紅網(wǎng)紋草組織培養(yǎng)外植體消毒方法研究

范諸平+王立雪+張彥妮

摘 要：以紅網(wǎng)紋草的頂芽、葉片、莖段為外植體，對(duì)其進(jìn)行最佳消毒方法的研究。首先以葉片為外植體，篩選最適宜的次氯酸鈉濃度和升汞濃度，即進(jìn)行不同濃度次氯酸鈉（1%，2%，5%）和升汞（0.05%，0.10%，0.15%）的單因素試驗(yàn)。繼而進(jìn)行外植體（頂芽，葉片，莖段）、2%次氯酸鈉消毒時(shí)間（0，5，10 min）、0.10%升汞消毒時(shí)間（0，5，10 min）3因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)。結(jié)果表明：在單因素試驗(yàn)中，適合紅網(wǎng)紋草外植體的次氯酸鈉和升汞濃度分別為2%和0.10%；在正交試驗(yàn)中，莖段與葉片污染率相同，均低于頂芽，但莖段成活率最高，因而為理想的外植體，最佳的消毒方法是將莖段外植體在2%的次氯酸鈉中消毒5 min，再在0.10%的升汞中消毒5 min。此種消毒方法污染率和死亡率最低為0，存活率最高為100%，是適宜紅網(wǎng)紋草的最佳消毒方式。

關(guān)鍵詞：紅網(wǎng)紋草；組織培養(yǎng)；消毒方法；正交試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)：S682.39 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.08.029

紅網(wǎng)紋草（Fittonia verschaffeltii）是爵床科草本植物，葉脈紅色網(wǎng)紋狀，耐陰濕、喜溫暖，是一種珍貴的室內(nèi)觀葉植物[1]。主要以扦插或分株法進(jìn)行繁殖，因北方地區(qū)冬季氣溫低不易發(fā)根，只能在春、夏兩季育苗。由于常規(guī)方法受季節(jié)影響較大，且繁殖速度太慢，不能滿(mǎn)足市場(chǎng)需要[2]，因而可利用組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)紅網(wǎng)紋草的快速繁殖。

由于紅網(wǎng)紋草莖段部位有較多纖毛，且葉背脈絡(luò)較深，這為其組織培養(yǎng)中的外植體消毒帶來(lái)一定困難，而有效的消毒方法是組織培養(yǎng)成功的前提和保障。不同植物材料、不同部位其消毒試劑和消毒時(shí)間不盡相同[3]。盡管近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)開(kāi)展了一些關(guān)于網(wǎng)紋草屬的組織培養(yǎng)研究[1-2，4-9]，但僅局限于白網(wǎng)紋草[1-2，4-8]，關(guān)于紅網(wǎng)紋草的組織培養(yǎng)研究?jī)H有1篇[9]，尚未見(jiàn)關(guān)于紅網(wǎng)紋草組織培養(yǎng)消毒方法的研究報(bào)道。本研究旨在篩選適宜紅網(wǎng)紋草組織培養(yǎng)的外植體、消毒試劑和消毒時(shí)間，為紅網(wǎng)紋草組織培養(yǎng)的無(wú)菌操作提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料紅網(wǎng)紋草購(gòu)自哈爾濱市花卉市場(chǎng)，選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的頂芽、葉片、莖段為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的預(yù)處理 將剪好的外植體盛裝于小燒杯中，先用洗衣粉水沖洗10 min，再用流水沖洗10 min，直至小燒杯中的洗衣粉泡沫沖洗殆盡。

在超凈工作臺(tái)上，將洗好的外植體移入已消毒的空瓶中，用75%的酒精浸泡30 s，不斷搖晃容器使外植體充分接受酒精的殺菌作用。倒出酒精，倒入無(wú)菌水涮洗1次，然后按試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求對(duì)外植體進(jìn)行不同消毒試劑、不同時(shí)間的浸泡消毒。若消毒試劑為次氯酸鈉，則用無(wú)菌水沖洗3次；若消毒試劑為升汞，則用無(wú)菌水沖洗5次，以充分消除殘余升汞對(duì)外植體產(chǎn)生愈傷組織的抑制作用。

將已消毒的外植體置于鋪有無(wú)菌濾紙的超凈工作臺(tái)上，使其充分吸收外植體表面的水分。剪掉頂芽外植體形態(tài)學(xué)下端與消毒試劑接觸的部位，再將其剪成1 cm左右的小段；剪掉莖段外植體兩端與消毒試劑接觸的部分，再剪成1 cm左右的小段；剪掉葉片外植體四周與消毒試劑接觸的部分，再剪成1 cm2左右的小塊。將3種外植體接種于MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（添加7.8%瓊脂、25 g·L-1蔗糖）上，調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.0。培養(yǎng)室溫度25 ℃，光照強(qiáng)度3 000 lx，光照時(shí)間16 h·d-1。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 篩選次氯酸鈉和升汞的最適濃度：以紅網(wǎng)紋草葉片為外植體，設(shè)置次氯酸鈉1%，2%，5%和升汞0.05%，0.10%，0.15% 3個(gè)濃度水平的6組處理，每組處理均消毒10 min，每個(gè)處理30瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次。30 d后，統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率，篩選出最適合紅網(wǎng)紋草的次氯酸鈉和升汞濃度。

1.2.3 L9（34）正交試驗(yàn) 篩選適宜的消毒試劑和消毒時(shí)間：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行外植體（頂芽、葉片、莖段）、2%次氯酸鈉消毒時(shí)間（0，5，10 min）、0.10%升汞消毒時(shí)間（0，5，10 min）3因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)[3]。按照表1、表2共進(jìn)行9個(gè)處理，每個(gè)處理30瓶，每瓶1個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次。30 d后，統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率、成活率，進(jìn)而探究出紅網(wǎng)紋草外植體的最佳消毒方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft excel軟件制表，統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率和成活率，利用SPASS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，利用鄧肯氏多重比較（Duncans multiple-range test）檢驗(yàn)其顯著性，P >0.05為變化不顯著，P <0.05為變化顯著，P <0. 01為變化極顯著[10]。

污染率=×100%；

死亡率=×100%；

成活率=×100%；

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 次氯酸鈉適宜濃度 在污染率、成活率指標(biāo)上，不同濃度的次氯酸鈉處理之間差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。將外植體分別用1%，2%，5%的次氯酸鈉處理10 min，培養(yǎng)30 d后，進(jìn)行觀察與統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表3。當(dāng)次氯酸鈉濃度為2%時(shí)，其污染率為3組中最低值（33.3%），成活率為3組中最高值（66.7%），其消毒效果最佳。當(dāng)次氯酸鈉濃度降低至1%時(shí)，其污染率增加，且成活率降低；當(dāng)次氯酸鈉濃度升高至5%時(shí)，其污染率與成活率均降低。由此可見(jiàn)，2%的次氯酸鈉污染率最低，能保證較高的成活率，是適合于紅網(wǎng)紋草的最佳消毒濃度。

2.1.2 升汞適宜濃度 在污染率、成活率指標(biāo)上，不同濃度的升汞處理之間差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。將外植體分別用0.05%，0.10%，0.15%的次氯酸鈉處理10 min，培養(yǎng)30 d后，進(jìn)行觀察與統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表4。經(jīng)縱向比較可以看出當(dāng)升汞濃度為0.10%時(shí)，其污染率為3組中最低值（46.7%），成活率為3組中最高值（53.3%），其結(jié)果為最佳。當(dāng)升汞濃度降低至0.05%時(shí)，其污染率上升，成活率隨之下降；當(dāng)升汞濃度升高至0.15%時(shí)，雖然污染率相比較0.05%的升汞處理低，但成活率也處于較低水平。原因是升汞不易去除，高濃度的升汞殘留在外植體表面對(duì)其造成毒害作用致其死亡。由此可見(jiàn)，0.10%的升汞污染率最低，且對(duì)植物的毒害作用相對(duì)較小，能保證較高的成活率，是適合于紅網(wǎng)紋草的最佳消毒濃度。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 不同外植體的消毒效果 方差分析結(jié)果表明（表5），在死亡率、成活率兩個(gè)指標(biāo)上，不同外植體的消毒效果之間差異極顯著（P<0.01）?？v向比較可發(fā)現(xiàn)，葉片和莖段的污染率均低于頂芽，但莖段較葉片死亡率低且成活率高。顯然，以莖段作為紅網(wǎng)紋草的外植體是最佳選擇。

2.2.2 次氯酸鈉不同消毒時(shí)間的消毒效果 方差分析結(jié)果表明，在污染率、死亡率、成活率3個(gè)指標(biāo)上，次氯酸鈉不同消毒時(shí)間的消毒效果都差異極顯著（P<0.01）。在污染率指標(biāo)上，消毒時(shí)間0 min最高（表6），達(dá)到53.3%，消毒時(shí)間延長(zhǎng)5 min，污染率明顯下降，達(dá)到15.6%，下降約37.7%。但當(dāng)消毒時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)5 min，污染率略有上升，猜測(cè)是紅網(wǎng)紋草與次氯酸鈉的化學(xué)反應(yīng)所致，但仍待進(jìn)一步研究考證。當(dāng)消毒時(shí)間延長(zhǎng)至10 min時(shí)，由于次氯酸根的強(qiáng)氧化性致試驗(yàn)材料邊緣白化以致死亡，死亡率高達(dá)43.3%，顯著高于其他兩個(gè)處理，造成試驗(yàn)材料的浪費(fèi)。由此可見(jiàn)，次氯酸鈉的最佳消毒時(shí)間為5 min。

2.2.3 升汞不同消毒時(shí)間的消毒效果 方差分析結(jié)果表明，在污染率、死亡率、成活率3個(gè)指標(biāo)上，升汞不同消毒時(shí)間的消毒效果差異極顯著（P<0.01）。在污染率指標(biāo)上，消毒時(shí)間為0 min時(shí)最高（表7），達(dá)到48.9%，消毒時(shí)間延長(zhǎng)5 min，污染率明顯下降，達(dá)到21.1%，下降約27.8%。消毒時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)5 min，雖然污染率得到有效控制，但死亡率顯著上升，上升約37.8%，達(dá)到42.2%，顯著高于其他兩個(gè)處理。猜測(cè)由于植物材料長(zhǎng)時(shí)間浸潤(rùn)于升汞中，使升汞殘留外植體表面造成植物的重金屬中毒。由此可見(jiàn)，當(dāng)升汞的消毒時(shí)間為5 min時(shí)，能保證較低的污染率和死亡率，是理想的消毒時(shí)間。

2.2.4 正交試驗(yàn) 9個(gè)不同處理的消毒效果 方差分析結(jié)果表明（表8），正交試驗(yàn)中9個(gè)不同處理污染率、死亡率、成活率3個(gè)指標(biāo)差異極顯著（P<0.01）。經(jīng)比較，在污染率和死亡率指標(biāo)上，處理2均為最低值0，且其存活率達(dá)100%。在其余8組處理中，處理3的污染率也較低，但其死亡率處于最高水平73.3%，且存活率為最低水平20.0%，易造成植物材料的浪費(fèi)。處理4～9中，污染率波動(dòng)幅度不大，死亡率除處理4為0外，其余處理均相差不大，且在這6組中，處理4存活率最高也僅為63.3%，與處理2相比還有很大差距。由此可見(jiàn)，處理2（A1B2C2：次氯酸鈉處理5 min，升汞處理5 min）的污染率、死亡率最低，成活率最高，是適合紅網(wǎng)紋草的外植體消毒方法。

3 結(jié)論與討論

3.1 外植體的選取

保證無(wú)菌是組織培養(yǎng)成功的前提和后續(xù)試驗(yàn)?zāi)軌蝽樌_(kāi)展的基礎(chǔ)，由于不同的外植體外部形態(tài)不同，因而消毒方式和消毒效果不盡相同。試驗(yàn)結(jié)果表明，莖段較頂芽和葉片污染率、死亡率較低，成活率較高，且較易產(chǎn)生愈傷組織，消毒效果較好，因而為理想的外植體。

葉片消毒效果較差可能與葉片上纖毛較多、葉背的網(wǎng)脈較深，以致消毒試劑難以深入有關(guān)。頂芽是植物最幼嫩的組織器官，所攜帶的微生物量比其他器官組織相對(duì)較少，但因其過(guò)于幼嫩，又極易被殺死，難以實(shí)現(xiàn)污染率和死亡率的同時(shí)降低[3]。不同外植體的消毒效果不同，還可能與不同基因在不同外植體的選擇性表達(dá)、不同外植體經(jīng)過(guò)消毒后產(chǎn)生的次生物質(zhì)不同有關(guān)[11]?？傊蜉^復(fù)雜，尚需進(jìn)一步試驗(yàn)和研究。

此外還發(fā)現(xiàn)，在相同激素配比的培養(yǎng)基中，不同的外植體產(chǎn)生的愈傷組織形態(tài)不同。以葉片為外植體時(shí)，在葉片邊緣和葉脈處產(chǎn)生白色愈傷組織；以莖段為外植體時(shí)，其形態(tài)學(xué)下端膨大產(chǎn)生綠色愈傷組織，莖節(jié)處芽萌發(fā)形成嫩葉；以頂芽為外植體時(shí)，頂芽下端亦膨大產(chǎn)生綠色愈傷組織（圖1）。原因可能為相同的外界條件下，基因在不同部位的外植體選擇性表達(dá)而產(chǎn)生不同的愈傷組織，仍需進(jìn)一步試驗(yàn)探究。

3.2 消毒試劑的選用和消毒時(shí)間的選擇

由于基因的選擇性表達(dá)，使得不同外植體的外部形態(tài)不同，因而消毒效果不盡相同。試驗(yàn)結(jié)果表明，最適宜紅網(wǎng)紋草的消毒方式組合為A1B2C2，即將莖段外植體浸于75%的酒精中消毒30 s，倒出酒精，倒入無(wú)菌水沖洗1次，再在2%的次氯酸鈉中消毒5 min，倒出次氯酸鈉并用無(wú)菌水沖洗3次，繼而在0.10%的升汞中消毒5 min，倒出升汞并用無(wú)菌水沖洗5次。此消毒方法的污染率和死亡率最低，存活率最高，是最適合紅網(wǎng)紋草的消毒方式。

消毒試劑和消毒時(shí)間的選擇尤為重要。在眾多消毒試劑中，本試驗(yàn)采用次氯酸鈉和升汞進(jìn)行外植體的消毒，選擇適宜的時(shí)間，能夠保證較低的污染率和死亡率，是較為理想的消毒試劑。消毒的同時(shí)，消毒劑會(huì)破壞外植體的細(xì)胞，細(xì)胞出于自我保護(hù)，不斷地產(chǎn)生大量次生物質(zhì)，若消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)引起細(xì)胞毒害，導(dǎo)致外植體褐變甚至死亡； 若消毒時(shí)間過(guò)短，外植體則會(huì)因消毒不徹底，而導(dǎo)致高污染率[12]。因而合理的消毒時(shí)間和消毒試劑是紅網(wǎng)紋草外植體良好消毒效果的保證。

由圖2可看出，在單因素試驗(yàn)中，相同的培養(yǎng)基濃度和消毒時(shí)間，單獨(dú)采用升汞消毒的外植體產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間顯著長(zhǎng)于次氯酸鈉，約長(zhǎng)8 d。原因可能為升汞殘留造成外植體內(nèi)部的一系列生理變化，延遲愈傷組織產(chǎn)生時(shí)間。

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