春蘭與大花蕙蘭雜交種原球莖分化和生根研究

李玉萍+王燕青+武文婷+羅鳳霞

摘 要：以春蘭‘紫萼×大花蕙蘭‘日本綠雜交種原球莖和無根幼苗為材料研究了NAA、6-BA和GA3對雜交種芽苗分化以及NAA、IBA、香蕉泥對壯苗生根的影響。結(jié)果表明：（1）在培養(yǎng)基中添加外源激素可促進原球莖分化，當6-BA和NAA濃度比為4～5∶1 時分化效果最好；當培養(yǎng)基含有較高或適宜濃度的生長素時，添加赤霉素會抑制原球莖的生長、分化；雜交種原球莖分化芽苗最適宜培養(yǎng)基為N6+NAA0.2 mg·L-1 +6-BA 1 mg·L-1。（2）NAA對生根率、生根數(shù)、根長影響均達極顯著水平；IBA對生根率、根長影響不顯著，僅對生根數(shù)有一定促進作用；香蕉泥對生根數(shù)影響不顯著，但對生根率、根長影響都達極顯著水平，壯苗生根最佳培養(yǎng)基為N6+NAA0.2 mg·L-1+ IBA0.5 mg·L-1+香蕉泥50 mg·L-1。

關鍵詞：春蘭；大花蕙蘭；原球莖；分化；生根

中圖分類號：S682.31 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.08.032

春蘭（Cymbidium goeringii （Reichb. f.） Reichb. f.）是蘭屬中的小花型地生蘭種類，其株型較小，葉長一般20～40 cm；花葶直立，高2～15 cm，花常單生，直徑4～5 cm；花色以淺黃綠色為常見，常具宜人的清香。大花蕙蘭（C. hybridum）通常是指蘭屬中原產(chǎn)于印度、緬甸、泰國、越南和我國西南部等地區(qū)的一部分附生性較強的大花種類及以這些原種為親本獲得的人工雜交種[1-2]， 其株型、花型碩大，色澤艷麗豐富，花瓣圓闊豐滿，開花數(shù)目多而花期長。雜交育種是蘭花育種最重要的方法，利用該方法已培育出10萬多個洋蘭新品種。中國蘭與大花蕙蘭雜交培育而成的新品種既有大花蕙蘭的花大色艷的優(yōu)點，又彌補了大花蕙蘭無香味、株型過大、抗性較差等缺點。但其種子十分細小，種子內(nèi)的胚通常發(fā)育不完全，且?guī)缀鯚o胚乳，在自然條件下很難萌發(fā)，現(xiàn)代育種多采用離體胚培養(yǎng)[3-6]。本試驗采用多因素正交試驗，從基本培養(yǎng)基以及外源激素種類及其濃度等方面探討了春蘭與大花蕙蘭雜種原球莖分化和生根的培養(yǎng)基，旨在為春蘭與芳香型大花蕙蘭雜交育種提供基礎。

1 材料和方法

1.1 雜交種原球莖分化

以春蘭‘紫萼×大花蕙蘭‘日本綠雜交種增殖后所得的大小相同、長勢一致的原球莖為外植體，以N6為基本培養(yǎng)基，對NAA、6-BA和GA3進行3因素3水平的L9（33）正交試驗（表1）。每處理接種30個原球莖，重復3次，各因素水平見表1。接種60 d后統(tǒng)計芽苗分化情況。芽苗高度大于1 cm記錄為分化苗，幼苗分化率=分化成苗數(shù)/接種原球莖數(shù)×l00%。

1.2 雜交種壯苗生根

以分化的株高約2～3 cm，有2～3枚幼葉，生長健壯、長勢均勻的組培苗，進行壯苗生根培養(yǎng)。以N6為基本培養(yǎng)基，分別添加NAA、IBA、香蕉泥構成L9（33）正交試驗。每處理接種30株，重復3次，各因素水平見表2。待幼苗生長60 d后對其統(tǒng)計生根情況：生根率、平均生根數(shù)和平均根長。生根率=（生根苗數(shù)/接種苗數(shù)） × l00%，平均生根數(shù)=總根數(shù)/生根苗數(shù)，平均根長=總根長/生根苗數(shù)。

以上各培養(yǎng)基每升加入蔗糖20 g，瓊脂8 g，調(diào)節(jié)pH值到5.4，121 ℃高溫滅菌25 min。培養(yǎng)環(huán)境為溫度（25士2） ℃，光照12 h·d-1，光強2 000 Lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 原球莖分化

原球莖接種30 d后，開始萌發(fā)出不定芽（圖1），接種60 d后（圖2）對芽苗分化情況的統(tǒng)計見表3。對表3的統(tǒng)計結(jié)果利用SPSS軟件進行方差分析（表4），結(jié)果表明，GA3對原球莖分化芽苗的影響達到極顯著水平（P<0.01），6-BA對原球莖分化影響顯著（P<0.05），NAA對原球莖分化影響不顯著。分別對3因素進行多重比較，結(jié)果見表5。

對正交試驗9個處理進行多重比較，結(jié)果如圖3。由圖3可知，C4與C5之間差異極顯著，C5幼苗分化率最高，達到38.17%，C4分化率最低，僅有14.6%，表明在培養(yǎng)基中添加的GA3和6-BA的比例不同，對原球莖分化將產(chǎn)生極大的影響。C1與C5差異不顯著，且分化率相差較小，表明培養(yǎng)基中添加NAA對原球莖分化幼苗的影響較小。

方差分析結(jié)果表明，影響原球莖分化的主導因素為c因素，次要因素是b因素。由表5可知，b、c因素最佳組合為b2c1，即原球莖分化效果最佳的外源激素組合為6-BA mg/L +GA30 mg·L-1。a因素3水平之間差異不顯著，試驗過程中本著操作方便、節(jié)省開支等原則選取分化率最高的濃度，即第2水平。因此，3種外源激素的最佳組合為a2b2c1，此組合處理與C5相一致，即原球莖分化的最佳培養(yǎng)基為N6+NAA0.2 mg·L-1 +6-BA 1 mg·L-1。

2.2 壯苗生根

將分化的雜交小苗轉(zhuǎn)接到各生根培養(yǎng)基25 d后，部分小苗基部開始長出1個或2個淡綠色小圓點，即開始根的分化，7 d后小圓點可伸長形成白色或淡綠色的根。培養(yǎng)60 d后，得到不同生根效果的植株（圖2），對其生根率、平均生根數(shù)、平均根長等統(tǒng)計結(jié)果見表6。對幼苗生根各指標進行SPSS方差分析（表7），結(jié)果顯示，NAA對生根率、平均生根數(shù)、平均根長影響極顯著；IBA僅對平均生根數(shù)有顯著影響，但對生根率、平均根長影響不顯著；香蕉泥對生根率和平均生根數(shù)都有極顯著影響，對平均根長影響不顯著。

方差分析的結(jié)果表明，處理總效應達極顯著水平。對9個處理進行多重比較，結(jié)果見表8。由表8可知，D1～D6培養(yǎng)基的生根率高于D7～D9，表明生根培養(yǎng)基組合添加一定量的NAA會促進蘭花雜交幼苗根發(fā)生，但高濃度的NAA會抑制生根。生根率最高的培養(yǎng)基為D6，生根率達到95.56%，其次是D4，生根率達到94.44%。培養(yǎng)基D4與D6之間差異不顯著，但二者與D5差異均達顯著水平，說明培養(yǎng)基組合添加一定量的香蕉泥能促進生根。平均根數(shù)最多的處理為D3，其次是D4、D6，三者差異不顯著。D6處理的平均根長最長，達9.13 cm，與其他處理之間差異極顯著。綜合壯苗生根的3個指標，生根效應最好的培養(yǎng)基為D6，即N6+NAA0.2 mg·L-1+IBA0.5 mg·L-1+香蕉泥50 mg·L-1。

分別對影響生根性狀的3因素進行多重對比，結(jié)果見表9。由表9可知，a因素是影響生根各指標的主要因子，a1、a2與a3的生根效果差異極顯著，a2與a1對平均根長的影響差異極顯著，以均值分析，a因素生根最優(yōu)水平為a2，即0.2 mg·L-1 的NAA。c因素是影響生根率和平均生根數(shù)的主導因子，c2與c3之間差異不顯著，但與c1之間差異極顯著，因此c因素的最優(yōu)水平為c2或c3。b因素僅是影響平均生根數(shù)的次要因素，多重比較結(jié)果表明b3水平最優(yōu)。因此，3因素的最佳組合為a2b3c2 或a2b3c3，前者與試驗設計的D6培養(yǎng)基相符。由此可推斷春蘭‘紫萼×大花蕙蘭‘日本綠雜交幼苗誘導生根的最佳培養(yǎng)基為N6+NAA0.2 mg·L-1+ IBA0.5 mg·L-1+香蕉泥50 mg·L-1。

3 結(jié)論與討論

3.1 原球莖分化芽苗

組培研究中，植物器官的分化決定于其體內(nèi)所含生長素和細胞分裂素的比例，6-BA、GA3等可有效誘導不定芽的發(fā)生和增殖，而低濃度的NAA與適宜濃度的細胞分裂素配合能促進莖的伸長。谷祝平等[7]報道較低濃度6-BA可促進大花蕙蘭原球莖分化，魯雪華等[8]報道附加0.5 mg·L-1 6-BA和0.1 mg·L-1 NAA的MS培養(yǎng)基對墨蘭根狀莖分化成苗的影響很大。本研究結(jié)果表明，6-BA對原球莖分化影響達顯著水平，而NAA對原球莖分化的影響不顯著。這與魯?shù)蟍3]在研究春劍×大花蕙蘭雜交種原球莖分化時的結(jié)果相一致。王豐妍等[9]在研究大花蕙蘭與國蘭雜種原球莖分化時發(fā)現(xiàn)6-BA 和 NAA 的濃度配比為 4～5∶1 時分化效果最好，本研究結(jié)果與其相近，研究中發(fā)現(xiàn)原球莖分化效果最佳的激素配比組合為1 mg·L-1 6-BA +0.2 mg·L-1 NAA，即5∶1的比例。

此外，王豐妍[10]研究認為GA3對誘導原球莖分化影響效果較好，當其濃度為 1.0 mg·L-1 時分化出的芽數(shù)最多，但分化出來的幼苗細，長勢弱。本研究中亦證明了GA3對原球莖分化影響達極顯著水平，但對分化率的影響是負效應，培養(yǎng)基中不加GA3時分化率最高，隨GA3濃度升高，分化率反而降低。這可能是因為赤霉素（GA3）引起了植物內(nèi)源激素的變化。赤霉素雖可以加速細胞伸長而促進不定芽的發(fā)生，但一定濃度的赤霉素也會使植物體內(nèi)生長素的含量有較大提高，如果培養(yǎng)基中已含的生長素濃度適宜或相對較高，則添加赤霉素而引起的生長素的增加反而會抑制原球莖的生長、分化等。

3.2 壯苗生根

原球莖在分化芽苗階段雖會萌發(fā)產(chǎn)生根而形成幼苗，但由于其所生根長度過短或生根數(shù)過少而容易導致煉苗移栽時難以成活，因此篩選適宜的生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)是非常必要的。陳著瑛等[11]認為生根壯苗時可適當提高NAA用量，降低或去除6-BA，效果更好。魯?shù)蟍3]在研究中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中附加0.1 mg·L-1 NAA有利于根的萌發(fā)和生長，在此基礎上添加0.5 g·L-1 AC可獲得較多根數(shù)，但根長卻最短，添加1 g·L-1 AC，獲得的根長最長。王利民[12]在研究中發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基和較高的NAA濃度，對于苗高和根的粗度生長最為有利。本研究結(jié)果表明，NAA對生根率、生根數(shù)、根長等影響都達極顯著水平，IBA對生根率、根長影響不顯著，僅對生根數(shù)有一定促進作用，這與余道平[13]研究春蘭的生根壯苗培養(yǎng)階段NAA的生根效果好于IBA一致，與梁芳[14]研究雜交蘭生根培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)IBA對生根影響顯著的結(jié)論有所不同，這可能是由不同蘭花材料或不同培養(yǎng)條件所引起的。也有報道稱，生根壯苗時期因幼苗已可自身合成營養(yǎng)物質(zhì)而對天然有機物依賴減少，生根培養(yǎng)基可不添加有機物。本研究結(jié)果表明，香蕉泥雖對生根數(shù)影響不顯著，但對生根率、根長影響都達極顯著水平，因此生根培養(yǎng)基中添加一定濃度的香蕉泥（50或100 mg·L-1）對生根壯苗有一定的促進作用。

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