榨菜葉中RNA提取及硫苷酶基因序列測定與分析

張燕，侯坤蘭

（1.長江師范學院生命科學與技術(shù)學院，重慶，408100；2.重慶長江師范學院）

榨菜葉中RNA提取及硫苷酶基因序列測定與分析

張燕，侯坤蘭

（1.長江師范學院生命科學與技術(shù)學院，重慶，408100；2.重慶長江師范學院）

采用Trizol試劑法從榨菜葉中提取RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴增得到硫苷酶基因保守序列，利用DNAman7生物信息分析軟件對測得的保守序列與菜心硫苷酶基因保守序列進行比對，翻譯核苷酸和蛋白質(zhì)序列與蕓薹屬油菜、菜心、甘藍、芥菜等序列進行相應的比對。結(jié)果表明，采用Trizol試劑法能獲得320 bp的基因保守序列；與甘藍、菜心硫苷酶基因保守序列比對結(jié)果的Identity為97.12%；與蕓薹屬油菜、菜心、甘藍等進行相應的翻譯核苷酸和翻譯成蛋白質(zhì)序列比對分析，發(fā)現(xiàn)序列的覆蓋度與相似度均達到較高的水平。

榨菜；硫苷酶基因；保守序列

硫苷酶即硫代葡萄糖苷酶，主要存在于十字花科植物中，能催化硫代葡萄糖苷即硫苷，水解產(chǎn)生異硫代氰酸鹽、葡萄糖、硫代氰酸鹽等物質(zhì)，有較好的防癌和抗菌功效[1，2]。同時，硫苷—硫苷酶系統(tǒng)作為植物本身來說是一個很好的自我防備體[3]，此體系在探究防御病蟲害方面目前已進入熱潮。研究發(fā)現(xiàn)，硫苷酶是一類非組織型表達蛋白，通常在植物體內(nèi)含量較少，因此，從植物獲取較多的硫苷酶很難實現(xiàn)[4，5]。重慶涪陵盛產(chǎn)榨菜，利用此優(yōu)勢，對榨菜硫苷酶基因進行研究，加大對榨菜葉的充分利用，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)榨菜產(chǎn)品的創(chuàng)新過程提供一定依據(jù)，具有廣大的社會、經(jīng)濟和生態(tài)效益。

目前對于硫苷酶基因的研究大多是以油菜、蘿卜、芥藍、大白菜等十字花科植物為材料[6~9]，而對榨菜中硫苷酶基因的研究卻十分匱乏[10]。根據(jù)前人對植物組織中總RNA提取方面研究可知主要存在以下幾個方面的原因：首先是植物材料的影響；其次是植物組織里的多酚、多糖或次級代謝產(chǎn)物等也會對RNA提取產(chǎn)生一定的影響；再次是RNA酶對RNA的降解作用[11，12]。國內(nèi)在研究獲得不同的硫苷酶基因時采用多種不同方法進行引物設計[13]。迄今為止，從白芥芥子酶基因cDNA的分離的第1編碼基因[14]，國內(nèi)外的研究者陸續(xù)從甘藍、油菜、蘿卜、西蘭花[15]等十字花科植物中提取出了硫苷酶基因并將其基因進行克隆和原核表達。比如，2007年謝麗雪從幼嫩的芥藍葉片中分離克隆出硫苷酶基因并進行序列分析；2009年梁錦峰從西蘭花幼葉中分離克隆出硫苷酶基因并進行序列分析。

根據(jù)多次實踐比較，采用最佳的Trizol試劑法從榨菜葉中提取RNA和設計相應的RT-PCR擴增反應的引物而得到榨菜硫苷酶基因的保守序列[16]。分析榨菜硫苷酶基因在十字花科植物蕓薹屬中的油菜、甘藍、菜心等序列的相似程度。榨菜硫苷酶基因的研究為榨菜葉中硫苷酶基因的原核表達及cDNA全長序列的獲得奠定基礎，對榨菜葉以及榨菜中硫苷酶得以充分利用，提高榨菜硫苷酶含量、活性等有重要意義，可為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)榨菜產(chǎn)品的創(chuàng)新提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗內(nèi)容

采用Trizol試劑法從榨菜葉中提取RNA，通過在線設計程序NCBI的Primer Blast以及http:// www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer等得到所需的上、下游引物[17]。由生工生物工程（上海）股份有限公司進行引物合成。榨菜中硫苷酶基因保守序列的獲得，首先以植物總RNA為模板合成第1鏈cDNA，接著再以第1鏈cDNA為模板對硫苷酶基因進行RT-PCR擴增，再通過凝膠電泳檢測其擴增結(jié)果并進行序列測定，最后結(jié)合DNAman7、NCBI等進行序列分析。

1.2 試驗材料

①植物材料榨菜Brassica juncea(L.)Czern. et Coss.var.tumidaTsen et Lee，試驗采用永安小葉（地方發(fā)掘品種），購于重慶涪陵綠源農(nóng)業(yè)科技發(fā)展公司。

②主要試劑液氮、Trizol試劑、異丙醇、氯仿、0.1%的DEPC水溶液、蒸餾水、超純水、5 mol/L NaCl溶液、75%乙醇溶液、Oligo dT（0.5 μg/μL）、RNase free H2O、5×Reacetion Buffer、RNase Inhibitor（20 U/μL）、DNTP Mix（10 mmol/L）、AMV RT（10 U/L）、液體石蠟、瓊脂糖粉、1×TAE溶液、GoldviewTM核酸染料、10× PCR Buffer、DNTP Mixture Solution、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶、DNA Marker 2 000、6×Glycerol DNA loading Buffer、0.5×TBE溶液等。

③主要儀器離心管（15 mL、1.5 mL）、制冰機、高速冷凍離心機、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫干燥器、電泳儀、PCR儀、低溫冰箱（4℃、-20℃）、超低溫冰箱（-72℃）、恒溫培養(yǎng)箱等。

1.3 榨菜葉中提取總RNA和電泳檢測

選取榨菜種子數(shù)粒在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，待到榨菜幼苗長到2葉期，即可用于RNA提取。榨菜葉中總RNA的提取采用的是根據(jù)實際情況改良后的Trizol試劑一步分離總RNA法，反復多次提取。

方法如下：稱量0.5g新鮮榨菜葉片在液氮中快速研磨至粉末，放入盛有5mL Trizol試劑的RNase-free離心管中（置于冰上），充分混勻；將混勻的組織室溫放置約10 min，使其中核酸蛋白復合體物完全分離（此過程可適當延長）；將混合物4℃，7200r/min離心20min，并取上清到新的離心管2號中；再向離心管2號加1 mL氯仿，5 mol/L NaCl溶液1mL，劇烈振蕩15 s，室溫放置2 min（或直接離心）；將離心管2號在4℃，離心20min，7500r/min，樣品會分3層（RNA存在于上層水樣），取上層無色水樣到離心管3號里（不要吸取中間界面）；向離心管3號中加異丙醇2.5 mL并充分混勻，放在室溫10min，再進行4℃，離心20 min，7 200 r/min，去上清液，管底部管壁有膠狀沉淀即為RNA；加75%乙醇4mL，并在4℃離心5min，7200r/min條件下洗滌沉淀，去上清液后再重復1次；吹干（或空氣干燥）約10min；加0.5mL 0.1%DEPC水溶液（經(jīng)高溫高壓滅菌后的），（若發(fā)現(xiàn)沉淀難溶時）用65℃溶解10min，-72℃保存。

電泳檢測時用移液槍取2μL RNA溶解液與1 μL loading Buffer在PCR管中混勻；后用移液槍吸取混合物上樣于1%瓊脂糖凝膠中，調(diào)整電壓100 V、電流50 mA，進行電泳30 min；在紫外光下觀測到28S RNA∶18S RNA大約為2∶1，且條帶清晰、明亮則可用于后續(xù)的試驗。

1.4 第1鏈cDNA鏈合成

在冰浴的1.5mL離心管里依次加入總RNA3μL、Oligo dT（0.5 μg/μL）1 μL，再加RNase-free H2O定容至10 μL。后將上述反應混合物混勻，2 000 r/min下離心10 s，反應混合物在65℃水浴鍋中溫育5 min后，冰浴30 s，接著2 000轉(zhuǎn)/min離心5 s后將離心管放于冰盒上。第1鏈cDNA合成反應體系見表1。

接著將上述反應混合物混勻后，2 000 r/min離心5 s。然后將上述反應混合物全部轉(zhuǎn)移至PCR管中，并向PCR管中加入25 μL液體石蠟，再將其置于PCR儀進行反轉(zhuǎn)錄反應，反應程序見表2，完成上述反應后，將PCR管置于冰盒上。

1.5 引物的設計與合成

根據(jù)Genbank上已經(jīng)有的植物硫苷酶基因序列和相關(guān)參考文獻，再根據(jù)引物設計的一般規(guī)則分別設計上游引物和下游引物，用http://seq.yeastgenome.org/ cgi-bin/web-primer在線設計軟件設計引物，然后用DNAman7進行引物評估，設計好的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。設計的引物如下：上游引物MS-up:5'-CCTCAAACACTCCAAGATG-3'；下游引物MS-down:5'-CTTGTAATCATCACAGGTCCA-3'。

1.6 RT-PCR擴增得到硫苷酶基因保守區(qū)域

先做4個平行反應準備，向冰上的每個離心管中逐次加入試劑，從-20℃冰箱中取出酶立即置于冰上，吸取所需量加入PCE管后再立即放回-20℃冰箱中，根據(jù)PCR反應體系再加入相應的試劑。

表1 第1鏈cDNA合成的反應體系

表2 第1鏈cDNA合成的PCR反應程序

其次，在離心管中分別加入2 μL模板DNA，并加入DEPC處理水使終體積均為50 μL，在各管中加入適量滅菌石蠟油，2 000 r/min離心60 s，再將溶液分別轉(zhuǎn)移至PCR管中。PCR反應體系見表3，RT-PCR反應程序見表4。

1.7 序列測定與分析

此次試驗測得的是榨菜中硫苷酶基因的保守序列，將擴增產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。該保守序列主要通過NCBI及DNAman7進行分析。

表3 RT-PCR反應體系

表4 RT-PCR反應程序

2 結(jié)果與分析

2.1 榨菜葉總RNA提取

由圖1可知，榨菜總RNA樣品電泳結(jié)果在紫外光下觀察到28S RNA、18S RNA、5S RNA三個特征性條帶，且條帶間沒有明顯的彌散現(xiàn)象。28S RNA和18S RNA兩條帶比較明亮、清晰，亮度高于低分子量的5S RNA。其中28S RNA∶18S RNA亮度比約為1.5∶1而沒有完全達到2∶1。

圖1 總RNA電泳

圖2 RT-PCR產(chǎn)物的電泳

經(jīng)分析，這可能是在RNA提取過程中更換手套不及時導致接觸到可能污染了RNA酶的物品[11]，另外也可能由于在電泳過程中將冷凍的RNA解凍后沒能及時點樣，受到溫度和空氣中的RNase的影響；同時電泳時因電泳槽未能清洗干凈而使得TAE緩沖液有所污染，最終使得RNA有輕微降解，但從電泳圖也可得出RNA質(zhì)量還是較高的，沒有明顯降解，可用于合成第1鏈cDNA[11]。因為cDNA的穩(wěn)定性遠高于RNA，易于保存。

2.2 硫苷酶基因保守序列的RT-PCR擴增與分析

由圖2可知，提取的RNA樣品的第1鏈cDNA合成后，通過用硫苷酶基因保守序列的一對上、下游引物進行RT-PCR技術(shù)擴增榨菜中硫苷酶的cDNA片段，再通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。電泳結(jié)果表明，泳道1、2、4均擴增失敗而沒有目的條帶，只有泳道3中的條帶較清晰、明亮，無明顯拖帶現(xiàn)象，通過電泳圖中DNA Marker 2 000可以看出，擴增產(chǎn)物的堿基數(shù)在200～500 bp，與預計的目的片段大小相似，可用作保守序列測定。但泳道1、2、4均不能作序列測定。經(jīng)分析，泳道1可能是DNA模板的量偏多，泳道2和4可能是因為PCR反應體系中鎂離子的量不夠或者DNA模板量偏少所致。

2.3 硫苷酶基因保守序列的分析

硫苷酶基因序列測定由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測定，測得的硫苷酶基因保守序列如下：320 bp（不含上、下游引物）。

①保守序列片段的比較分析由圖3可知，將測得的榨菜硫苷酶基因保守序列與已有的硫苷酶基因保守序列（如甘藍M YB.olerac ea-M登錄號：AY957579以及菜心M Y 49B.parachinensis-M登錄號：AY957578）[3]在DNAman7軟件中進行序列比對?？煽闯稣ゲ肆蜍彰富虮Ｊ匦蛄袎A基有缺失、多余和錯誤，如榨菜相對于菜心和甘藍都缺失了“CCGCCA”、“CA”、“AAGCAC”、“T”，都多余了“T”、“GGG”。其中不同的堿基是第36 bp：菜心和榨菜都為“G”，甘藍為“A”；第64 bp：甘藍與菜心為“T”，榨菜為“A”；第143 bp:榨菜和甘藍都為“G”，菜心為“A”；第146 bp:榨菜和菜心都為“G”，甘藍為“A”；第317 bp、318 bp:甘藍和菜心都為“AG”，榨菜為“GT”。三種植物硫苷酶基因序列比對中，堿基有所差異，但總體比對的Identity為97.12%。由結(jié)果得出同是蕓薹屬的榨菜與已有的菜心、甘藍硫苷酶基因的一致性較高。與此同時，將測得的榨菜硫苷酶基因序列在NCBI中進行nucleotide blast。由圖4可知，該基因與甘藍（登錄號：AY957579.1）、菜心(登錄號：AY957578.1)、油菜（登錄號：EF583560.1）的硫苷酶的核苷酸的Query cover均為97%和I-dentity分別為97%、96%、96%。

圖3 榨菜硫苷酶基因保守序列與甘藍、菜心硫苷酶基因保守序列的對比分析

注：下圖為測得的硫苷酶基因保守序列（320 bp）

②保守序列的翻譯核苷酸序列分析根據(jù)常用的生物信息檢索分析網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，將測得的榨菜硫苷酶基因保守序列與NCBI中已有的蕓薹屬的翻譯核苷酸序列進行比對，結(jié)果表明與油菜硫苷酶基因mRNA，部分cd（登錄號：EU 192929.1）、菜心硫苷酶基因mRNA（登錄號：XM009124972.1）、甘藍硫苷酶基因mRNA，完整的cd（登錄號：EU 004075）以及油菜硫苷酶完整外顯子（登錄號：L11258.1）的覆蓋度（Query cover）和E value分別為：97%、96%、96%、93%和2e-28、2e-27、2e-27、6e-24。由此可知，測得的硫苷酶基因保守序列可作為模板，得到相應的編碼序列，編碼相應的硫苷酶?？偟膩碚f，參與比對的榨菜硫苷酶基因序列大多數(shù)堿基參與了比對，但仍有少部分沒能比對得出，有缺失、錯誤及插入。同時結(jié)合E value的值都小于10-5，可知比對序列之間的相似性較高。

③保守序列片段翻譯成蛋白質(zhì)序列分析根據(jù)常用的生物信息檢索分析網(wǎng)站http://www.ncbi. nlm.nih.gov/，將測得的榨菜硫苷酶基因保守序列翻譯成蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，因此將測得的序列在NCBI中的進行blastx，結(jié)果表明與菜心（登錄號：AAX68548.1）、甘藍（登錄號：ABS30827.1）和歐洲油菜（登錄號：ABW70826.1）的序列的覆蓋度和同源性分別為：97%、98%、98%和98%、97%、94%，由此可得出，榨菜與同為蕓薹屬的菜心、甘藍和油菜硫苷酶基因保守序列翻譯成的蛋白質(zhì)序列的相似性較高。

3 討論與結(jié)論

硫苷酶基因作為編碼硫苷酶的基因，包含完整的編碼硫苷酶蛋白中氨基酸的編碼序列，而硫苷酶在榨菜中含量特別少。本試驗通過提取榨菜葉總RNA，進而運用RT-PCR技術(shù)擴增得到硫苷酶基因的保守序列，為進一步運用RACE技術(shù)擴增得到硫苷酶基因的全長序列以及如何提高榨菜中硫苷酶的生理作用及特性奠定基礎。而且，在國內(nèi)外有關(guān)硫苷酶基因的研究中，未曾有相關(guān)學者以榨菜為試驗材料獲得硫苷酶基因。

另外，本試驗只選擇了一種提取總RNA的方法即Trizol試劑一步分離總RNA法從榨菜葉中提取RNA。因此，難免總RNA質(zhì)量和濃度有偏差。電泳檢測得到的條帶雖然是很清晰、明亮，但是在28S RNA和18S RNA的亮度比沒有完全達到2∶1，而是稍微接近比值，但對于進一步合成第1鏈cDNA沒有太大的影響。

對于通過RT-PCR擴增得到產(chǎn)物的電泳檢測，從目的條帶的大小可見，可以用于序列測定。因此，在將測得序列在NCBI及軟件DNAman7中進行序列比對與分析中，得到的覆蓋度、相似度等達到較高水平，因此也初步證明了測得的基因序列為硫苷酶基因[6]?？偟膩碚f，對榨菜硫苷酶基因的研究為榨菜葉中硫苷酶基因的原核表達及cDNA全長序列的獲得奠定基礎，同時對榨菜中硫苷酶得以充分利用，提高榨菜硫苷酶含量、活性，以及加大對榨菜葉的充分利用等有重要意義，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)榨菜產(chǎn)品的創(chuàng)新提供一定依據(jù)。

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Extracting RNA from Leaves of MustardBrassica Junceaand Measurement and Analysis of Myrosinase Gene

ZHANG Yan,HOU Kunlan
(Life Science and Technology College,Yangtze Normal University,Chongqing 408100)

This purposes of this research is to lay the foundation for prokaryotic expression and to improve the content and activity of myrosinase in mustardbrassica junceaat the same time.The research material was taken from myrosinase gene in mustardbrassica juncea.This topic get conserved sequence of myrosinase gene taken from leaves for the method used, for extraction of RNA from mustardbrassica juncealeavesthat Trizol reagent step separation method of total RNA, according to the conserved nucleotide sequences of different plants and conservative sequence obtained by RT-PCR, conserved sequence alignment between the obtained andBrassica rapeon the DNAman7 bioinformatics analysis software, myrosinase translated nucleotides sequence and protein sequence alignment analysis online combined the NCBI and main withBrassica napue,Brassica rape,Brassica oleracea,Brassica Juncea,etc.The results shows that under identical conditions:320bp gene conserved sequence was obtained by method of Trizol reagent step separation,bioinformatics analysis suggested that conserved sequence showed 97.12%identity to M YB.oleracea-M,M Y 49B.parachinensis-M, myrosinase translated nucleotides sequence and protein sequence of Mustardbrassica junceahas a higher query cover and identity withBrassica napue,Brassica rape,Brassica oleracea,etc.It found that the similarity of sequence coverage have reached a higher level.

Mustard brassica juncea;Myrosinase gene;Conserved sequence

S637.3

A

1001-3547（2015）20-0065-05

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.20.026

重慶市應用開發(fā)計劃項目B類（cstc2013yykfA10003）：從榨菜葉中提取異硫代氰酸鹽的技術(shù)研究與應用

張燕（1977-），女，講師，碩士，主要從事細胞與分子生物學研究，E-mail：28789155@qq.com

2015-09-01