成，根據(jù)患者年齡、內(nèi)膜準(zhǔn)備情況等決定移植胚胎數(shù)，一般為2～3枚。移植后根據(jù)患者雌激素水平及獲卵數(shù)選擇黃體支持治療方案，具體參考我中心常規(guī)黃體支持方案［8］。

3.囊胚培養(yǎng)：將移植后剩余的優(yōu)質(zhì)胚胎凍存，非優(yōu)質(zhì)胚胎于Quinns AdvantageTM（SAGE，美國）進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。

4.胚胎質(zhì)量評估：根據(jù)胚胎形態(tài)學(xué)對卵裂期胚胎進(jìn)行分級：包含6個以上均勻一致的卵裂球且細(xì)胞碎片小于20%的胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎［9］，其余為非優(yōu)質(zhì)胚胎。非優(yōu)質(zhì)胚胎行囊胚序貫培養(yǎng)至D5／D6時觀察是否有囊胚形成，按Gardner等［10］分級方法對形成的囊胚進(jìn)行評估。

三、分析指標(biāo)

本項研究收集并分析了患者的年齡、不孕年限、體重指數(shù)（BMI）、基礎(chǔ)FSH 水平、不孕原因及不孕類型、HCG 日雌二醇（E2）水平、用于囊胚培養(yǎng)的非優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)及形成的囊胚數(shù)等資料。

判斷標(biāo)準(zhǔn)及計算方法：優(yōu)質(zhì)胚胎率定義為優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)／總胚胎數(shù)；囊胚形成率為形成的囊胚數(shù)／用于囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料結(jié)果以（±s）表示，計數(shù)資料以率（%）表示。定量資料比較采用t檢驗，定性資料比較采用χ2檢驗。描述各分析指標(biāo)與囊胚培養(yǎng)結(jié)局的關(guān)系用非條件Logistic回歸分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、單因素分析

1.患者基礎(chǔ)資料：本項研究共納入443個研究對象，其中囊胚培養(yǎng)后有囊胚形成的周期（對照組）326例，無囊胚形成周期（觀察組）117例。

兩組間的女方年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH水平、不孕原因（男女雙方因素組成情況及不明原因）、男方精液來源等指標(biāo)無顯著差異（P＞0.05），組間 原 發(fā)／繼 發(fā) 不 孕 有 顯 著 差 異［（64.96% vs.45.09%）／（35.04% vs.54.91%），P ＜0.01］（表1）。

2.兩組患者的臨床數(shù)據(jù)比較：組間的促性腺激素（Gn）總天數(shù)、Gn總量、HCG 日E2水平及獲卵數(shù)無顯著差異（P＞0.05）（表2）。

3.兩組患者的實驗室數(shù)據(jù)比較：對照組的IVF受精周期比例顯著高于觀察組（66.56% vs.47.01%）（P＜0.01），而ICSI受精周期比例及早期補(bǔ)救ICSI周期比例顯著低于觀察組（27.61%vs.41.03%，4.91%vs.11.11%）（P＜0.05）。組間受精率、卵裂率、IVF異常受精率、早期補(bǔ)救ICSI周期異常受精率、half-ICSI周期異常受精率無顯著差異（P＞0.05），觀察組的ICSI周期異常受精率顯著高于對照組（P＜0.05）（表3）。

4.不同受精方式患者的臨床資料比較：鑒于對照組與觀察組組間的受精方式存在差異，我們將研究對象按照不同的受精方式分組，比較其囊胚培養(yǎng)的結(jié)局。研究納入的443個周期中，IVF 受精272個周期，ICSI受精138個周期，IVF＋早期補(bǔ)救ICSI受精29個周期，half-ICSI受精4個周期。由于IVF＋早期補(bǔ)救ICSI及half-ICSI受精所占比例較少（表3），故只納入IVF／ICSI受精周期進(jìn)行比較。

組間患者年齡、不孕時間及行囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。IVF 組形成的囊胚數(shù)及囊胚形成率均顯著高于ICSI組（P＜0.01）（表4）。

5.不同年齡組別患者的培養(yǎng)結(jié)局比較：將研究對象按照年齡進(jìn)一步分組：≤30歲（A 組），＞30歲且≤35歲（B 組），＞35 歲（C 組）。組間基礎(chǔ)FSH水平、BMI、受精方式、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)及囊胚培養(yǎng)數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）；A 組的不孕時間顯著低于B組、C 組，B 組不孕時間也顯著低于C 組（P＜0.01）；A 組形成的囊胚數(shù)及囊胚形成率顯著高于B組及C組（P＜0.01），但B 組與C 組組間無顯著差異（P＞0.05）（表5）。

二、Logistic分析

將上述單因素分析中有差異的因素，即原發(fā)／繼發(fā)不孕、受精方式、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)作Logistic分析，用forward LR 方法，結(jié)果提示不孕類型、受精方式及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)與囊胚形成顯著相關(guān)（P＜0.05）（表6）。

表1 兩組患者基本資料［（±s），n（%）］

表1 兩組患者基本資料［（±s），n（%）］

注：與對照組相比，＊P＜0.01

組 別 周期數(shù) 年齡（歲） 不孕時間（年） BMI（kg／m2） 基礎(chǔ)FSH（U／L）原發(fā)不孕 繼發(fā)不孕觀察組 117 30.38±4.23 4.84±3.23 20.93±2.28 6.91±1.80 76（64.96）＊ 41（35.04）＊對照組 326 30.35±4.27 4.67±3.22 21.45±2.71 6.99±2.18 147（45.09） 179（54.91）組 別 周期數(shù)女性因素 男性因素盆腔及輸卵管因素子宮內(nèi)膜異位癥 排卵異常 無精子癥 少精子癥 嚴(yán)重少弱精子癥觀察組 117 85（72.65） 8（6.84） 10（8.55） 9（7.69） 36（44.44） 3（2.56）對照組 326 256（78.53） 25（7.67） 27（8.28） 11（3.49） 79（24.23） 15（4.60）精液來源組 別 周期數(shù) 不明原因精液 睪丸穿刺 供精觀察組 117 2（1.71） 104（88.89） 6（5.13） 7（5.98）對照組 326 5（1.53） 310（95.09） 9（2.76） 7（2.15）

表2 兩組患者的臨床數(shù)據(jù)比較（±s）

表2 兩組患者的臨床數(shù)據(jù)比較（±s）

組 別 周期數(shù) Gn天數(shù)（d） Gn總數(shù)（支） E2（pmol／L）117 11.02±1.51 31.45±10.14 3 992.95±1 957.29對照組觀察組326 11.13±1.97 30.59±10.77 4 362.95±1 763.31

表3 兩組患者的實驗室數(shù)據(jù)比較［（±s），n（%）］

表3 兩組患者的實驗室數(shù)據(jù)比較［（±s），n（%）］

注：與對照組相比，＊P＜0.01，＃P＜0.05

組別 周期數(shù)受精方式IVF ICSI IVF＋早期補(bǔ)救ICSI half-ICSI觀察組 117 55（47.01）＊ 48（41.03）＃ 13（11.11）＃ 1（0.85）對照組 326 217（66.56） 90（27.61） 16（4.91） 3（0.92）總體受精率組 別 周期數(shù)IVF＋早期補(bǔ)救ICSI half-ICSI IVF ICSI IVF ICSI觀察組 117 576（73.00） 14（7.37） 84（84.00） 548（83.92） 5（55.56） 8（100.00）IVF ICSI對照組 326 2 402（74.88） 29（11.03） 137（82.53） 1 052（82.97） 12（54.55） 26（92.86）異常受精組 別 周期數(shù)IVF＋早期補(bǔ)救ICSI half-ICSI IVF ICSI IVF ICSI觀察組 117 92（15.97） 2（6.90） 8（5.84） 47（8.58）＊ 1（20.00） 0（0.00）IVF ICSI對照組 326 433（18.03） 4（28.57） 5（5.95） 60（5.70） 3（35.00） 3（11.54）組 別 周期數(shù) 優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（枚） 優(yōu)質(zhì)胚胎率 囊胚培養(yǎng)數(shù)（枚）觀察組 117 3.58±2.52＊ 414（32.27）＃8.62±3.01對照組 326 4.25±2.50 1 381（35.33）8.81±3.03

表4 不同受精方式患者的臨床資料比較［（±s），n（%）］

表4 不同受精方式患者的臨床資料比較［（±s），n（%）］

注：與ICSI組相比，＊P＜0.01

組 別 周期數(shù) 年齡（歲） 不孕時間（年） 囊胚培養(yǎng)數(shù)（枚） 形成囊胚數(shù)（枚）囊胚形成率IVF組 272 30.54±4.31 4.60±3.18 8.81±3.17 1.93±1.69＊ 524（21.87）＊ICSI組 138 29.98±4.20 4.74±3.12 8.84±2.83 1.31±1.30 179（14.67）

表5 不同年齡患者的臨床資料比較［（±s），n（%）］

表5 不同年齡患者的臨床資料比較［（±s），n（%）］

注：與A 組相比，＊P＜0.01；與C組相比，＃P＜0.01

組 別 周期數(shù) 不孕時間（年） 獲卵數(shù)（枚） 基礎(chǔ)FSH（U／L） BMI（kg／m2） IVF 受精A 組 240 3.46±1.97 15.32±4.45 6.84±2.17 21.24±2.54 149（62.08）B組 144 5.83±3.13＊＃ 15.26±5.09 7.03±1.94 21.42±2.65 84（58.33）C組 59 7.10±4.84＊ 14.44±5.35 7.30±2.06 21.37±2.82 39（66.10）組 別 周期數(shù) ICSI受精 優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（枚） 囊胚培養(yǎng)數(shù)（枚） 形成囊胚數(shù)（枚）囊胚形成率A 組 240 76（31.67） 4.08±2.52 8.98±3.18 1.92±1.68 460（21.36）B組 144 46（31.94） 4.12±2.63 8.54±2.78 1.47±1.17＊ 212（17.24）＊C組 59 16（27.12） 3.92±2.29 8.42±2.90 1.20±1.14＊ 72（14.49）＊

表6 囊胚培養(yǎng)多因素Logistic回歸分析結(jié)果

討 論

囊胚移植有較好的臨床結(jié)局［11］，但并非適用于所有患者。約70%的患者在IVF-ET 過程中獲得非優(yōu)質(zhì)胚胎［12］，此類胚胎雖發(fā)育潛能較低，再利用的可能性不大，但已有研究證實非優(yōu)質(zhì)胚胎經(jīng)體外培養(yǎng)后可能發(fā)育成囊胚［13-14］，且國內(nèi)學(xué)者也多主張將非優(yōu)質(zhì)胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)［3］，以期為患者后續(xù)凍胚移植提供機(jī)會。

影響囊胚形成的因素有很多，包括患者年齡、獲卵數(shù)、精子質(zhì)量、受精方式、受精數(shù)、胚胎質(zhì)量等［15-18］。但是關(guān)于非優(yōu)質(zhì)胚胎囊胚培養(yǎng)后影響囊胚形成的研究較少。本研究納入2011年至2013年于我中心行卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎移植，將剩余非優(yōu)質(zhì)胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)的患者作為研究對象，并按是否有囊胚形成將研究對象分為無囊胚形成組及對照組，分析兩組間患者基礎(chǔ)資料，以期分析影響非優(yōu)質(zhì)胚胎囊胚后無囊胚形成的可能因素。我們的研究結(jié)果表明：不孕類型、受精方式、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)與囊胚培養(yǎng)的結(jié)局密切相關(guān)。

一、年齡的影響

有研究表明，年齡是影響囊胚形成的因素之一［15］。莫美蘭等［18］將745例非優(yōu)質(zhì)胚胎行囊胚培養(yǎng)的患者按年齡分為≤30歲、＞30且≤35歲、＞35歲三組，囊胚培養(yǎng)的結(jié)果表明，＞35歲組的囊胚形成率顯著低于其他兩組，分析可能的原因是年齡較大患者的胚胎染色體異常幾率較高［19］。另外，女性年齡的增加可能對囊胚擴(kuò)張、孵化程度及滋養(yǎng)外胚層質(zhì)量有不利影響［20］。在本項研究中，表1結(jié)果示無囊胚形成組與對照組組間女方年齡沒有顯著差異，因此我們進(jìn)一步將患者按照≤30 歲、＞30 且≤35歲、＞35歲分為三組，結(jié)果顯示≤30歲患者D3非優(yōu)質(zhì)胚胎囊胚培養(yǎng)后形成囊胚的數(shù)量及囊胚形成率均顯著高于其余兩組，但Logistic分析的結(jié)果顯示囊胚培養(yǎng)結(jié)果與患者年齡無顯著相關(guān)，這與其他學(xué)者研究結(jié)論不同，原因可能在于本研究納入的例數(shù)較少。

二、受精方式的影響

不同的受精方式可影響囊胚的形成率［16］。我們的研究初步結(jié)果表明，觀察組ICSI受精的比例顯著大于對照組，于是我們進(jìn)一步將研究對象按照受精方式進(jìn)行分組，結(jié)果表明，IVF組形成的囊胚數(shù)及囊胚形成率均顯著高于ICSI組，與國內(nèi)外研究結(jié)果一致［16，21-22］，且Logistic分析結(jié)果也表明受精方式與囊胚培養(yǎng)結(jié)局顯著相關(guān)。分析可能的原因是行ICSI受精的患者，其精子一般為睪丸／附睪穿刺精子或重度少弱畸精子，這些精子本身的質(zhì)量問題可能影響了囊胚的形成［16］。有研究報道，嚴(yán)重畸形精子癥會降低受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及卵裂率［23］，而這些畸形精子的內(nèi)部DNA 微缺失、超微結(jié)構(gòu)異常等可能影響功能缺陷，從而影響ICSI受精的卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，降低受精率、優(yōu)胚率及卵裂率。另外，ICSI技術(shù)可能將不具受精能力的精子注射入卵母細(xì)胞，而這個過程可能將異物帶入細(xì)胞質(zhì)，從而可能影響卵母細(xì)胞及胚胎的基因印記的建立和維持［24］。

三、不孕類型的影響

趙仁峰等［25］的調(diào)查結(jié)果表明，我國原發(fā)不孕女性主要包括輸卵管因素、多囊卵巢綜合征（PCOS）、免疫因素、子宮畸形及卵巢早衰等患者，前3位因素為輸卵管因素、PCOS、免疫及不明原因不孕，所占比 例 分 別 為27.79%、19.59%和10.48%。王 縣等［26］的調(diào)查結(jié)果顯示，我國繼發(fā)不孕女性主要包括生殖道感染、免疫因素、卵巢腫瘤、子宮肌瘤等患者，其中前3位為生殖道感染、性激素異常及免疫因素等 患 者，所 占 比 例 分 別 為62.51%、20.4% 和18.37%。在本項研究中，無囊胚形成組原發(fā)不孕的比例顯著高于對照組，繼發(fā)不孕比例低于對照組，Logistic分析結(jié)果也表明不孕類型與囊胚培養(yǎng)結(jié)局顯著相關(guān)。原發(fā)不孕的患者可能更多地行ICSI或補(bǔ)打ICSI受精，這就解釋了為什么無囊胚形成組原發(fā)不孕的患者較對照組高。

四、胚胎質(zhì)量的影響

胚胎質(zhì)量與囊胚形成情況密切相關(guān)。卵裂速度較快的胚胎更容易形成優(yōu)質(zhì)囊胚［4］，D3非優(yōu)質(zhì)胚胎中5B 胚胎較4B 胚胎繼續(xù)培養(yǎng)后更容易形成囊胚［14］，D3卵裂球數(shù)目≥7的優(yōu)質(zhì)胚胎更容易發(fā)育為優(yōu)質(zhì)囊胚［27］。有研究發(fā)現(xiàn)，囊胚染色體異常的風(fēng)險隨著胚胎碎片率的增加而增加，當(dāng)碎片率＞25%時，染色體異常率可達(dá)到100%［28］。胚胎碎片的增多會降低囊胚形成率。有研究表明，胚胎碎片＞15%會降低其囊胚形成率，碎片＞25%的胚胎很少發(fā)育到囊胚階段［29］，碎片可能會干擾細(xì)胞之間的連接，從而影響細(xì)胞的融合、囊胚腔以及囊胚的形成［17］，另外，碎片釋放的有毒物質(zhì)可能會使鄰近的細(xì)胞凋亡，且還會減少細(xì)胞質(zhì)的體積，使胚胎發(fā)育所需要的細(xì)胞器耗竭，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)或卵裂球的損失［17，30］。本項研究結(jié)果表明，無囊胚形成組的姐妹胚胎中優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)顯著低于對照組，且Logistic分析結(jié)果也表明D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)與非優(yōu)質(zhì)胚胎繼續(xù)培養(yǎng)形成囊胚的結(jié)局顯著相關(guān)。我們推測，D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)較高的患者，可能整體胚胎質(zhì)量都較好，因而更容易形成囊胚。

綜上所述，D3非優(yōu)質(zhì)胚胎經(jīng)囊胚培養(yǎng)后部分有發(fā)育為囊胚的潛能。探索非優(yōu)質(zhì)胚胎繼續(xù)培養(yǎng)后影響囊胚形成因素的研究相對較少，本項研究表明，患者的受精方式、不孕類型、胚胎質(zhì)量與D3非優(yōu)質(zhì)胚胎囊胚培養(yǎng)的結(jié)果密切相關(guān)。

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