響應面法對忍冬藤總黃酮提取工藝的優(yōu)化

姜寧　劉曉鵬　張俊霞　胡績偉　李力　蔣曉軍　吳皓

摘要：試驗考察了乙醇體積分數(shù)、液固比、提取時間、提取溫度4個因素對忍冬（Lonicera japonica Thunb.）藤總黃酮提取的影響，并采用Box-Behnken試驗優(yōu)化了忍冬藤總黃酮提取工藝。結(jié)果表明，4個因素能顯著影響忍冬藤總黃酮的提取，并優(yōu)化得出最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)91%、液固比42∶1（mL∶g）、80 ℃提取2.7 h，此時總黃酮提取率為5.22%，與理論值5.24%相差不大，表明該工藝可行。

關(guān)鍵詞：忍冬（Lonicera japonica Thunb.）藤；總黃酮；提取；工藝優(yōu)化

中圖分類號：S567.1+9；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2459-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.041

忍冬藤為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥莖枝，分布廣泛，忍冬藤與金銀花為植物忍冬的不同藥用部位，均收載于《中華人民共和國藥典》（一部）[1]。忍冬藤味甘、性寒，具有清熱解毒、通絡(luò)之功效。用于溫病發(fā)熱，瘡癰腫毒，熱毒血痢，風濕熱痹[1]。現(xiàn)代研究表明，忍冬藤具有抗菌作用、抗病毒作用、抗炎作用、保肝作用以及調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[2]。

忍冬藤含有多種化學成分，包括有機酸類、環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類、揮發(fā)油類等成分。有機酸類主要有綠原酸、異綠原酸、咖啡酸、棕櫚酸、馬錢子酸、原兒茶酸等[2]；黃酮類主要有木犀草素、槲皮素、芹菜素、忍冬苷等[3]；環(huán)烯醚萜苷類主要有馬錢子苷、獐牙菜苷、當藥苷等[4]；揮發(fā)油類主要有烷烴、酯類、酮醇苯類化合物[5]。2010年版中華人民共和國藥典將綠原酸、馬錢子苷作為忍冬藤質(zhì)量控制的指標。

黃酮類化合物（Flavonoids）廣泛存在于自然界中，泛指兩個具有酚羥基的苯環(huán)（A環(huán)與B環(huán)）通過中間三碳環(huán)（C環(huán)）相互聯(lián)結(jié)而成的具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的一系列化合物，是許多植物的生物活性成分。其具有廣泛的生理活性，具有抗炎、抗衰老、抗病毒、抗菌、抗癌、抗氧化和增強免疫力等藥理作用[6]。目前針對忍冬藤總黃酮的研究尚不多見。本研究通過考察乙醇體積分數(shù)、液固比、提取溫度和提取時間等因素，采用響應面分析優(yōu)化忍冬藤總黃酮的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

忍冬藤由南京同仁堂洪澤中藥材科技有限公司提供；無水乙醇、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。儀器有紫外可見光分光光度計、多功能粉碎機、離心機、恒溫水浴鍋等。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗

1）乙醇體積分數(shù)。稱取一定量的忍冬藤粉末，分別用50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇對材料進行浸提，液固比30∶1（mL∶g，下同），70 ℃水浴2 h，離心取上清液。測上清液中的總黃酮含量，試驗重復3次并計算提取率。

2）液固比。稱取一定量的忍冬藤粉末，分別按液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1加入80%的乙醇， 70 ℃水浴2 h，然后將浸提液離心取上清測總黃酮含量，試驗重復3次計算提取率。

3）溫度。稱取一定量的忍冬藤粉末，按液固比30∶1加入80%的乙醇，分別于40、50、60、70、80、90 ℃水浴2 h，然后將提取液離心取上清，測其中的總黃酮含量，試驗重復3次并計算提取率。

4）提取時間。稱取一定量的忍冬藤粉末，按液固比30∶1向忍冬藤粉末中加入80%乙醇，水浴溫度為70 ℃，水浴時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，然后離心提取上清，進行總黃酮含量測定，試驗重復3次并計算提取率。

1.2.2 標準曲線的制作 稱取蘆丁標準品0.038 g在120 ℃下干燥至恒重，用30%的乙醇溶解并定容至250 mL，搖勻即得濃度為0.152 mg/mL的標準液。分別吸取上述標準液0、1、2、4、6、8 mL，加入30%乙醇使總體積為12.5 mL，加入0.7 mL的5%亞硝酸鈉搖勻，放置5 min，加入10%硝酸鋁0.7 mL，搖勻，放置6 min，加入1 mol/L氫氧化鈉5 mL，再加30%乙醇至刻度25 mL，搖勻，放置15 min，測510 nm波長處的吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作標準曲線。

1.2.3 Box-Behnken優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Design-Expert 8.0軟件進行Box-Behnken試驗設(shè)計，以乙醇體積分數(shù)、液固比、提取溫度和提取時間為自變量，總黃酮提取率為響應值優(yōu)化忍冬藤總黃酮的提取工藝。試驗因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

圖1A為乙醇體積分數(shù)對忍冬藤總黃酮提取率的影響。由圖1A可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，總黃酮提取率也顯著增加，當乙醇體積分數(shù)增至90%后，黃酮的提取率升高不再顯著。圖1B為液固比對忍冬藤總黃酮提取率的影響，由圖1B可知，液固比較?。?20∶1）時，增加提取液的體積，對總黃酮提取率影響不顯著，當液固比從20∶1增至40∶1時，總黃酮提取率上升極顯著，但當液固比進一步增大時，總黃酮提取率差異不顯著。圖1C為提取溫度對忍冬藤總黃酮提取率的影響，由圖1C可知，溫度較低時，提高溫度對總黃酮的提取率影響較小，但也達顯著水平，隨著溫度的不斷升高，總黃酮提取率極顯著上升，升至80 ℃后，溫度對忍冬藤總黃酮的影響就不再顯著。圖1D為提取時間對忍冬藤總黃酮提取率的影響，由圖1D可知，隨著提取時間的延長，總黃酮的提取率也顯著升高，但當提取時間超過2.5 h后，時間對忍冬藤總黃酮的影響就不再顯著。

2.2 Box-Behnken試驗結(jié)果

2.2.1 回歸方程的建立 Box-Behnken試驗優(yōu)化忍冬藤總黃酮提取工藝的結(jié)果見表2。經(jīng)統(tǒng)計軟件Design-Expert 8.0分析，建立了如下四元二次回歸方程：

R=5.07+0.34A+0.35B+0.28C+0.49D+0.24AB- 0.12AC-0.36AD-0.29BC-0.39BD-0.44CD-0.63A2- 0.56B2-0.26C2-0.39D2

方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，該模型達極顯著水平，失擬項不顯著，說明此模型與實際情況擬合得很好。根據(jù)建立的回歸模型，計算得出當乙醇體積分數(shù)為91%，液固比42∶1，80 ℃提取2.7 h時，總黃酮的提取率最高，理論值為5.24%，按優(yōu)化的工藝條件提取忍冬藤總黃酮，提取率為5.22%，與理論值相差不大，說明該工藝有較強的實用價值。

2.2.2 響應面分析 為了探究各因素之間的交互作用，對Box-Behnken試驗結(jié)果進行了響應面分析（圖2）。由圖2可以看出，當提取溫度和提取時間固定時，隨著乙醇體積分數(shù)和液固比的升高，總黃酮提取率也顯著上升，到達最高值時，又隨著乙醇體積分數(shù)和液固比的上升，提取率顯著下降（圖2a）；當液固比和提取溫度固定時，乙醇體積分數(shù)和提取時間處于較低水平時，總黃酮提取率也較低，乙醇體積分數(shù)和提取時間的增加會使總黃酮的提取率增加，但提取率達到最大值后，又隨著乙醇體積分數(shù)和提取時間的升高總黃酮提取率逐步下降（圖2b）；當固定液固比和提取時間時，乙醇體積分數(shù)和提取溫度處于低水平時，總黃酮的提取率也很低，隨著乙醇體積分數(shù)和提取溫度的增加，總黃酮提取率隨之上升，達到最大值之后，乙醇體積分數(shù)和提取溫度的進一步增加總黃酮提取率反而呈下降趨勢（圖2c）；圖2d結(jié)果表明，液固比和提取時間的交互作用對總黃酮提取率影響顯著，液固比和提取時間處于低水平或高水平時，忍冬藤總黃酮的提取率較低；而液固比和提取溫度的交互作用對總黃酮提取率的影響與乙醇體積分數(shù)和提取溫度的交互作用相似（圖2e）；當固定乙醇體積分數(shù)和液固比時，隨著提取溫度與提取時間的增加，總黃酮提取率也增加，當提取時間和提取溫度進一步增加時，提取率反而下降（圖2f）。

3 小結(jié)與討論

本研究對影響忍冬藤總黃酮提取的4個因素進行單因素試驗，并根據(jù)單因素試驗的結(jié)果確定Box-Behnken的因素和水平，得到最優(yōu)工藝是乙醇體積分數(shù)為91%，液固比42∶1，80 ℃提取2.7 h，這是因為忍冬藤總黃酮在高濃度的乙醇溶液中溶解性較好；液固比增大有利于提高總黃酮細胞內(nèi)外的濃度差從而加大溶出速度，但液固比過大，會造成試劑的浪費和加大提取過程中的損耗；高溫使總黃酮溶出速度加快，但溫度過高會使物質(zhì)不穩(wěn)定；適當?shù)脑黾犹崛r間，會使總黃酮的溶出量增加，但當細胞內(nèi)外總黃酮濃度趨于平衡后，溶出不再增加。當然，乙醇是否是最佳溶劑還有待進一步研究。

參考文獻

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[3] 張 聰，殷志琦，葉文才，等.忍冬藤的化學成分研究[J].中國中藥雜志，2009，34（23）：3051-3053.

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