持續(xù)低流量復灌注對兔睪丸不全扭轉(zhuǎn)細胞凋亡的影響

郭晶晶 俞麗云 黃 美 梁榮喜 陳 舜 何以敉 薛恩生福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和臨床學院，福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院超聲科，福建省超聲醫(yī)學研究所（福州 350001）

持續(xù)低流量復灌注對兔睪丸不全扭轉(zhuǎn)細胞凋亡的影響

郭晶晶 俞麗云 黃 美 梁榮喜 陳 舜 何以敉 薛恩生*
福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和臨床學院，福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院超聲科，福建省超聲醫(yī)學研究所（福州 350001）

摘要目的 研究持續(xù)性低流量復灌注對睪丸不全扭轉(zhuǎn)細胞凋亡的保護作用。方法 實驗分為輕度睪丸缺血組（A組）和中度睪丸缺血組（B組），兩組各分為對照組（分別為AS組和BS組）和后處理組（A1和B1為45s維持組，A2和B2為45s漸增組，A3和B3為30s維持組，A4和B4為30s漸增組）。對照組進行直接復灌注，A1、B1組及A3、B3組分別進行45s和30s的維持相同的低流量復灌注，A2、B2組及A4、B4組分別進行45s和30s的漸增加的低流量復灌注。缺血前與術后3d進行睪丸超聲造影，并檢測睪丸組織Bcl-2相關X蛋白（Bax）、胱門蛋白酶-3 （caspase-3）、凋亡指數(shù)（AI）。結(jié)果 術后3d超聲造影與缺血前比較，A4組及B4組的始增時間（AT）、達峰時間（TTP）、峰值強度（PI）、峰值基礎強度差（PBD）差異比較均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；峰值減半時間（DT/2）縮短，差異具統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。45s漸增組和30s組的AI明顯低于對照組和45s維持組（P＜0.01）。30s組Bax和caspase-3均顯著低于對照組（P＜0.01）。結(jié)論 持續(xù)低流量復灌注對兔輕、中度睪丸不全扭轉(zhuǎn)具有不同程度的保護作用，保護效果與復灌持續(xù)時間和血流增幅有關，以30s漸增低流量復灌保護作用最顯著。

關鍵詞再灌注; 精索扭轉(zhuǎn); 細胞凋亡

睪丸扭轉(zhuǎn)是泌尿外科常見的陰囊急癥，可引起睪丸組織缺血缺氧并造成生精細胞凋亡，故應當盡早恢復血供以避免長時間缺血造成組織壞死，而一次性完全恢復組織血供將引起缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury, IRI）。張國明等[1]證實漸進后處理較間隔缺血后處理更能有效減輕鼠缺血心肌的IRI，但張國明的漸進后處理有再次缺血環(huán)節(jié)，可能對組織造成“二次損傷”，本實驗擬改良漸進后處理模式為可控持續(xù)性低流量復灌注，通過觀察超聲造影、生精細胞凋亡指數(shù)（AI）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）和胱門蛋白酶-3 （caspase-3）等指標，研究進行持續(xù)性低流量復灌注能否對睪丸不全扭轉(zhuǎn)細胞凋亡產(chǎn)生保護作用。

材料與方法

一、實驗動物

76只健康雄性大白兔，體質(zhì)量2.0～3.3kg，平均體質(zhì)量為（2.45±0.16）kg，兔齡17.1～22.6周[（19.7± 1.3）周]，許可證號：SCXR-2008-0002。本動物實驗按照國家《實驗動物管理條例》和《福建省實驗動物管理條例實施細則》執(zhí)行。

二、儀器與方法

（一）儀器與試劑

Acuson sequoia-512彩色多普勒超聲診斷儀，15L8W線陣變頻探頭，選擇小器官睪丸模式，灰階頻率8.0 MHz～14.0MHz，彩色頻率7.0 MHz ～14.0MHz，彩色血流量程調(diào)至0.9cm/s。Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件，Syngo US Workplace超聲造影分析軟件。SonoVue超聲造影劑（意大利Bracco公司），戊巴比妥鈉（上海源葉生物科技有限公司），兔抗兔Bax一抗（武漢博士德生物工程有限公司），兔抗兔caspase-3一抗（北京百邁客生物技術有限公司），KGA7022原位細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物發(fā)展有限公司）等。

（二）動物模型

3%戊巴比妥鈉溶液按1mL/kg對大白兔進行耳緣靜脈麻醉并置留置針。隨機選擇一側(cè)睪丸，暴露精索結(jié)構，在距睪丸上極約1cm處用蛙心管夾對精索進行不全鉗夾，在彩色多普勒超聲監(jiān)測下，使睪丸內(nèi)彩色血流信號面積減少至鉗夾前的50%，制成睪丸血運障礙模型，鉗夾后連續(xù)動態(tài)觀察。當睪丸血流信號減少至鉗夾前的20%～30%時，輕度缺血模型建立成功。當睪丸血流信號減少至鉗夾前的5%～10%時，中度缺血模型建立成功[2]。

（三）實驗分組與方法

76只大白兔隨機分為輕度缺血組（A組，38只）和中度缺血組（B組，38只），依前述方法建立不同缺血程度的睪丸扭轉(zhuǎn)模型。A、B組各分為對照組（AS組和BS組，每組6只）和后處理組（A1和B1為45s維持組，A2和B2為45s漸增組，A3和B3為30s維持組，A4和B4為30s漸增組，每組8只）。成功建立模型后，對照組進行直接復灌注（100%），后處理組通過旋轉(zhuǎn)蛙心管夾螺帽進行不同低流量（25%、50%、75%）復灌注后處理，A1、B1組及A3、B3組各維持45s和30s的25%的血流灌注量后，再完全復灌注。A2、B2組及A4、B4組分別進行45s和30s的逐漸增加血流量的灌注后，再完全復灌注，見圖1。術后各組動物分籠飼養(yǎng)，3d后進行超聲造影并取材檢驗。

圖1 實驗分組與低流量復灌注后處理方式示意圖

（四）標本的檢測

術后3d取約300mg患側(cè)睪丸組織各2份液氮速凍保存，用Western blot法檢測Bax和caspase-3，剩余組織用10%中性福爾馬林緩沖溶液固定24h后行原位細胞凋亡檢測計數(shù)AI。

（五）超聲造影

于缺血前、再灌注前及術后3d分別進行雙側(cè)睪丸超聲造影檢查，設置造影頻率7 MHz，造影增益0dB，機械指數(shù)、熱力指數(shù)0.1，取雙側(cè)睪丸最大橫切面，以0.1mL/kg劑量從耳緣靜脈團注超聲造影劑，對雙側(cè)睪丸造影圖像進行錄影，動態(tài)觀察睪丸內(nèi)造影劑充盈情況。造影錄像用Syngo US Workplace超聲造影分析軟件得出時間-強度曲線（time-intensity urve，TIC），并對比分析患側(cè)睪丸不同階段的超聲造影參數(shù)：始增時間（arrival time，AT）、達峰時間（time to peak，TTP）、峰值強度（intensity to eak，PI）、峰值基礎強度差（peak-base intensity ifference，PBD）、峰值減半時間（DT/2）。

三、實驗數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.5軟件行正態(tài)性檢驗及Lenven方差齊性檢驗后采用單因素方差分析，如P＜0.05則再進行多個均數(shù)間的多重比較（least significant difference，LSD檢驗）。以雙側(cè)P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差別有顯著統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、雙側(cè)睪丸超聲造影

缺血前造影見造影劑向心性強化，各參數(shù)組間比較均無差異（P＞0.05）。再灌注前造影見AT、TTP、DT/2顯著延長，PI、PBD明顯降低（P＜0.01），TIC呈“慢進慢退”型，見圖2。術后3d與缺血前比較，A4組及B4組的AT、TTP、PI、PBD無差異（P＞0.05），DT/2縮短（P＜0.05），各組數(shù)據(jù)見圖3。

圖2 缺血前、再灌注前及術后3d3d雙側(cè)睪丸TICTIC

圖3 術后3d, A3d, A、B組各造影參數(shù)結(jié)果箱式圖

二、術后3d患側(cè)睪丸凋亡指數(shù)

A組中各后處理組AI均明顯低于AS組（P＜0.01），且A2、A3、A4組AI明顯低于A1組（P＜0.01）；B組中各后處理組AI較BS組均顯著降低（P＜0.01），且B2、B3、B4組AI明顯低于B1組（P＜0.01），其中以B4組最低，見圖4、表1。

圖4 術后33dd,, 患側(cè)睪丸生精細胞凋亡光鏡圖（×200）

表1 術后3d, 3d, 患側(cè)睪丸生精細胞凋亡指數(shù)(%%)

三、術后3d3d患側(cè)睪丸BaxBax和caspase-3ase-3蛋白相對含量

A、B組中3、4組的B a x均顯著低于對照組（P＜0.01）；A、B組中各后處理組caspase-3均顯著低于對照組（P＜0.01），且3、4組低于1、2組（P＜0.05），見圖5、表2。

圖5 術后3d, 3d, 患側(cè)睪丸BaxBax和caspase-3ase-3蛋白印跡條帶

表2 術后3d, 3d, 患側(cè)睪丸BaxBax和caspase-3ase-3蛋白相對含量（x±sxs）

討 論

精索不全扭轉(zhuǎn)可造成睪丸血供部分受阻，導致睪丸實質(zhì)內(nèi)微循環(huán)障礙，超聲造影能夠反映其血流動力學變化。Ak?ora等[3]發(fā)現(xiàn)漸處理能夠?qū)馆p、中度缺血睪丸組織的再灌注損傷，但低流量的漸處理對缺血睪丸組織血流動力學的影響及原理并未得到闡明。麻日虎等[4]在研究漸處理對肺IRI的影響過程中發(fā)現(xiàn)，肺組織的IRI主要為血管內(nèi)皮細胞損傷，直接復灌注可造成血管通透性和血管阻力增加。低流量的漸進后處理可以通過低壓力的血流復灌，避免直接完全開放精索血供時，因灌注壓驟然升高造成的血管內(nèi)皮急劇擴張、血管舒縮功能受損[5-7]。本實驗運用超聲造影評價低流量后處理對缺血睪丸組織的保護效果，發(fā)現(xiàn)30s漸增組的AT、TTP、PI、BD與缺血前比較無差異，表明血流增幅適中的低壓復灌注確能避免高壓復灌對血管內(nèi)皮的不良影響，降低血管通透性，減少液體外滲，減輕組織水腫對微血管的壓迫[6]，使微血管狀態(tài)最為接近缺血前正常情況，并暢通內(nèi)循環(huán)，使造影劑迅速廓清，縮短DT/2為組內(nèi)最低。

陳謙謙等[2]應用間隔缺血后處理減輕睪丸IRI的實驗發(fā)現(xiàn)，不同復灌/停灌時間的缺血后處理保護效應不同。本實驗結(jié)果顯示，與對照組和45s維持組相較，在復灌即刻給予30s低流量后處理和45s漸增低流量后處理，對生精小管結(jié)構恢復更加有利，AI降低更為明顯，表明對睪丸IRI的保護作用不僅與后處理時間有關，而且與后處理方式也存在一定關系。

本組實驗顯示無論在輕度缺血組還是中度缺血組中，30s組的促凋亡蛋白Bax和caspase-3均顯著低于對照組。正常狀態(tài)下細胞即存在凋亡現(xiàn)象，這種生理性的細胞凋亡處于動態(tài)平衡中，對組織更新等存在積極意義。當組織缺血時，促凋亡蛋白被大量合成并釋放，使細胞凋亡失平衡。睪丸缺血后直接復灌注因完全開放血供、大幅增加組織供氧量，可引起氧自由基（reactive oxygen pecies，ROS）堆積、鈣超載、脂質(zhì)過氧化等一系列反應[8-11]，促使大量促凋亡蛋白Bax釋放入胞漿插入線粒體膜內(nèi)引起細胞色素C（Cytochrome

，Cyt C）釋放[12-14]。Cyt C釋放并激活caspase-3等引起瀑布式級聯(lián)反應，并最終加劇各級生精細胞凋亡。30s低流量后處理通過控制復灌注的血流量，持續(xù)性適量供應氧化底物，緩和氧化應激反應，使產(chǎn)生的ROS始終維持在能夠被清除的范圍內(nèi)，減輕其對生精細胞膜結(jié)構的損傷，削弱再灌注過程中產(chǎn)生的ROS對各級精母細胞分裂增殖活動的影響[15-17]，從源頭控制生精細胞凋亡的發(fā)生，降低睪丸組織促凋亡蛋白Bax和caspase-3的產(chǎn)生，保護精原細胞，保證產(chǎn)生精子的數(shù)量和質(zhì)量[18]。

另外，30s組產(chǎn)生的caspase-3低于45s組，說明除了通過低流量復灌注限制氧化底物的供應來減少促凋亡蛋白產(chǎn)生外，在何時完成后處理，進行完全復灌注對促凋亡蛋白產(chǎn)生同樣重要。有研究發(fā)現(xiàn)用ATP對兔缺血心肌進行后處理，細胞凋亡率明顯減低[19, 20]，但具體作用途徑尚不明確。我們推測30s組較45s組更早完全開放復灌血流，氧等物質(zhì)供應的適時增多，可能加強了生精細胞線粒體有氧呼吸，使ATP產(chǎn)量增加，降低了caspase-3的產(chǎn)生，從而減輕細胞凋亡。

本實驗證明持續(xù)低流量復灌注對兔輕、中度缺血睪丸細胞凋亡具有一定的保護作用，低流量復灌注的方式和持續(xù)時間不同保護效果有所差異，將復灌持續(xù)時間結(jié)合血流量增幅可能尋找到低流量后處理的最佳模式，如本組中30s漸增低流量復灌注。但睪丸扭轉(zhuǎn)低流量復灌所需的具體灌注壓范圍、含氧量多少仍需進一步研究，該方法是否優(yōu)于復灌/缺血間隔后處理對睪丸扭轉(zhuǎn)的保護作用也需進一步探討。

參 考 文 獻

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（2014-07-30收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.01.005

中圖分類號R 697.24

*通訊作者, E-mail: xuees31@126.com

Effects of lasted low fl ow reperfusion postconditioning to incomplete testicular torsion in rabbit

Guo Jingjing, Yu Liyun, Huang Mei, Liang Rongxi, Chen Shun, He Yimi, Xue Ensheng*
Clinical Academy, Union Hospital of Fujian Medical University/Department of Ultrasound, Union Hospital of Fujian Medical University/Fujian Provincial Institute of Ultrasonic Medicine, Fuzhou 350001, China
Corresponding author: Xue Ensheng, E-mail: xuees31@126.com

AbstractObjective Explore the protective effects of lasted low fl ow reperfusion postconditioning to incomplete testicular torsion apoptosis. Methodsthods The experiment was randomly divided into mild ischemia group(A) and moderate ischemia group (B), and each group was divided into control groups (AS, BS) and postconditioning groups (A1, A2, A3, A4 and B1、B2、B3、B4). The control groups got reperfusion completely and immediately, groups A1, B1 and groups A3, B3 got same lasted low flow reperfusion with 45s and 30s, groups A2, B2 and groups A4, B4 got lasted gradually increasing low fl ow reperfusion with 45s and 30s. Got CEUS appearances before ischemia and postoperation, and analyzed the Bax, caspase-3 and AI of the affected testicle. Resultssults Compared the postoperative parameters with preoperation, the AT, TTP, PI, PBD of the groups A4 and B4 had no change (P＞0.05), the DT/2 were shorten(P＜0.05). The AI of groups 2, 3, 4 were signifi cantly lower than control group and group 1(P＜0.01). The Bax and caspase-3 of postconditioning groups with30s were signifi cantly lower than control groups (P＜0.01). Conclusionusion The lasted low fl ow reperfusion postconditioning has different protective effects to mild and moderate incomplete testicular torsion in rabbit, and the effect relates to the lasted time of reperfusion and the bloodfl ow growth, while the effect of lasted gradually increasing low fl ow reperfusion postconditioning with 30s is the most signifi cant.

Key wordsords reperfusion; Spermatic Cord torsion; apoptosis