應(yīng)用熒光微球檢測禽流感病毒的初步研究

楊麗麗+王曉娥+李占東

摘 要：高分子熒光微球是一種性能良好的蛋白質(zhì)載體，因可連接多種生物活性物質(zhì)而便于多參數(shù)分析等，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛使用。本研究將聚苯乙烯微球作為蛋白質(zhì)載體，建立一種新的檢測禽流感病毒的血清學(xué)方法。結(jié)果表明，微球與單克隆抗體、抗原、多克隆抗體和熒光二抗形成了雙夾心的微球復(fù)合物，建立了禽流感病毒定量免疫診斷的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：禽流感病毒；熒光微球；檢測

中圖分類號：S852.64 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.

禽流感（Avian influenza，AI）是由甲型流感病毒引起的一種人畜共患的傳染性疾病綜合征。根據(jù)致病性的不同，禽流感可分為高致病性、低致病性和非致病性三級，是危害養(yǎng)殖業(yè)的最重要的疾病之一[1]。高致病性禽流感（High pathogenic avian influenza，HPAI）被世界動物衛(wèi)生組織列為動物傳染病中的A類疫病[2]，在世界范圍內(nèi)具有重要的防疫性和檢疫性。禽流感病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有病毒的分離與鑒定、血清學(xué)診斷技術(shù)[3-5]、分子生物學(xué)診斷技術(shù)[6-9]、電鏡技術(shù)等。新近發(fā)展起來的熒光微球因其材料不同而種類很多，由早期的聚苯乙烯微球，到后來出現(xiàn)的多種材料的高分子微球，如聚丙烯酸脂、二氧化硅、聚多糖類、聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡啶等類型，其中聚苯乙烯微球目前仍被廣泛應(yīng)用[10-11]。以微球?yàn)檩d體，建立了基于熒光微球的流式細(xì)胞術(shù)檢測方法。熒光微球穩(wěn)定性好、粒度均一、單分散性好，其球形表面的弧度使抗體結(jié)合位點(diǎn)的暴露面與抗原決定簇處于最佳的反應(yīng)狀態(tài)，既使發(fā)光效率穩(wěn)定高效又提高了反應(yīng)的靈敏度，因而在生物醫(yī)學(xué)、食品安全、分析化學(xué)以及某些高新技術(shù)領(lǐng)域都有著很重要的應(yīng)用[12-13]。本研究是在高分子熒光微球、免疫熒光技術(shù)與流式細(xì)胞術(shù)等試驗(yàn)原理基礎(chǔ)上建立的一種新型免疫學(xué)試驗(yàn)方法。

1 材料和方法

1.1 試 劑

紅色熒光微球：（Spherotech，Inc）直徑為4.0 μm，108個(gè)·mL-1；EDC[1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）-碳二亞胺]：購自美國SIGMA公司；NHS（N-羥基琥珀酸亞胺）：購自美國SIGMA公司；禽流感H5亞型單克隆抗體購自揚(yáng)州大學(xué)；禽流感H5亞型基因工程表達(dá)抗原購自揚(yáng)州大學(xué)；禽流感病毒多克隆抗體由本研究組自行研制；FITC標(biāo)記的羊抗小鼠熒光抗體：購自SIGMA公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔熒光抗體：購自SIGMA公司；0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（PBS）：pH=7.4；家兔：購自白求恩醫(yī)大試驗(yàn)動物中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 兔抗禽流感抗體的制備及純化 多克隆抗體制備的免疫方法采用背部多點(diǎn)注射法。選取兩只成年公兔，注射禽流感H5亞型滅活疫苗每只1 mL。免疫3次后，測定抗體的效價(jià)。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到210以上時(shí)，心臟采血分離血清。將血清純化、濃縮后測定蛋白含量至1 mg·mL-1以上，分裝后置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 ELISA法確定抗體與抗原的匹配性 應(yīng)用PBS緩沖液將單克隆抗體稀釋成10，5.0，2.5，1.0 μg·mL-1后，于96孔ELISA酶標(biāo)板縱行包被，放置在4 ℃冰箱過夜，洗滌后加入1%的封閉液BSA，恒溫37 ℃封閉1 h，洗滌3次后加入1∶10稀釋的禽流感H5亞型表達(dá)抗原，放置37 ℃1 h，取出后洗滌。酶標(biāo)板中加入5 μg·mL-1的兔抗禽流感抗體，放置37 ℃ 1 h，洗滌后加入稀釋的酶標(biāo)羊抗兔IgG二抗，放置37 ℃1 h，洗滌后加入臨時(shí)配制的底物溶液，顯色反應(yīng)15 min，于反應(yīng)孔中加入2 mol·L-1硫酸終止反應(yīng)。450 nm波長下測定OD值。陰性對照同時(shí)進(jìn)行。以此確定單克隆抗體和多克隆抗體與抗原是否匹配。

1.2.3 單克隆抗體的固定 取1 μL直徑為4.0 μm羧基熒光微球原液，加入EDC和NHS溶液活化30 min，用pH值7.4的PBS緩沖溶液離心洗滌已活化的微球，加入100 μL禽流感H5亞型單克隆抗體與微球連接，放置搖床于室溫振蕩2 h。充分離心洗滌后加入含有1%BSA的100 μL PBS溶液，室溫振蕩2 h后放置在4 ℃冰箱過夜，以此阻斷微球表面的未反應(yīng)位點(diǎn)。

1.2.4 微球雙夾心法的流式測定 將連接了單克隆抗體的微球離心洗滌后置于100 μL的PBS溶液中。將一定量的禽流感陽性抗原加入，放置于室溫振蕩2 h。離心洗滌微球以去除未反應(yīng)的陽性抗原。再加入一定量的禽流感多克隆抗體，放置于室溫振蕩2 h。將微球充分離心洗滌使未反應(yīng)的抗體去除。最后加入一定量的FITC標(biāo)記的羊抗兔熒光抗體，置搖床室溫振蕩2 h。離心洗滌3次，去除未反應(yīng)的羊抗兔熒光抗體。重新將微球放于100 μL的PBS溶液中，然后用流式細(xì)胞儀分析測定獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙夾心ELISA篩選結(jié)果

應(yīng)用雙夾心ELISA試驗(yàn)來檢測單克隆抗體和多克隆抗體是否匹配的結(jié)果見表1。重復(fù)3次，設(shè)陰性對照。不同濃度的單克隆抗體所測得的OD值在1.5左右，陰性抗原的OD值平均為0.15，以P/N=2.1為臨界點(diǎn)，即0.16×2.1=0.315為臨界點(diǎn)，測定的OD值大于0.315時(shí)即為陽性，如表1結(jié)果所示，測定的OD值均為陽性，說明單克隆抗體、抗原、多克隆抗體三者相匹配。

2.2 單克隆抗體連接量的確定

將禽流感單克隆抗體用PBS溶液稀釋成不同的濃度后與活化微球連接，洗滌3次后加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠熒光抗體與之反應(yīng)，通過流式細(xì)胞儀檢測的熒光信號強(qiáng)度確定單克隆抗體的最佳工作濃度。當(dāng)FITC綠色熒光信號與微球的紅色熒光信號被同時(shí)檢測出，即達(dá)到了“雙陽性”時(shí)，說明微球與抗體已連接。已連接抗體的微球與微球總數(shù)的比值用連接率表示。結(jié)果如表2所示，當(dāng)單克隆抗體連接濃度為300 μg·mL-1時(shí)，平均連接率達(dá)到 87.6%，因此確定300 μg·mL-1為單克隆抗體的最佳反應(yīng)濃度。

2.3 多克隆抗體最佳反應(yīng)濃度的確定

將活化的熒光微球與最佳濃度單克隆抗體連接后加入1%的BSA進(jìn)行封閉，然后加入過量的抗原與其連接，最后加入不同濃度的多克隆抗體及一定量的FITC標(biāo)記的羊抗兔熒光抗體。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測反應(yīng)體系，當(dāng)微球的紅色熒光信號與熒光抗體的FITC綠色熒光信號被同時(shí)檢測到，即達(dá)到了“雙陽性”時(shí)就可確定多克隆抗體最佳濃度及與微球的連接率。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)多克隆抗體的濃度為150 μg·mL-1時(shí)，平均連接率達(dá)到 87.5%，如圖1所示。

3 結(jié)論與討論

3.1 單克隆抗體與熒光微球的連接

微球表面連接的單克隆抗體數(shù)量的多少與最終檢測信號強(qiáng)度的高低有直接關(guān)系。但是當(dāng)單克隆抗體在微球表面飽和時(shí)，連接率不會隨著單克隆抗體濃度的增加而有所提高。同時(shí)應(yīng)用未活化的微球與一定量的熒光抗體進(jìn)行反應(yīng)，檢測熒光抗體與熒光微球的非特異性結(jié)合能力，試驗(yàn)結(jié)果表明未活化微球與熒光抗體之間無非特異性結(jié)合。由此看來，此方法可以避免非特異性反應(yīng)，優(yōu)于傳統(tǒng)的ELISA 方法。

3.2 連接方式比ELISA方法更穩(wěn)定

微球與單克隆抗體的連接不同于傳統(tǒng)的ELISA方法，ELISA方法是通過單克隆抗體與聚苯乙烯本物理結(jié)合（非特異性吸附），疏水連接的。而基于微球的流式細(xì)胞檢測方法是通過共價(jià)鍵與微球結(jié)合的，非常穩(wěn)定。

3.3 數(shù)據(jù)的讀取與重復(fù)性

在傳統(tǒng)ELISA方法的重復(fù)過程中有很大的變化，并且不同孔之間也有很大的變化。它是一種間接和動態(tài)的方式，在酶的擴(kuò)大效應(yīng)下以顏色的變化量來讀取數(shù)據(jù)，在擴(kuò)大效應(yīng)中容易出現(xiàn)錯誤。流式細(xì)胞術(shù)分析方法的特點(diǎn)是它與傳統(tǒng)的ELISA方法相比更加準(zhǔn)確和敏感。用流式細(xì)胞儀檢測時(shí)，使單個(gè)微球逐個(gè)通過激光器，讀取的是熒光數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)結(jié)果更加直接、敏感、穩(wěn)定。

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