基于情緒應(yīng)激下心血管疾病大鼠復(fù)合模型的構(gòu)建探索益氣活血方對(duì)脂聯(lián)素水平的影響*

萬 婷，郭書文，吳佳妮，張 璐，武建功，陳 曦，劉文臣，蘇兆鐸

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029）

隨著現(xiàn)代都市人們生活方式，生活狀態(tài)的改變，各方面壓力的增加以及環(huán)境的污染，心血管疾病已然成為威脅現(xiàn)代社會(huì)人類健康的主要疾病之一。在跟隨導(dǎo)師門診過程中，發(fā)現(xiàn)心血管疾病收錄近2 年明顯相對(duì)增多，并且呈年輕化趨勢(shì)，情緒主訴增多明顯。有相當(dāng)一部分患者，在心血管疾病癥狀臨床相關(guān)指標(biāo)改變的基礎(chǔ)上，描述有內(nèi)心的壓抑、恐懼、焦躁、易怒以及失眠等情緒改變。心血管疾病和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)聯(lián)系緊密，情緒和心血管疾病的關(guān)系在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)界也越來越多的促進(jìn)了心血管、抑郁癥臨床治療方案的調(diào)整[1]。本實(shí)驗(yàn)就是立足于這樣的現(xiàn)實(shí)狀況，通過對(duì)導(dǎo)師益氣活血中藥臨床療效以及相關(guān)中醫(yī)理論的研究進(jìn)行了設(shè)計(jì)，以期進(jìn)一步揭示益氣活血藥的作用機(jī)制，以及心腦、心血管疾病以及情緒的相關(guān)作用機(jī)制，為臨床用藥，組方以及后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究做出一定的探索。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)的8 周齡健康雄性SD（Sprague-Daw－Ley）大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于北京東直門醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，除情緒造模刺激需要外，整個(gè)實(shí)驗(yàn)均常規(guī)飼養(yǎng)，室溫：21～23℃，照明節(jié)律。

1.2 藥品

1.2.1 造模用藥

鹽酸異丙腎上腺素注射液，由上海禾豐制藥有限公司提供，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字：H31021344，批號(hào)：131103，規(guī)格：2mL∶1mg。

1.2.2 治療用藥

中藥組：取人參、生黃芪、川芎、當(dāng)歸、三七制成顆粒劑（由北京中醫(yī)藥東直門醫(yī)院藥房提供，溶于燒開的蒸餾水中，配比組方用量比例為導(dǎo)師多年臨床總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，服藥量為：1 次/d，21g/（kg·d）（前期研究確立）[2]。

西藥組，陽性對(duì)照用藥：培哚普利（雅施達(dá)），由天津施維雅制藥有限公司提供，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字：H20034053，批號(hào)：2004788，規(guī)格：4mg×30 片/盒。服藥量為：1 次/d，劑量為0.4mg/（kg·d）（臨床等效劑量），將藥物溶于蒸餾水中，調(diào)整藥物濃度達(dá)到10mL/（kg·d）的用藥容積。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與實(shí)驗(yàn)試劑

1.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器

JAll0003 電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Vev770 超聲檢測(cè)儀（加拿大visualsonics 公司）；突光定量PCR 儀：Thermo，美國(guó)；突光PCR 板：Thermo，美國(guó)；恒溫水浴箱：J-MAX，中國(guó)；旋禍混合器：其林貝爾，中國(guó)；電泳儀：北京六一，中國(guó)；水平瓊脂糖電泳槽：北京六一，中國(guó)；-8℃冰箱：中科美菱，中國(guó)；電動(dòng)玻璃勻漿器：新芝，中國(guó)；搖床：其林貝爾，中國(guó)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)：eppendorf，德國(guó)。

1.3.2 手術(shù)器械及其他物品

眼科剪、眼科鑷，直剪刀4 把，鑷子4 把，大剪子1 把，剝離鉗1 把（180～200℃，烘烤4～6h）。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)試劑與溶液配方

瓊脂糖：西班牙，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：Fermentas，EDTA，Sigma；Tris；Sigma；Trizol；Invitrogen，Taq 醇：Genstar，引物：上海生工，DEPC：Sigma，DL2000 DNA Marker：Genstar，dNTP：Genstar，E.B：Sigma，SYBGREEN PCR Mix；冷生理鹽水（氯化鈉注射液），由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H11021192；70%酒精（醫(yī)用乙醇），由新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司提供，批號(hào)：20141005；水合氯醛（水合三氯乙醛），由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)：20140619。

2 方法

2.1 造模方法

動(dòng)物在適應(yīng)性飼養(yǎng)后，進(jìn)行腹腔注射異丙腎上腺素[5mg/（kg·d）]3 d，制造心肌缺血、心力衰竭衰模型[3]。注射后觀察48h，穩(wěn)定后，對(duì)所有造模動(dòng)物進(jìn)行心率、心跳強(qiáng)度的觀察和記錄，根據(jù)心率結(jié)合隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)分組，分組情況如表1。

在心血管疾病造?；A(chǔ)上，模仿現(xiàn)代人壓力、孤獨(dú)、欲求不滿等狀態(tài)，連續(xù)30 d，灌服藥物的同時(shí)，對(duì)藥物組以及復(fù)合模型組大鼠進(jìn)行情志干擾[4-5]，制造復(fù)合模型。空白組和ISO 模型組常規(guī)飼養(yǎng)，不進(jìn)行情緒刺激。造模過程中西藥組和ISO 模型組分別死亡2 只。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組

表1 實(shí)驗(yàn)分組

稱量動(dòng)物體質(zhì)量，標(biāo)記。

2.3 給藥方法

中藥、西藥藥物組每天上午，按量（2mL/200g·d-1）按時(shí)分組灌服益氣活血中藥、西藥陽性對(duì)照藥。空白組和模型兩組動(dòng)物灌服等量蒸餾水。后期根據(jù)大鼠重量的增加，監(jiān)測(cè)體質(zhì)量，不斷進(jìn)行劑量的調(diào)整。灌胃過程中可能由于人為操作不當(dāng)，中藥組死亡1 只。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.3.1 超聲檢查

給藥造模情緒干擾32d 后，對(duì)所有大鼠行超聲檢查，麻醉大鼠后，仰臥位固定，涂抹膏狀綠色透明藥物導(dǎo)體，采用高頻探頭RMV716 對(duì)大鼠心臟進(jìn)行定位，在二尖位，水平部進(jìn)行探測(cè)，取胸骨旁短軸切面，由二維超聲引導(dǎo)M 型曲線進(jìn)行測(cè)定，每組原始數(shù)據(jù)取連續(xù)3 個(gè)心動(dòng)周期測(cè)量的平均值，記錄保留3 次數(shù)值，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，主要?duì)短軸縮短率（FS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）指標(biāo)進(jìn)行了超聲檢測(cè)，作為心血管疾病成模標(biāo)準(zhǔn)[6]。

2.3.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為學(xué)觀察

于情緒干擾前，干擾14d，干擾32d 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)觀察。將大鼠放置于75×75×50cm，四周為黑色，底部呈白色，且被劃分為25 格的箱子中央。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在安靜通風(fēng)昏暗室內(nèi)進(jìn)行，為防止干擾，實(shí)驗(yàn)開始前讓大鼠提前進(jìn)行環(huán)境的熟悉，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中減少人員干擾。觀察記錄大鼠縱向，橫向行動(dòng)，每只3min，間隔清理排泄物，并且用酒精消毒，防止不同大鼠氣味的誘導(dǎo)。橫向運(yùn)動(dòng)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：三只足進(jìn)入一格記錄為橫向運(yùn)動(dòng)一次；縱向運(yùn)動(dòng)記錄標(biāo)準(zhǔn)：攀爬一次記錄為縱向運(yùn)動(dòng)一次[7]。

2.3.3 RT-PCR（脂聯(lián)素檢測(cè)）

引物設(shè)計(jì)：脂聯(lián)素以及內(nèi)參Rat-Actin PCR 的引物序列（由生工生物工程有限公司合成），見表2。

表2 脂聯(lián)素以及內(nèi)參Rat-Actin PCR 的引物序列

PCR 免疫印跡分析，從100mg 心肌和海馬體組織中提取總蛋白質(zhì)（從心尖上剪取心肌組織），分析其濃度。填充于12%的聚丙稀酰胺，進(jìn)行凝膠電泳。用公司提供的Rat-Actin 作為內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化，同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。通過溶解曲線分析，實(shí)驗(yàn)各組結(jié)果均為單一峰，說明PCR 擴(kuò)增特異性較好，樣本3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重復(fù)性較好。結(jié)果使用ΔΔCt 法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析整理后得到如表5。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)經(jīng)過記錄和歸類整理編號(hào)區(qū)分，用Excel 和SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，對(duì)單變量計(jì)量資料樣本均數(shù)間進(jìn)行比較，若符合正態(tài)分布，用單因素方差進(jìn)行處理（One-Way ANOVA）。多重比較，用LSD 或者SNK 法。若方差不齊，則用Games-Howe II 進(jìn)行分析，雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.05。

3 結(jié)果

3.1 超聲心動(dòng)圖結(jié)果

表3 超聲心動(dòng)圖各組結(jié)果對(duì)比（x±s，%）

各組對(duì)比，第32 天超聲心動(dòng)圖測(cè)試，有一定的差異性：2 個(gè)模型組較空白組射血分?jǐn)?shù)（EF）和短軸縮短率（FS）明顯縮小，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），中藥組、西藥組較模型兩組左室射血分?jǐn)?shù)（EF）和短軸縮短率（FS）有所增加，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01或P＜0.05）。見表3。

3.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過數(shù)據(jù)分析：空白組前后差異不大，ISO 模型組前后對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，復(fù)合模型組服藥后32d 橫向與情志造模前橫向?qū)Ρ扔薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中藥組服藥后32d 橫向與情志造模前橫向?qū)Ρ扔薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；西藥組服藥后32d 橫向與情志造模前橫向?qū)Ρ扔薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明情緒刺激還是起到一定作用。見表4。

表4 造模前，第14，30 天曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)平均值（x±s）對(duì)比（單位：次）

3.3 脂聯(lián)素的檢測(cè)結(jié)果

心肌組織和腦海馬體中均在基因水平檢測(cè)出脂聯(lián)素，將心肌組織和腦組織所含脂聯(lián)素基因?qū)用娼Y(jié)果進(jìn)行各組含量的對(duì)比：在腦海馬體中，與空白組相比，兩個(gè)模型組脂聯(lián)素水平均顯著降低（P＜0.05），空白組、ISO 模型組同復(fù)合模型組3 組的對(duì)比，復(fù)合模型組較ISO 模型組脂聯(lián)素水平有降低的趨勢(shì)（P=0.056），兩者在基因?qū)用婧可隙嫉陀诳瞻捉M，說明情緒應(yīng)激、心血管疾病均可能對(duì)腦海馬體中的脂聯(lián)素水平造成一定的影響，引起脂聯(lián)素水平的降低。同樣在心肌組織中，也得出如上結(jié)論。如上表所示：益氣活血藥治療組具備扭轉(zhuǎn)mRNA 水平的作用，相對(duì)于復(fù)合模型組提升了心肌組織和腦海馬體中脂聯(lián)素的含量，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；西藥組在對(duì)脂聯(lián)素含量的影響上僅僅起到提升的趨勢(shì)（P=0.062），可能由于藥物作用時(shí)間等各方面因素，在基因?qū)用孀饔眯Ч簧躏@著，存在繼續(xù)實(shí)驗(yàn)研究探索的價(jià)值。見表5。

表5 脂聯(lián)素不同組之間，不同臟器部位的含量對(duì)比（x±s）

4 討論

脂聯(lián)素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽，其在機(jī)體中可以對(duì)脂類和糖類的代謝產(chǎn)生影響[8]。在心血管疾病和情緒應(yīng)激的關(guān)聯(lián)性中起著很大的作用，情緒可能影響體內(nèi)脂聯(lián)素的含量，所謂的心寬體胖和心情不佳時(shí)食欲降低和心情不好想吃東西，抑郁癥的人容易消瘦等等這些生活現(xiàn)象與脂肪細(xì)胞密切相關(guān)，與情緒、脂聯(lián)素水平也密切相關(guān)，脂聯(lián)素這一含量的變化對(duì)心血管疾病有重要的影響，情緒和心血管疾病通過脂聯(lián)素相關(guān)聯(lián)，是心血管疾病的雙心醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)依據(jù)之一[9]。通過對(duì)比藥物組和空白組、復(fù)合模型組的含量，得出益氣活血中藥在提升脂聯(lián)素上有很重要的作用。腦海馬體和心肌組織中都存在脂聯(lián)素的表達(dá)，說明兩者自身均產(chǎn)生脂聯(lián)素，兩者的協(xié)調(diào)和關(guān)聯(lián)性，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)去驗(yàn)證。最近有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，血漿脂聯(lián)素水平在社會(huì)挫敗壓力應(yīng)激模型中是降低的，小鼠腦室內(nèi)注射外源性脂聯(lián)素后，血漿脂聯(lián)素水平產(chǎn)生變化，那么作為在擔(dān)負(fù)著記憶、空間定位功能承載者的海馬體[10]，其中脂聯(lián)素含量的變化在情緒應(yīng)激刺激下基因?qū)用婧康淖兓募〗M織間是分開還相互影響的，就有待于在時(shí)間點(diǎn)上，進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。心肌中脂聯(lián)素mRNA 降低可能是由腦海馬體、血清脂聯(lián)素下調(diào)引起的。然而，低血清濃度最終決定了轉(zhuǎn)運(yùn)到心肌的脂聯(lián)素水平偏低。值得注意的是，無論是心肌還是海馬，在益氣活血藥物的干預(yù)下，脂聯(lián)素水平都逐漸在提升接近正常的水平，這可能就是益氣活血藥物在治療心血管疾病的同時(shí)，具有調(diào)整患者情緒，從整體將疾病導(dǎo)向良性循環(huán)的部分原因。

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