多殺性巴氏桿菌毒力因子及基因表達(dá)的研究進(jìn)展

李卉

(西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 重慶 北碚400715)

多殺性巴氏桿菌是巴氏桿菌屬重要的致病菌，以其菌體抗原區(qū)分為16個(gè)血清型，菌體呈細(xì)小球桿狀或短桿狀，兩端鈍圓，在培養(yǎng)物中呈圓形、卵圓形或桿狀，瑞氏染色或美蘭染色可見(jiàn)明顯的兩極著色，為革蘭陰性菌。

1 毒力因子

1.1毒力因子概述

致病菌要成功侵襲宿主，首先要突破宿主機(jī)體防御系統(tǒng)，進(jìn)行吸附和侵入，并能在其中繁殖與擴(kuò)散，同時(shí)還要抵御宿主免疫系統(tǒng)的防御，這樣致病菌才能最終獲得存活所需的營(yíng)養(yǎng)條件、定居下去。疾病發(fā)生一方面與宿主自身抵抗力和遺傳因素有關(guān)，另一方面受細(xì)菌毒力因子影響。有些毒力因子本身還具有免疫原性，可為研究防治疾病的疫苗提供理論基礎(chǔ)。

1.2毒力因子的歸納性對(duì)比

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)飛速發(fā)展，各種多殺性巴氏桿菌的毒力因子紛紛浮出水面，其中最主要的4種為莢膜、外膜蛋白、脂多糖、皮膚壞死毒素，而溶血素、胞外酶、透明質(zhì)酸酶[1]可能作為毒力因子，這里也作介紹。

眾多文獻(xiàn)采用逐一羅列的方式敘述毒力因子詳情，現(xiàn)總結(jié)為如下表格。

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以上毒力因子各有特點(diǎn)，細(xì)菌致病性的強(qiáng)弱是多種因子共同作用的結(jié)果。將它們分開(kāi)來(lái)逐個(gè)細(xì)致研究，篩選出免疫原性較強(qiáng)的毒力因子，可推動(dòng)高效亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)利用。

2 多殺性巴氏桿菌體內(nèi)表達(dá)基因技術(shù)

2.1體內(nèi)表達(dá)技術(shù)（IVET）

多殺性巴氏桿菌外膜蛋白基因分析的研究來(lái)源于基因的體內(nèi)表達(dá)技術(shù)（in vivo expression technology)，IVET體內(nèi)表達(dá)基因是指能在宿主體內(nèi)環(huán)境下表達(dá)，而在宿主體外環(huán)境不能表達(dá)的病原菌基因[8]。病原菌在宿主體內(nèi)、外生活環(huán)境差異明顯，細(xì)菌會(huì)對(duì)自身基因表達(dá)做出一系列適應(yīng)性改變。由于宿主體內(nèi)免疫反應(yīng)過(guò)程十分復(fù)雜，基因若在體外表達(dá)，就不能精準(zhǔn)重現(xiàn)宿主與細(xì)菌的相互關(guān)聯(lián)，所以IVET技術(shù)對(duì)于篩選出在宿主體內(nèi)被激活的基因具有顯著效果。

早在2001年，Mahan等人最先提出體內(nèi)表達(dá)技術(shù)(IV ET)，并用其來(lái)鑒定細(xì)菌體內(nèi)表達(dá)基因。Hunt等人[9]使用IVET技術(shù)通過(guò)建立禽多殺性巴氏桿菌體內(nèi)表達(dá)基因篩選系統(tǒng)，成功篩選到十幾個(gè)基因，并初步推測(cè)這些基因可能與細(xì)菌編碼外膜蛋白、催化生物新陳代謝的酶等功能有關(guān)。

2.2信號(hào)標(biāo)簽突變技術(shù)(STM)

STM是一種有效的負(fù)向選擇法，廣泛用于決定病原能否在宿主體內(nèi)成功定殖的基因篩選[10]。Ful ler等人[11]在2000年使用信號(hào)標(biāo)簽突變技術(shù)（STM）從牛多殺性巴氏桿菌中成功篩選出20多個(gè)體內(nèi)表達(dá)基因，并對(duì)這些基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了細(xì)致的功能預(yù)測(cè)。

2.3 DNA微陣列（DNA Microarray）技術(shù)

DNA Micmarray又名寡核苷酸陣列(Ol igonucleitide ar ray)[12]。該技術(shù)的基本原理是在固體表面上集成已知序列的基因探針，被測(cè)生物細(xì)胞或組織中大量標(biāo)記的核酸序列與上述探針陣列進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)相應(yīng)位置雜交探針，實(shí)現(xiàn)基因信息的快速檢測(cè)[8]。2002年，Boyce等人[13]使用DNA微陣列技術(shù)，通過(guò)雛雞建立起自然感染模型，對(duì)禽多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了體內(nèi)表達(dá)基因的篩選研究，并提出理論——在宿主體內(nèi)高水平表達(dá)的病原菌基因很有可能就是其毒力基因。

2.4體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)（IVIAT）

IVIAT的基本原理是通過(guò)利用已感染過(guò)目標(biāo)病原的宿主血清來(lái)研究宿主體內(nèi)特異性表達(dá)的病原基因。Handfield等人[14]在研究空腔病原菌時(shí)發(fā)現(xiàn)了116個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的抗原，并從中得到11個(gè)新的IVI基因，同時(shí)提出了IVIAT的概念。如今來(lái)看，應(yīng)用該技術(shù)對(duì)Pm體內(nèi)表達(dá)基因的篩選具有重要的借鑒意義。

3 展望

針對(duì)Pm雖已有多種疫苗成功取得效果并對(duì)疾病發(fā)展有一定控制，如多種滅活、弱毒菌苗、莢膜亞單位疫苗和高免血清等。但由于Pm血清型多達(dá)16種而疫苗免疫譜窄，只可對(duì)同型毒株有免疫效果，且保護(hù)期短，易出現(xiàn)耐藥性等原因，多殺性巴氏桿菌病仍在多地區(qū)時(shí)有發(fā)生。隨著毒力因子研究更加深入，構(gòu)建多價(jià)融合性外膜蛋白菌株或許為制備具交叉免疫保護(hù)性的亞單位疫苗指明了方向。與此同時(shí)，研究毒力因子的功能與特性、體內(nèi)表達(dá)基因的提取、鑒定和篩選等，對(duì)于闡明Pm致病機(jī)理有推動(dòng)性作用，也促進(jìn)研制出高效、安全、廉價(jià)的疫苗，使控制多殺性巴氏桿菌病成為可能。

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