龜齡集膠囊對(duì)弱精子癥精子線粒體功能的作用機(jī)制研究

孫中明吳燕紅 周海港 姜語(yǔ)彥 許哲杰嵊泗縣人民醫(yī)院泌尿科（浙江嵊泗 202450）

龜齡集膠囊對(duì)弱精子癥精子線粒體功能的作用機(jī)制研究

孫中明*吳燕紅 周海港 姜語(yǔ)彥 許哲杰
嵊泗縣人民醫(yī)院泌尿科（浙江嵊泗 202450）

摘要目的 觀察龜齡集膠囊對(duì)特發(fā)性弱精子癥精子線粒體的作用，探討龜齡集膠囊治療特發(fā)性弱精子癥的機(jī)制。方法 根據(jù)特發(fā)性弱精子癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，篩選特發(fā)性弱精子癥且中醫(yī)辨證屬腎陽(yáng)虛的患者253例為治療組，根據(jù)前向運(yùn)動(dòng)（A級(jí)+B級(jí)）精子的百分率分成3組：35%≤A組＜50%、20%≤B組＜35%、C組＜20%；選取61名正常生育男性為空白對(duì)照組。A、B、C組均用龜齡集膠囊治療，每次0.6 g，每日2次，4個(gè)月為一個(gè)療程。對(duì)各組精子治療前后均作精子線粒體功能檢測(cè)和精液分析，并觀察各組精子密度、精子活力、精子線粒體琥珀酸脫氫酶（SDH）、線粒體膜電位（MMP）治療前后的變化。結(jié)果 （1）各組治療后線粒體功能SDH、MMP改善，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（2）各組前向運(yùn)動(dòng)精子活力均有明顯提高（P＜0.01）。結(jié)論 龜齡集膠囊能有效改善特發(fā)性弱精子癥精子活力，其機(jī)制是改善精子線粒體琥珀酸脫氫酶和線粒體膜電位，從而提高了線粒體的功能。

關(guān)鍵詞弱精子癥; 琥珀酸脫氫酶; 膜電位,線粒體; 精子能動(dòng)性; 龜齡集

特發(fā)性弱精子癥是指患者通過(guò)男性不育相關(guān)常規(guī)檢查及精液分析后發(fā)現(xiàn)除精子活力低下外，其他未發(fā)現(xiàn)影響男性生育的因素，而且也找不到明確的精子活力低下的病因。患者臨床上也無(wú)明顯癥狀和體征[1, 2]。目前特發(fā)性弱精子癥的精子線粒體功能病變的原因及機(jī)制不明，中西醫(yī)治療上均缺乏針對(duì)性。我們?cè)谟谬旪g集膠囊治療中醫(yī)辯證腎陽(yáng)虛虧型特發(fā)性弱精子癥時(shí)，發(fā)現(xiàn)其改善精子線粒體功能和活力方面有明顯效果。

資料與方法

一、一般資料

選取2012年1月至2014年3月來(lái)我院就診的特發(fā)性弱精子癥患者253例作為治療組，且中醫(yī)辨證為腎陽(yáng)虛損證型。根據(jù)（A級(jí)+B級(jí)）精子的百分率分成3組： 35%≤A組＜50%、20%≤B組＜35%、C組＜20%；其中A組80例，B組89例，C組84例。病程均在4～10年，各組平均年齡分別為A組（34.3±2.4）歲，B組（33.9±2.5）歲，C組（34.7±2.2）歲。各組在年齡、病程方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。選取1名已生育正常嬰兒的男性且相關(guān)項(xiàng)目體檢健康者作為空白對(duì)照組，平均年齡（33.1±2.5）歲。該組作精液分析和精子線粒體的功能檢測(cè)，不服用藥物。

二、診斷標(biāo)準(zhǔn)

不孕不育診斷參照《男性不育癥診斷與治療》[3]及《人類(lèi)精子學(xué)》[4]：（1）正常育齡青年婚后1年或以上，性生活正常，未避孕，至今不育；（2）排除下列具有影響男性生殖的肯定病因：醫(yī)源性因素、全身性病因、先天性異常、后天性睪丸損害、精索靜脈曲張、男性附屬性腺感染、血內(nèi)分泌激素（生殖激素6項(xiàng)、甲狀腺功能、皮質(zhì)醇等）、染色體異常等；（3）精液分析精子密度≥20×106/mL而快速前向運(yùn)動(dòng)的精子A級(jí)＜25%和前向運(yùn)動(dòng)（A級(jí)＋B級(jí)）精子＜50%。

腎陽(yáng)虛證診斷參照《實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合泌尿男科學(xué)》[5]、《實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合不孕不育診療學(xué)》[6]、《男科疾病中西醫(yī)匯通》[7]、《腎陽(yáng)虛證癥狀表現(xiàn)規(guī)律的臨床研究》[8]和《對(duì)腎陽(yáng)虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)層次性的探討》[9]：（1）夫妻婚后1年或以上，性生活正常，未避孕，女方未曾孕育；（2）精液分析用偉力精液分析系統(tǒng)連續(xù)分析兩次以上，選擇除精子活力、活率異常外，其他未發(fā)現(xiàn)異常的不育患者，從中選擇A級(jí)精子＜25%和（A級(jí)＋B級(jí)）精子＜50%的患者。（3）腎陽(yáng)虛證的診斷標(biāo)準(zhǔn)：腰酸膝軟，畏寒肢冷，面色白，夜尿頻多，小便清長(zhǎng)，大便溏薄，兼有神疲乏力，頭暈，形寒，性欲淡漠，四肢不溫，腰痛，陽(yáng)痿等證候中的2項(xiàng)。舌淡，舌胖邊有齒痕，苔薄白。脈沉細(xì)，或脈弱，或遲無(wú)力。（4）特發(fā)性弱精子癥患者找不到明確病因。

三、納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

（一）納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）治療前6個(gè)月內(nèi)未使用針對(duì)該病癥的中西藥及其他治療方法；（3）女方檢查均正常。

（二）排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）配偶有不孕疾患；（2）性生活不正常，逆行射精或不射精等；（3）服用抗癲癇病、抗腫瘤等有礙生精及精子活力的藥物者；（4）男方生殖系統(tǒng)先天畸形，精路梗阻，睪丸萎縮，精索靜脈曲張Ⅱ級(jí)以上患者；（5）對(duì)本藥過(guò)敏者；（6）合并心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病，精神病患者；（7）就診半年內(nèi)使用性激素等西藥治療或長(zhǎng)期服用各類(lèi)補(bǔ)腎中藥達(dá)2個(gè)月以上者；（8）不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，未按規(guī)定用藥，無(wú)法判斷療效或資料不全等影響療效和安全性判斷者。

四、方法與觀察指標(biāo)

（一）藥物、試劑和儀器

線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒系美國(guó)Biomet公司產(chǎn)；FeSO4購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠；H2O2系美國(guó)Sigma公司產(chǎn)；MHTF（Modifi ed HTF Medium）購(gòu)自美國(guó)OVEN公司；FACS Caliber型流式細(xì)胞儀系美國(guó)BD公司產(chǎn)；DMAR2型熒光顯微鏡系德國(guó)LEICA公司產(chǎn)；LDZ5-2離心機(jī)由北京醫(yī)用離心機(jī)廠提供；電熱恒溫水浴鍋系北京市醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)。精液分析用偉力計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（WLJY-9000）并配備恒溫裝置。

（二）方法

精液分析根據(jù)WHO的標(biāo)準(zhǔn)，隔5d連續(xù)分析二次以上，除精子活力、活率異常外，選擇其他未發(fā)現(xiàn)異常的不育患者533例。從中選擇中醫(yī)辯證腎陽(yáng)虛的患者且A級(jí)精子＜25%和前向運(yùn)動(dòng)（A級(jí)＋B級(jí)）精子＜50% 的共計(jì)253例，因?yàn)榫踊盍εc精子線粒體琥珀酸脫氫酶（SDH）、線粒體膜電位（MMP）密切相關(guān)，所以根據(jù)（A級(jí)＋B級(jí)）精子百分率以小于50%、35%、20%為界限，分成三組。正常對(duì)照組：選擇婚后2年已正常生育過(guò)健康嬰兒且無(wú)不良嗜好的男性，精液分析及相關(guān)項(xiàng)目檢查正常的志愿者61例作為空白對(duì)照組。同時(shí)作精液分析和檢測(cè)精子線粒體功能。用藥方法：正常空白對(duì)照組不服用藥物、A、B、C組均用龜齡集膠囊（山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國(guó)藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z14020687，規(guī)格：0.3g×30粒）。0.6g，Bid。4個(gè)月為一個(gè)療程，共二個(gè)療程。治療期間禁煙酒，生活規(guī)律。

（三）觀察指標(biāo)

（1）治療前后均檢測(cè)精子密度與A級(jí)精子活力。（2）精子線粒體琥珀酸脫氫酶（SDH）檢測(cè)：采用NBT法并參照文獻(xiàn)[10, 11]介紹的方法進(jìn)行精子線粒體SDH檢測(cè)。精子尾中段（線粒體所在部位）有藍(lán)色顆粒沉著，即為精子SDH性，在高倍鏡下觀察10個(gè)視野，共計(jì)數(shù)100個(gè)精子，計(jì)算正常著色精子數(shù)量。生育男性正常著色線粒體精子＞70%。（3）精子線粒體膜電位（MMP）檢測(cè)：參照文獻(xiàn)[12-14]用熒光探針JC-1檢測(cè)精子線粒體膜電位，熒光顯微鏡下JC-1染色的精子形態(tài) 精子尾中段部即線粒體所在部位著色明亮。精子對(duì)JC-1的攝取依賴(lài)于跨膜電位，線粒體膜電位低，呈現(xiàn)綠色熒光。正常精子的線粒體膜電位高，呈現(xiàn)紅色熒光。正常呈現(xiàn)紅色熒光線粒體精子＞70%。各組分別治療4個(gè)月為1個(gè)療程，對(duì)照組和治療組均在治療前后分別作精液分析、精子線粒體功能檢測(cè)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以x±s表示，用單因素方差檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用列聯(lián)表資料的卡方（x2）檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、治療前后各組精液分析比較

A、B、C組治療前后比較精子密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。治療后各組間精子密度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A、B、C組治療后前向運(yùn)動(dòng)（A級(jí)+B級(jí)）精子活力均提高，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。治療后各組間前向運(yùn)動(dòng)精子活力比較： C組與正常組、A組、B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。B組與正常組、A組差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。A組與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。龜齡集膠囊能有效改善特發(fā)性弱精子癥前向運(yùn)動(dòng)（A級(jí)+B級(jí)）精子活力和密度，見(jiàn)表1。

表1 各組治療前后精子相關(guān)參數(shù)的影響

二、治療前后線粒體功能結(jié)果比較

各組治療前隨著精子活力的下降，線粒體正常著色精子數(shù)呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)（SDH、MMP的正常率下降）。治療后線粒體正常著色精子數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（SDH、MMP的正常率上升）。除正常組治療前后線粒體功能的差別比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其他各組治療前后線粒體功能差別的比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。治療后各組間比較：C組與A、B、正常組線粒體功能差別比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A、B、正常組相互間線粒體功能差別比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療后線粒體正常著色精子數(shù)（SDH、MMP的正常率）的上升，精子活力也隨著上升，精子線粒體功能與精子活力成正相關(guān)，見(jiàn)表2。

表 2 各組精子線粒體功能比較（xx±ss,, %%）

討 論

在弱精子癥中有10.9%為特發(fā)性弱精子癥[8]。精子動(dòng)力低下的原因有：（1）外因：精子抗體陽(yáng)性、解脲支原體陽(yáng)性 、前列腺炎、血性激素異常等，這些均是外界存在影響精子動(dòng)力的因素。（2）內(nèi)因如：最常見(jiàn)的問(wèn)題是精子尾超微動(dòng)力裝置結(jié)構(gòu)性病變和功能發(fā)生異常，如線粒體病變：堆積、小線粒體、大線粒體、囊性化、融合、移位、缺損；軸絲病變：周?chē)S絲缺損、周?chē)S絲排列紊亂、中央軸絲排列紊亂等；致密纖維病變：左右排列紊亂、密纖維缺損等，這些均是精子本身內(nèi)在動(dòng)力系統(tǒng)病變。精液分析是分析精子運(yùn)動(dòng)的物理參數(shù)，不能表明精子運(yùn)動(dòng)障礙的原因。至于精子尾部結(jié)構(gòu)的病變導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙首先需要作相關(guān)功能檢測(cè)和超微檢查，如線粒體功能檢測(cè)和形態(tài)檢查[10, 11]。

在弱精子癥和死精子癥中，可見(jiàn)大量線粒體缺陷的存在。琥珀酸脫氫酶（SDH）是線粒體標(biāo)志酶之一，其活性的降低可影響精子能量代謝，造成精子運(yùn)動(dòng)能力下降。SDH可將琥珀酸氧化生成延胡索酸，脫下的H+通過(guò)中間氫受體吩嗪甲基硫酸酯（PMS）將硝基四氮唑藍(lán)還原為二甲月替，呈藍(lán)紫色顆粒[12]。

線粒體是精子運(yùn)動(dòng)能量提供的場(chǎng)所。其功能狀況直接決定了精子的運(yùn)動(dòng)能力，特別是與受精密切相關(guān)的前向運(yùn)動(dòng)能力。線粒體是精子呼吸的主要場(chǎng)所。通過(guò)氧化磷酸化作用合成ATP，為精子的運(yùn)動(dòng)提供能量，而ATP合成過(guò)程與線粒體內(nèi)的電子傳遞有關(guān)。線粒體通過(guò)電子傳遞將H+從基質(zhì)泵至膜間隙，在線粒體內(nèi)側(cè)形成跨膜的線粒體膜電位，推動(dòng)ATP合成酶合成TP供精子生命活動(dòng)所需。線粒體膜電位的維持對(duì)于線粒體正常功能的實(shí)現(xiàn)極其重要，膜電位的下降會(huì)導(dǎo)致ATP合成不足，影響細(xì)胞正常的生命活動(dòng)。線粒體膜電位反應(yīng)了精子的能量代謝水平，線粒體膜電位的喪失可導(dǎo)致精子細(xì)胞凋亡與壞死。因此，通過(guò)檢測(cè)線粒體膜電位的變化，有助于了解線粒體的功能變化[13]。

線粒體的功能狀態(tài)對(duì)精子存活起著重要作用，因?yàn)榫拥倪\(yùn)動(dòng)能力與線粒體的活性密切相關(guān)，整個(gè)精子代謝所需的能量主要由線粒體提供。線粒體活性的改變會(huì)影響精子的能量供應(yīng)，且研究表明，線粒體還是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中樞。因此，線粒體的功能狀態(tài)是了解精子功能質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵性指標(biāo)[14-18]。本文研究結(jié)果表明：隨著治療后線粒體SDH、MMP正常率的上升，精子活力也隨著上升，精子線粒體功能與精子活力成正相關(guān)。線粒體的功能狀態(tài)在中醫(yī)屬于腎陽(yáng)、腎精、元陽(yáng)范疇。如能補(bǔ)益線粒體的“陽(yáng)氣”則能提高精子活力。

中藥龜齡集膠囊起源于明代。有方士邵元節(jié)據(jù)“云籍上筏”的增刪而取名，方由人參、鹿茸、海馬、枸杞子、丁香、穿山甲、雀腦、牛膝、鎖陽(yáng)、熟地黃、補(bǔ)骨脂、菟絲子、杜仲、石燕、肉蓯蓉、甘草、天冬、淫羊藿、大青鹽、砂仁等28味中藥組成，能強(qiáng)身補(bǔ)腦，固腎補(bǔ)氣，增進(jìn)食欲。用于腎虧陽(yáng)弱，記憶減退，夜夢(mèng)精溢，腰酸腿軟，氣虛咳嗽，五更溏瀉，食欲不振。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為具有溫腎助陽(yáng)、大補(bǔ)真元的功效。多用于治療命門(mén)火衰、腎精不足及氣血虧損引起的陽(yáng)痿及遺精[19]。能增強(qiáng)下丘腦-垂體-性腺軸及腎上腺皮質(zhì)軸等內(nèi)分泌系統(tǒng)的分泌功能，其提取液能影響“陽(yáng)痿”模型小鼠DNA的合成，同時(shí)對(duì)體外精子的各種運(yùn)動(dòng)參數(shù)有明顯促進(jìn)作用。對(duì)活性氧所致的精子損傷有拮抗作用，促使腺體保持年輕水平，其中人參有大補(bǔ)元?dú)夂脱a(bǔ)脾腎的作用；增強(qiáng)性腺機(jī)能，有促進(jìn)性腺激素作用，在細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞數(shù)明顯增多，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛壽命延長(zhǎng)，其提取液能提高精子的運(yùn)動(dòng)速度。鹿茸可以溫養(yǎng)督脈、生精益髓。鎖陽(yáng)、枸杞子、肉蓯蓉、淫羊藿等有滋腎陰，補(bǔ)腎陽(yáng)，陽(yáng)中求陰、陰中求陽(yáng)，益氣強(qiáng)精的功效。砂仁宣通三焦氣機(jī)，醒脾和胃，補(bǔ)后天以助先天，既免除補(bǔ)腎滋膩礙胃之弊，又可引諸藥歸腎，能收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心[20-26]。精子發(fā)生的周期為3個(gè)月，由于中藥的起效需要一個(gè)積累過(guò)程，所以該治療4個(gè)月為一個(gè)療程，共2個(gè)療程，以充分有效發(fā)揮中藥的作用。

上述研究發(fā)現(xiàn)龜齡集膠囊能有效改善精子尾線粒體SDH、MMP的正常率，正常著色精子數(shù)上升，精子活力也隨著上升。其機(jī)制是改善線粒體功能相關(guān)病變引起的精子運(yùn)動(dòng)障礙導(dǎo)致的活力低下，從而起到補(bǔ)益線粒體“陽(yáng)氣”的作用。其具體的詳細(xì)的作用步驟或機(jī)制環(huán)節(jié)還有待進(jìn)一步研究。

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（2014-03-08收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.03.008

中圖分類(lèi)號(hào)R 698.2

*通訊作者, Tel: 18058069031; E-mail: 1104858603@qq.com

Study on Guilinji Capsule for mitochondria function of sperm in idiopathic asthenospermia

Sun Zhongming*, Wu Yanhong, Zou Hangang, Jiang Yuyan, XuZhejie
Zhejiang Shenshi Hospital, Shenshi 202450, Zhe Jiang, China
Corresponding author: Sun Zhongming, Tel: 18058069031; E-mail: 1104858603@qq.com

AbstractObjective To study the effect of Guilinji capsule on mitochondria function of sperm tail in idiopathic asthenospermia and explore its mechanism. Methodsthods According to the diagnosing standard of idiopathic asthenospermia and A and B level sperm viability, 253cases with idiopathic asthenospermia were divided into 3 groups, 35%≤A＜50%, 20%≤B＜35%, C＜20%, and treated with Guilinji capsule 0.6g, Bid. four months for one period of treatment. Seminal fl uid analysis and mitochondria function examination were carried out before and after treatment. Sperm density,viability,SDH and MMP were comparatively analzed. Resultssults There was a more significant improvement in mitochondria function (SDH、MMP) (P＜0.01)and sperm viability of each group after treatment (P＜0.01). Conclusionusion Guilinji capsule signifi cantly improvement in mitochondria function of sperm in idiopathic asthenospermia and level of sperm viability.

Key wordsords asthenozoospermia; succinate dehydrogenase; membrane potential, mitochondrial; sperm motility; Guilinji capsule