蘿卜抗黑腐病、黑斑病和根腫病育種相關(guān)基礎(chǔ)研究

甘彩霞，袁偉玲，崔磊，王晴芳，於校青，鄧曉輝

（湖北省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所，武漢，430070）

“十二五”期間湖北省農(nóng)科院經(jīng)作所在蘿卜抗黑腐病、黑斑病和根腫病育種上開展了相關(guān)基礎(chǔ)研究，為后續(xù)抗性資源的利用、抗性遺傳規(guī)律的研究以及分子標(biāo)記的開發(fā)進(jìn)行了技術(shù)儲(chǔ)備。

1 蘿卜黑腐病抗病育種相關(guān)基礎(chǔ)研究

1.1 蘿卜主產(chǎn)區(qū)病原菌的分離鑒定

①柯赫氏法則回接驗(yàn)證 采集蘿卜主產(chǎn)區(qū)黑腐病病樣，采用稀釋涂布分離法在NYGA平板培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)病原菌。采用苗期活體噴霧接種和蘿卜塊離體涂抹接種2種方法回接病菌，葉片出現(xiàn)了水漬狀“V”字形斑與田間癥狀相似，蘿卜塊出現(xiàn)黑腐癥狀，說明采集的菌株均為黑腐病病原菌，然后從中選擇致病力強(qiáng)的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

②16S rDNA序列分析與Biolog細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)測定 將測得的WHHF菌株的16S rDNA序列與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，選取同源性較高的序列。WHHF菌株16S rDNA序列與油菜黃單胞桿菌油菜致病變種Xanthomonas campestrispv.campestris（Pammel）Dowson同源性極高，達(dá)到了99%，進(jìn)一步明確了WHHF菌株屬于油菜黃單胞桿菌油菜致病變種。

應(yīng)用Biolog細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)測定菌株，將結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后與數(shù)據(jù)庫內(nèi)已知的細(xì)菌比較，分析后進(jìn)一步確認(rèn)驗(yàn)證該菌株為油菜黃單胞桿菌[1]（Xanthomonas campestrispv.campestris）。

1.2 抗性種質(zhì)篩選

蘿卜黑腐病多從葉緣水孔或傷口侵入[2]，基于侵染發(fā)病條件設(shè)計(jì)可分為活體接種或離體接種。活體噴霧接種適于多份種質(zhì)資源需要快速檢測其苗期抗病，重復(fù)多、接種量大時(shí)采用；離體菌液注射接種適于少量試驗(yàn)材料且發(fā)病條件易于控制時(shí)采用，可為噴霧接種初篩材料后的補(bǔ)充，采用該接種方法要求發(fā)病條件更加均勻一致。

①苗期噴霧接種 基于蘿卜黑腐病侵染為葉緣水孔侵入，采用苗期噴霧接種法，即在光照培養(yǎng)室內(nèi)（25～30℃），選擇濃度為 1.0×108cfu/mL 的細(xì)菌懸浮液采用噴霧法于蘿卜5～6片葉期接種，保濕24 h，7 d后調(diào)查病情，評(píng)價(jià)蘿卜品種對(duì)黑腐病的抗性[3]。

噴霧法分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無?。?.1級(jí)：葉上有一個(gè)小斑；0.5級(jí)：葉上有幾個(gè)病斑，或一個(gè)較大的病斑；1級(jí)：葉上發(fā)病區(qū)占葉面積的 1/4；2級(jí)：葉上發(fā)病區(qū)占葉面積的 1/2；3級(jí)：葉上發(fā)病區(qū)占葉面積的3/4；4級(jí)：病區(qū)占葉面積 3/4以上至全葉。

按病情分級(jí)調(diào)查后，計(jì)算病情指數(shù)，根據(jù)發(fā)病程度對(duì)抗病性分級(jí)。免疫（I）：病情指數(shù)=0；高抗 （HR）：0＜病情指數(shù)≤10； 抗病 （R）：10＜病情指數(shù)≤20； 中抗（MR）：20＜病情指數(shù)≤40；感病（S）：病情指數(shù)＞40。

利用該鑒定方法，對(duì)蘿卜42份種質(zhì)資源進(jìn)行了抗病性鑒定和分級(jí)，其中，有6份材料表現(xiàn)為抗病，18份表現(xiàn)為抗性中等，其余18份均表現(xiàn)為不抗病。

②蘿卜塊離體接種 基于蘿卜黑腐病侵染可從傷口侵入，且蘿卜為根菜類作物，采用蘿卜塊離體接種方法，即在蘿卜塊中間用移液槍加上1×108cfu/mL菌液，蓋玻片將菌液均勻涂滿蘿卜塊，接種后48 h調(diào)查病情指數(shù)。

病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無癥狀；1級(jí)：在蘿卜塊上有水漬變黃癥狀；3級(jí)：病斑變成黃褐色并伴隨腐爛癥狀；5級(jí)：病斑腐爛面積擴(kuò)大并深入蘿卜塊中；7級(jí)：病斑變成黑褐色；9級(jí)：蘿卜塊完全黑腐萎蔫。

按病情分級(jí)調(diào)查后，計(jì)算病情指數(shù)，根據(jù)發(fā)病程度對(duì)抗病性分級(jí)[1]。免疫（I）：病情指數(shù)=0；高抗（HR）：0＜病情指數(shù)≤10；抗病 （R）：10＜病情指數(shù)≤20；中抗（MR）：20＜病情指數(shù)≤40；感?。⊿）：病情指數(shù)＞40。

由表1可見，13份高代自交系沒有抗病材料，中抗材料有2份，其他均為感病和高感材料。

2 蘿卜黑斑病抗病育種相關(guān)基礎(chǔ)研究

2.1 蘿卜主產(chǎn)區(qū)病原菌的分離鑒定

采集蘿卜主產(chǎn)區(qū)黑斑病病樣，分離病健交接部位在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，顯微鏡下挑取單孢進(jìn)行分離培養(yǎng)。對(duì)比參照十字花科鏈格孢形態(tài)確定致病菌為蘿卜鏈格孢，采用苗期活體噴霧接種和蘿卜葉片離體菌餅接種2種方法回接病菌，活體葉片出現(xiàn)了輪紋狀黑斑與田間癥狀相似，蘿卜塊出現(xiàn)侵染癥狀[4]，說明采集的菌株均為黑斑病病原菌，然后選擇致病力強(qiáng)且產(chǎn)孢量多的菌株WHHB1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 黑斑病病原菌發(fā)病條件確定研究

研究結(jié)果表明，豆芽培養(yǎng)基是產(chǎn)孢最佳的培養(yǎng)基；菌株在15℃培養(yǎng)時(shí)孢子萌發(fā)率最高，在0℃時(shí)萌發(fā)率最低；在第4～7天菌絲生長較快，第10～13天菌絲生長較慢；菌株在日光燈照射下培養(yǎng)2 h產(chǎn)孢量增多，照射培養(yǎng)24 h產(chǎn)孢量減少。該結(jié)論對(duì)生產(chǎn)中黑斑病的發(fā)病侵染控制有一定的參考作用，生產(chǎn)田間若有黑斑病發(fā)生，而此時(shí)溫度在15℃左右，則侵染的第4～7天是發(fā)病最快的時(shí)間段，應(yīng)在此期對(duì)黑斑病進(jìn)行預(yù)防和控制，效果較佳[5]。

2.3 抗性種質(zhì)篩選

選擇30 d苗齡、健壯且長勢(shì)一致的蘿卜植株，取其第3、4片真葉，選擇濃度為1.0×105個(gè)孢子/mL的菌株孢子懸浮液噴霧接種于離體葉片，在室內(nèi)溫度25～30℃，保濕5 d后調(diào)查病情指數(shù)。

按0～9級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行發(fā)病程度調(diào)查。0級(jí)：無癥狀；1級(jí)：接種葉生褐色小點(diǎn)，無褪綠斑；3級(jí)：接種葉生3 mm以下的褪綠斑，無霉層；5級(jí)：接種葉生3 mm以上的褪綠斑，有極少霉層，病斑不連成片；7級(jí)：接種葉生5 mm以上的褪綠斑，有較多的霉層，病斑連成片；9級(jí)：接種葉病斑連成片，大面積枯死，霉層明顯。

抗病性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照李樹德[6]的方法：免疫（I）：病情指數(shù) 0；高抗（HR）：0.1≤病情指數(shù)≤11.11；抗病 （R）：11.12≤ 病 情 指 數(shù) ≤33.33； 中 抗 （MR）：33.34≤病情指數(shù)≤55.55；感?。⊿）：55.56≤病情指數(shù)≤77.77；高感（HS）：77.78 以上。

由表1可見，13份高代自交系有1份抗病材料，6份中抗材料，其他6份均為感病材料。

3 蘿卜根腫病抗病育種相關(guān)基礎(chǔ)研究

病原菌為沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的根腫病4號(hào)生理小種。所有材料均用根腫病4號(hào)生理小種接種，子葉期至1葉期以2×107個(gè)孢子/mL的濃度灌根接種幼苗，接種后第6周調(diào)查發(fā)病情況。

蘿卜抗根腫病病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：無根瘤；1級(jí)；須根上有幾個(gè)零散的小根瘤；3級(jí)：有較大根瘤，且癥狀明顯；5級(jí)：主要根系上有較多聚集根瘤。

由表2可見，后續(xù)試驗(yàn)初步定為露頭青、喜諾青為感病備選材料；白將軍、217早太郎、石莊白、美儂為抗病備選材料。

另利用灌根法對(duì)種質(zhì)資源及59份品種篩選，其中有31份材料抗病，可為后續(xù)抗性資源作儲(chǔ)備。

表1 13份高代自交系抗WHHF和抗WHHB1菌株接種后48 h病情指數(shù)

4 討論與結(jié)論

①在蘿卜抗黑腐病篩選方法上，針對(duì)噴霧接種、剪葉接種、葉柄注射接種和蘿卜塊涂抹接種均進(jìn)行了試驗(yàn)，每種方法各有所長，也各有缺陷。噴霧接種最接近大田自然發(fā)病條件，但若菌原正好從水孔侵入則發(fā)病，未侵入時(shí)不能代表材料不會(huì)感染發(fā)病，發(fā)病不均勻，需多次反復(fù)接種，盡可能使病原菌侵染均勻一致；剪葉接種因剪葉截面積小，菌種濃度控制不均勻，也會(huì)導(dǎo)致發(fā)病不均勻；葉柄注射接種和蘿卜塊涂抹接種因取材部位不同，抗病性有不一致現(xiàn)象，考慮到蘿卜屬于根菜類，進(jìn)行蘿卜塊接種更接近產(chǎn)品器官[1]。研究重點(diǎn)采用蘿卜塊離體涂抹接種進(jìn)行抗性篩選，13份高代自交系篩選結(jié)果為沒有抗病材料，有2份中抗材料，其他為感病和高感材料。結(jié)合田間進(jìn)行抗性種質(zhì)篩選，由于大田環(huán)境因素難以控制，接種后發(fā)病不均勻，且多年多次接種結(jié)果均不一致，不建議采用此方法進(jìn)行接種。

②在蘿卜抗黑斑病篩選方法上，針對(duì)噴霧活體接種、噴霧離體葉片接種和菌餅離體接種均進(jìn)行了試驗(yàn)，每種方法各有所長，也各有缺陷。噴霧接種最接近大田自然發(fā)病條件，且活體存活期長，利于更持久的侵染觀察，但接種需反復(fù)多次，避免接種不均勻而導(dǎo)致發(fā)病不均勻，盡可能使病原菌侵染均勻一致；噴霧離體葉片接種便于控制環(huán)境溫濕度，且接種鑒定周期短，節(jié)省鑒定空間，取樣后種質(zhì)材料可以繼續(xù)生長進(jìn)行田間其他試驗(yàn)或者留種；菌餅離體接種與離體葉片噴霧接種類似，便于控制環(huán)境溫濕度，節(jié)省空間，但與孢子接種不同，菌餅接種更易因菌株產(chǎn)生毒素而侵染離體葉片，需要更多的試驗(yàn)進(jìn)行分析。研究重點(diǎn)采用噴霧離體葉片接種進(jìn)行抗性篩選，13份高代自交系篩選結(jié)果為有1份抗病材料、6份中抗材料、6份為感病材料。本研究結(jié)合田間進(jìn)行抗性種質(zhì)篩選，由于大田環(huán)境因素難以控制，接種后發(fā)病不均勻，且多年多次接種結(jié)果均不一致，不采用此方法進(jìn)行接種。

表2 13份高代自交系抗根腫病篩選結(jié)果

③十字花科根腫病相關(guān)研究很多，研究當(dāng)中直接利用已知的4號(hào)生理小種進(jìn)行篩選，針對(duì)接種方法的篩選前人開展了相關(guān)研究，在此不再贅述，研究當(dāng)中采用的灌根法進(jìn)行接種，獲得的抗、感備選材料進(jìn)行群體構(gòu)建、分子標(biāo)記的開發(fā)。

④研究篩選的抗、感材料，啟動(dòng)了遺傳群體的構(gòu)建工作，結(jié)合表型驗(yàn)證進(jìn)行抗性位點(diǎn)QTL定位，篩選多態(tài)性標(biāo)記，為種質(zhì)資源的分子標(biāo)記輔助育種和種質(zhì)資源創(chuàng)新打下基礎(chǔ)。

[1]甘彩霞，鄧曉輝，袁偉玲，等.武漢蘿卜主產(chǎn)區(qū)十字花科黑腐病病原菌鑒定及蘿卜抗性種質(zhì)篩選[C]//中國園藝學(xué)會(huì)十字花科蔬菜分會(huì)第十二屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，2014：148-153.

[2]呂佩珂，蘇慧蘭，高振江，等.中國現(xiàn)代蔬菜病蟲原色圖鑒[M].內(nèi)蒙古：遠(yuǎn)方出版社，2008：523.

[3]甘彩霞，何云啟，崔磊，等.蘿卜黑腐病苗期抗病性鑒定方法的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（12）：3 057-3 060.

[4]甘彩霞，?；ǎ蘩?，等.蘿卜黑斑病苗期室內(nèi)抗病性鑒定方法研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（19）：4 645-4 647.

[5]甘彩霞，袁偉玲，王晴芳，等.蘿卜黑斑病菌JZHB_7菌株的生物學(xué)特性及培養(yǎng)基的篩選[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（10）：2 312-2 315.

[6]李樹德.中國主要蔬菜抗病育種進(jìn)展[M].北京：科學(xué)出版社，1995.