五味子乙素通過(guò)NOS／NO 系統(tǒng)預(yù)防BaP所致HTR8-SVneo細(xì)胞氧化損傷

章艷燕，侯海燕，陳曉，梁婧，陳亞瓊

（武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院，天津 300162）

自由基大量堆積是造成細(xì)胞氧化損傷的主要原因。流行病學(xué)研究表明苯并（a）芘（BaP）在體內(nèi)代謝過(guò)程中能產(chǎn)生大量氧自由基，造成細(xì)胞氧化損傷［1］。五味子乙素（Sch B）是五味子的提取物，可以誘導(dǎo)細(xì)胞的抗氧化反應(yīng)［2］。本研究以人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8-SVneo 為載體，探討一氧化氮合酶（NOS）／一氧化氮（NO）系統(tǒng)在Sch B 預(yù)防BaP 致HTR8-SVneo細(xì)胞氧化損傷中的作用及可能機(jī)制。

材料與方法

一、材料

1.細(xì)胞系：人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞系（HTR8-SVneo）由加拿大Graham 教授惠贈(zèng)。

2.試劑：五味子乙素（Sch B）（中國(guó)藥品生物制品檢定所），苯并（a）芘（BaP）（Sigam，美國(guó)），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京天根生化）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海藍(lán)基生物），NO 測(cè)試試劑盒、總一氧化氮合酶（TNOS）測(cè)定試劑盒（南京建成）。

3.儀器：MODEL680 型酶標(biāo)儀（BIO-RAD，美國(guó)），水平電泳儀、垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（北京六一儀器），電泳凝膠成像系統(tǒng)（FUGI，日本）。

二、研究方法

1.HTR8-SVneo 細(xì)胞培養(yǎng)和預(yù)處理：HTR8-SVneo細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、120U／mL 青鈉霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)。待細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)滿皿底85%左右時(shí)開(kāi)始給藥。實(shí)驗(yàn)分為3組，BaP組、Sch B 組和空白對(duì)照組。BaP組：先用僅含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)6h，再更換至含有20μmol／L BaP的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h；Sch B組：根據(jù)培養(yǎng)基中Sch B的濃度不同，又分為3組，各組先分別用含有不同濃度Sch B 的培養(yǎng)液（濃度分別為0.1、0.5 或2 μmol／L）培 養(yǎng) 細(xì) 胞6 h，再 換 成 含 有20μmol／L BaP的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h；空白對(duì)照組：用僅含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞6h，再更換為相同成分的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。收集細(xì)胞制成細(xì)胞裂解液，同時(shí)將收集的細(xì)胞培養(yǎng)液離心待用。

2.MTS法檢測(cè)細(xì)胞存活率：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100μl細(xì)胞懸液（含1×104個(gè)細(xì)胞），待細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)滿皿底85%左右時(shí)行如上預(yù)處理，BaP 孵育24h 后棄去藥物及培養(yǎng)液，每孔加入120μl MTS溶液，37℃孵育150min。使用MODEL680酶標(biāo)儀選擇波長(zhǎng)為490nm，檢測(cè)各孔的吸光光度值（OD），以空白對(duì)照組為參照，計(jì)算其平均值。

3.細(xì)胞培養(yǎng)液中NO 及TNOS含量檢測(cè)：采用還原酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO 及TNOS 含量。收集細(xì)胞培養(yǎng)液后離心，取上清，按照NO 測(cè)試試劑盒和TNOS測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行檢測(cè)。

4.細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、eNOS的mRNA水平檢測(cè)：利用Pubmed-Blast設(shè)計(jì)目的基因 引 物。iNOS 上 游 引 物 序 列：5’-CGGTGCTGTATTTCCTTACGAGGCGAAGAA-3’，下游引物序列： 5’-GGTGCTGCTTGTTAGGAGGTCAAGTAAAGG-3’；eNOS 上 游 引 物 序 列：5’-TCACATCTGTCCAGAGGCTG-3’，下游引物序列：5’-CTGGCACAGTCCCTTATGGT-3’；內(nèi)參GAPDH 上游引物序列：5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’，下游引物序列：5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’。

細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，用Trizol法提取RNA 并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA 模板用iNOS、eNOS 引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參。RT-PCR 擴(kuò)增體系（2×Tap PCR Master MIX 6μl，上游引物1μl，下游引物1μl，RNA底物1μl，ddH2O 3μl）。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95 ℃變性5min；95℃30s、56℃45s、72℃1min，共34個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取8μl擴(kuò)增后產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下進(jìn)行成像分析，得到待測(cè)DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物與內(nèi)參GAPDH 擴(kuò)增產(chǎn)物的光密度值，計(jì)算二者的比值，即為目的DNA 的相對(duì)表達(dá)量。

5.細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)量測(cè)定：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2ml細(xì)胞懸液（含5×105個(gè)細(xì)胞），待給藥處理后，按照eNOS 酶聯(lián)免疫分析試劑盒說(shuō)明，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，離心5min后收集上清，酶標(biāo)板上加樣，再加入酶標(biāo)記溶液，37℃反應(yīng)1h。棄液、洗滌5次，拍干。每孔依次加入顯色劑A 和顯色劑B，37℃避光顯色15min。每孔加入終止液，終止反應(yīng)。置于酶標(biāo)儀上450nm 測(cè)量各孔吸光光度值，重復(fù)測(cè)量3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞存活率比較

BaP組細(xì)胞存活率（72.2±0.9）%明顯低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.1、0.5或2 μmol／L Sch B＋20μmol／L BaP各組的細(xì)胞存活率分別為（78.2±1.5）%、（86.5±0.6）%、（93.4±1.0）%，顯著高于Bap組（P＜0.05）（圖1、2）。

圖1 光鏡下細(xì)胞生長(zhǎng)圖片 ×200

圖2 各組細(xì)胞存活率比較

二、細(xì)胞NO 及TNOS含量比較

BaP組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO、TNOS 含量分別為（4.21±0.20）μmol／L、（8.78±0.38）U／ml，均顯著高于空白組［分別為（1.82±0.15）μmol／L 和（6.08±0.68）U／ml］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而與BaP 組相比，給予Sch B 干預(yù)的組別中NO、TNOS含量隨著Sch B 劑量的增加逐漸下降，0.1、0.5或2μmol／L Sch B＋20μmol／L BaP各組NO、TNOS含量分別為（3.90±0.18）μmol／L、（3.22±0.15）μmol／L、（2.81±0.15）μmol／L 和（7.51±0.55）U／ml、（7.45±0.48）U／ml、（6.19±0.50）U／ml（P＜0.05）（圖3）。

三、細(xì)胞內(nèi)iNOS、eNOS mRNA 表達(dá)量

BaP組中iNOS、eNOS mRNA 表達(dá)量均高于空白組，分別為空白組的3.60和1.88倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與BaP 組相比，不同劑量Sch B 組 中iNOS、eNOS mRNA 表 達(dá) 量 均 顯 著 下降，分 別 為BaP 組 的0.80、0.49、0.50 倍 和0.71、0.73、0.57倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

四、細(xì)胞內(nèi)eNOS蛋白表達(dá)量

eNOS酶聯(lián)免疫結(jié)果顯示，BaP 組中eNOS 蛋白表達(dá)量為（5.67±0.66）ng／ml，是空白組表達(dá)量［（3.16±0.86）ng／ml］的1.79倍（P＜0.05）；而與BaP組相比，不同劑量的Sch B 組中eNOS蛋白表達(dá) 量 顯 著 下 降，0.1、0.5 或2 μmol／L Sch B＋20μmol／L BaP各組eNOS蛋白含量分別為（4.34±0.39）ng／ml、（4.44±0.39）ng／ml和（3.20±0.88）ng／m，分別為BaP組的0.77、0.78和0.56倍（P＜0.05）（圖5）。

討 論

圖3 各組培養(yǎng)液中NO（A）、TNOS（B）含量比較

圖4 各組細(xì)胞內(nèi)iNOS、eNOS的mRNA 相對(duì)表達(dá)量

圖5 各組細(xì)胞內(nèi)eNOS蛋白表達(dá)量

多環(huán)芳烴類(lèi)化合物是常見(jiàn)空氣污染物，大量研究表明多環(huán)芳烴類(lèi)化合物可以通過(guò)胎盤(pán)屏障與胎兒血液中的血紅蛋白結(jié)合形成DNA 加合物，導(dǎo)致低出生體重、胎兒生長(zhǎng)受限及出生缺陷等不良妊娠結(jié)局［3-4］。BaP是多環(huán)芳烴類(lèi)污染物中最具代表性的一種，具有致畸、致癌、致突變作用。流行病學(xué)研究表明BaP在體內(nèi)代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生大量的氧自由基，對(duì)機(jī)體和組織細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，造成組織細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。胚胎發(fā)育早期對(duì)環(huán)境致畸物較敏感，如果這一時(shí)期較多地暴露于Bap 甚至可導(dǎo)致胚胎發(fā)育停止［5-8］。

氧自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞功能失調(diào)是胚胎體外發(fā)育受阻的一個(gè)重要因素，NO 就是其中之一。NO 作為一種自由基性質(zhì)的生物活性氣體分子，普遍存在于機(jī)體各組織細(xì)胞中，具有非常重要的生理調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)許多研究表明NO 在體內(nèi)外早期胚胎發(fā)育中具有重要的調(diào)節(jié)作用。NO 代謝水平可作為檢測(cè)胚胎發(fā)育是否正常的一項(xiàng)重要指標(biāo)［9］。NO 在組織和細(xì)胞中發(fā)揮其生物學(xué)作用的機(jī)理之一是通過(guò)激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，引起環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）水平升高。許多實(shí)驗(yàn)證明cAMP／cGMP 比例對(duì)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用［10］。NO 是cAMP／cGMP比例的主要調(diào)節(jié)者。故適量濃度的NO 是正常胚胎發(fā)育所必需，當(dāng)其濃度失衡時(shí)則可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯或胚胎死亡［11-12］。Fábregues等［13］的研究估計(jì)了NO 供體對(duì)小鼠胚胎體外發(fā)育和體內(nèi)種植的研究，結(jié)果表明高濃度的NO 既能抑制小鼠胚胎的體外發(fā)育亦能抑制胚胎的體內(nèi)種植。本研究結(jié)果表明BaP能刺激HTR8-SVneo細(xì)胞產(chǎn)生大量的NO，造成細(xì)胞損傷，而Sch B 能明顯減少NO 的生成，從而預(yù)防BaP對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷。

NOS是NO 合成過(guò)程中的限速酶，NOS 其同功酶主要有3 種亞型：eNOS、iNOS 和神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）。由于NO 半衰期非常短且極其不穩(wěn)定，大多數(shù)關(guān)于NO 的研究都是以研究NOS的調(diào)控為基礎(chǔ)。大量研究表明NOS在許多哺乳類(lèi)動(dòng)物早期胚胎發(fā)育中均有不同程度的表達(dá)，在胚胎發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示BaP組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNOS含量明顯增加，而TNOS的活性增強(qiáng)能促進(jìn)NO 的大量生成，致使高濃度NO對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。而Sch B 能抑制TNOS 的大量增加，減少細(xì)胞損害。

流行病學(xué)研究表明正常妊娠期婦女整個(gè)妊娠期間羊膜及絨毛膜間質(zhì)的纖維細(xì)胞均有iNOS表達(dá)，胎盤(pán)組織中亦有廣泛分布的iNOS，其與某些免疫因子相互作用，維持胎盤(pán)屏障的正常生理功能。iNOS生理狀態(tài)下處于不表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體受到急性損傷時(shí)，其表達(dá)被激活，產(chǎn)生過(guò)量NO 并聚積，高水平的NO 可損傷細(xì)胞線粒體、干擾能量代謝以及DNA 合成，還可使高劑量的超氧化物歧化酶（SOD）喪失保護(hù)作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［14］。夏革清等［15］研究表明，iNOS表達(dá)與滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡相關(guān)，在滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡明顯的部位，iNOS的表達(dá)量增加，同時(shí)iNOS在自然流產(chǎn)滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)水平。Ogando 等［16］的研究亦表明，由iNOS 催化底物生成的高濃度NO 具有細(xì)胞毒性作用，引起胚胎損傷。同時(shí)還有研究表明可以通過(guò)抑制iNOS的表達(dá)降低NO 生成從而減少細(xì)胞損傷及凋亡［17］。本研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)iNOS mRNA 呈低表達(dá)狀態(tài)，而B(niǎo)aP組中iNOS mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)，提示iNOS催化合成的過(guò)量NO 在BaP 對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損傷中起促進(jìn)作用。而不同劑量Sch B組中iNOS mRNA的表達(dá)量相比BaP組明顯減少，說(shuō)明Sch B 可通過(guò)抑制iNOS的表達(dá)，減少NO 生成，減輕對(duì)細(xì)胞的損傷。

生理?xiàng)l件下內(nèi)皮細(xì)胞在低表達(dá)eNOS催化下產(chǎn)生一定量的NO，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)cGMP 途徑調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的張力、舒張血管等。然而在某些條件下，如組織的缺血再灌注等過(guò)程中，eNOS 也能產(chǎn)生大量有損傷作用的NO［18］。許雅君等［19］研究表明乙醇能夠從基因和蛋白水平誘導(dǎo)胚胎組織eNOS表達(dá)的增加，繼而對(duì)組織造成氧化損傷，而乙醇導(dǎo)致胚胎細(xì)胞內(nèi)NO 含量的增加可能也與eNOS的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。本研究結(jié)果表明BaP 組eNOS mRNA 和蛋白水平的表達(dá)量均明顯增加，而Sch B 組中eNOS mRNA 和蛋白水平的表達(dá)量均顯著減少。進(jìn)一步說(shuō)明BaP可以通過(guò)上調(diào)eNOS活性，刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量NO，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，而Sch B 可以有效預(yù)防這種損傷。

綜上所述，BaP可能通過(guò)改變NOS活性，導(dǎo)致NO 代謝紊亂，誘發(fā)細(xì)胞的氧化損傷。Sch B則可以有效預(yù)防BaP所致的HTR8-SVneo細(xì)胞氧化損傷，其機(jī)制可能與NOS／NO 系統(tǒng)的平衡有關(guān)。

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