糖絡(luò)寧對糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體超氧陰離子產(chǎn)生及線粒體膜電位水平的影響

劉琴　李逸瀟　張濤靜　龔燕冰　周暉　謝培鳳

[摘要] 目的 觀察中藥復(fù)方制劑糖絡(luò)寧對糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）線粒體呼吸鏈氧化呼吸功能、超氧陰離子產(chǎn)生量及膜電位水平的影響。 方法 選取SPF級雄性8周SD大鼠80只，隨機選擇14只為正常組，其余66只大鼠采用鏈脲佐菌素制作糖尿病大鼠模型；其中61只造模成功大鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型組19只、西藥組（α-硫辛酸組）21只、中藥組（糖絡(luò)寧組）21只，共給藥8周；給藥結(jié)束后，檢測線粒體呼吸鏈氧化呼吸功能、超氧陰離子產(chǎn)生量及膜電位水平。 結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠DRG線粒體呼吸功能明顯下降（P < 0.01）；與模型組比較，西藥組大鼠DRG線粒體呼吸功能明顯改善（P < 0.01）；與模型組比較，中藥組大鼠DRG線粒體呼吸功能未見明顯改善（P > 0.05）。與正常組比較，模型組大鼠DRG線粒體超氧陰離子明顯升高（P < 0.01）；與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠DRG線粒體超氧陰離子水平明顯降低（P < 0.01）。與正常組比較，模型組大鼠線粒體膜電位明顯下降（P < 0.01）；與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠線粒體膜電位明顯改善（P < 0.01）。 結(jié)論 糖絡(luò)寧不能改善糖尿病大鼠DRG線粒體氧化呼吸功能，可抑制糖尿病大鼠DRG線粒體超氧陰離子的產(chǎn)生，改善線粒體膜電位水平，這可能是糖絡(luò)寧治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用機制。

[關(guān)鍵詞] 糖絡(luò)寧；糖尿病大鼠；氧化呼吸功能；超氧陰離子；線粒體；膜電位

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（b）-0004-05

[Abstract] Objective To observe the effect of Chinese herbal compound Tang-luo-ning on oxidative respiratory function of the mitochondrial respiratory chain， superoxide anion production and membrane potential in diabetic rat dorsal root ganglion （DRG）. Methods There were 80 SD male rats， 14 of them were randomly selected as the normal group. The rest 66 were used to established diabetic rats model by injected Streptozocin （STZ）. According to the random number table， the 61 rats of the model were divided into model group with 19 rats， Western medicine group （alpha lipoic acid group） with 21 rats and traditional Chinese medicine group （Tang-luo-ning group） with 21 rats. They were given the medicine 8 weeks， then mitochondrial respiratory chain oxidative respiratory function， superoxide anion production and membrane potential levels were measured. Results Compared with the normal group， the mitochondrial respiratory function of the DRG in the model group was significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the model group， the mitochondrial respiratory function of the DRG in the Western medicine group was significantly improved （P < 0.01）. Compared with the model group， the Chinese medicine group had no significant improvement in mitochondrial respiratory function in DRG（P > 0.05）. Compared with the normal group， the mitochondrial superoxide anion of the DRG in the model group was significantly increased （P < 0.01）. Compared with the model group， the mitochondrial superoxide anion level of the DRG in the Chinese medicine group and the Western medicine group was significantly reduced （P < 0.1）. Compared with the normal group， the mitochondrial membrane potential of the model group was significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the model group， the mitochondrial membrane potential of the Chinese medicine group and the Western medicine group was significantly improved （P < 0.01）. Conclusion Tang-luo-ning inhibits the generation of superoxide anion and ameliorates mitochondrial membrane potential in dorsal root ganglions of diabetic rats. This study provides a potential mechanism underlying protection of Tang-luo-ning on the injury of dorsal root ganglions in diabetic model.

[Key words] Tang-luo-ning； Diabetic rats； Oxidative respiratory function； Superoxide anion； Mitochondria； Membrane potential

糖尿病性周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最常見慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病率高，有近半數(shù)患者無明顯癥狀[1]。神經(jīng)病變可累及感覺神經(jīng)、運動神經(jīng)及植物神經(jīng)，產(chǎn)生疼痛、麻木、運動障礙及自主神經(jīng)功能障礙，影響糖尿病患者的生存質(zhì)量[2]。氧化應(yīng)激在DPN的發(fā)病中起著關(guān)鍵性的作用，尤其是神經(jīng)細胞內(nèi)最重要的產(chǎn)能細胞器——線粒體所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，被認為是DPN發(fā)病的重要機制。高血糖狀態(tài)下，神經(jīng)細胞線粒體呼吸鏈的氧化呼吸功能、超氧陰離子的產(chǎn)生量以及線粒體膜電位均會發(fā)生改變，進而導(dǎo)致線粒體中氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，引發(fā)DPN。

中藥復(fù)方制劑糖絡(luò)寧治療DPN效果顯著，通過對200例患者進行臨床觀察，糖絡(luò)寧的治療有效率達91.67%[3-5]，顯著高于對照組（口服甲鈷胺）的62.5%。糖絡(luò)寧對DPN患者的肢體麻木、疼痛、痙攣、踝反射減弱等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀改善明顯，對神經(jīng)傳導(dǎo)速度和末梢微循環(huán)積分有明顯的改善作用，但其作用機制仍不明確。本研究針對上述線粒體導(dǎo)致DPN的發(fā)病機制，觀察糖絡(luò)寧對糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞線粒體呼吸鏈的氧化呼吸功能、超氧陰離子的產(chǎn)生量以及線粒體膜電位的影響，從而探討其治療DPN的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性8周SD大鼠，體重200～250 g，合格證號：SCXK（京）2012-0001，由北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司供給。購入后置于北京中醫(yī)藥大學動物實驗中心飼養(yǎng)。實驗室條件：國標GB14925_2001規(guī)定動物實驗設(shè)施大鼠SPF級屏障環(huán)境[環(huán)境安全合格證號：SYXK（京）2011-0024]，室內(nèi)相對溫度（25±1）℃，相對濕度（60±10）%。實驗前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。

1.1.2 試劑 鏈脲佐菌素（STZ，美國Merck公司，批號：B69776）；線粒體相關(guān)試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技公司）；動物細胞/組織活性線粒體分離試劑盒（GMS1 0006.2 v.A）、純化線粒體凍存液（酶學和膜結(jié)構(gòu)保護）（GMS12198.1）、純化線粒體凍存液（生物能量學保護）（GMS12198.2）、純化線粒體氧化應(yīng)激活性氧（ROS）光澤精化學發(fā)光法定量檢測試劑盒（GMS10113.2 v.A）；ADP（Sigma，01905）；氯化鉀、甘露醇、蔗糖、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TRIS-HCl）、磷酸氫二鉀、琥珀酸、TRIS-Base（以上試劑分析提純由國藥集團化學試劑北京有限公司提供）；α-硫辛酸（α-lipoic acid）（批號：82159-09-9）。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模及分組 SPF級雄性8周SD大鼠80只，體重200～250 g。實驗前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。造模前隨機選擇14只為正常組，其余大鼠予STZ 60 mg/kg腹腔注射，72 h后測血糖≥16.7 mmol/L為造模成功[6-8]，最終造模成功61只，將造模成功大鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型組、西藥組、中藥組，每組大鼠數(shù)量分別為19、21、21只。

1.2.2 給藥方法 中藥組給予糖絡(luò)寧制劑（北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院制劑室自制，約為生藥10 g/mL，方藥組成：丹參、全蝎、生黃芪、牛膝、狗脊等）按生藥5 g/（kg·d）灌胃，換算成糖絡(luò)寧為0.5 mL灌胃；西藥組給予α硫辛酸按20 mg/（kg·d）灌胃，使用時將α硫辛酸用蒸餾水配成混懸液2.5 mg/mL；模型組及正常組予等量生理鹽水灌胃，實驗期間自由飲食，連續(xù)給藥8周。

1.2.3 取材 給藥結(jié)束后，根據(jù)大鼠體肌重，以10%水合氯醛按350 mg/kg標準腹腔注射麻醉。麻醉成功后，分離大鼠雙下肢肌肉組織，取出兩側(cè)背根神經(jīng)節(jié)組織，生理鹽水沖洗后EP管中保存，置-80℃?zhèn)溆?。按照試劑盒及既往研究[9-10]方法提取大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體，放入-70℃冰箱里備用。

1.3 觀測指標

1.3.1 線粒體呼吸鏈氧化呼吸功能的測定 提取分離大鼠神經(jīng)組織線粒體，運用Hansatech公司的Oxytherm液相氧電極儀，使用極譜描記術(shù)Clark電極法對線粒體呼吸功能進行檢測：①先將恒溫水浴調(diào)至25℃，用注射器將反應(yīng)液（1.8 mL）注入反應(yīng)室，然后加入0.2 mL線粒體制備液，此時記錄儀上出現(xiàn)斜率較低的直線，這是線粒體的內(nèi)源呼吸，又稱狀態(tài)Ⅰ。②待斜率穩(wěn)定后加入適量呼吸底物琥珀酸，這種加入呼吸底物后的斜率為呼吸基質(zhì)存在時的氧吸收速率又稱狀態(tài)Ⅱ。③再加入ADP時出現(xiàn)較大的斜率，代表ADP促進下的線粒體呼吸速率，稱為狀態(tài)Ⅲ。④當磷酸化反應(yīng)的底物ADP被耗盡后，線粒體氧化吸收速率又自動地降低，此時的斜率為狀態(tài)Ⅳ。⑤線粒體呼吸功能計算：狀態(tài)Ⅲ的斜率與狀態(tài)Ⅳ的斜率比值。

1.3.2 線粒體超氧陰離子產(chǎn)生量的測量 提取分離大鼠DRG線粒體，使用光澤精化學發(fā)光法對線粒體超氧陰離子進行定量檢測：①移取100 μL的純化線粒體，加入700 μL GENMED緩沖液（Reagent A），輕輕混勻線粒體，放進37℃恒溫水槽孵育10 min；②打開化學發(fā)光儀，設(shè)定儀器內(nèi)溫度為37℃預(yù)熱和整合測讀分別為10 s及15 min，然后關(guān)掉實驗室的燈光，將-20℃冰箱里的GENMED發(fā)光液（Reagent B）置入冰槽里融化，嚴格置于暗室內(nèi)；③移取400 μL GENMED緩沖液（Reagent A）、上述預(yù)處理的線粒體分別移到陰性對照測試管、樣品本底測試管；④移取400 μL上述預(yù)處理的線粒體到樣品活性測試管，分別加入10 μL GENMED發(fā)光液（Reagent B）到上述測試管，除樣品本底測試管外；⑤輕輕混勻，放進37℃化學發(fā)光儀里讀測，整合測讀15 min/0.4（mL：樣品容量）=相對發(fā)光單位（RLU）/0.2 mg線粒體蛋白。

1.3.3 線粒體膜電位的測量 ①從純化的線粒體樣品中移出10 μL純化線粒體到新的預(yù)冷的1.5 mL離心管，置入冰槽里。②加入適量的GENMED 保存液（Reagent A）至最終容量為100 μL。③加入100 μL含有GENMED染色液（Reagent B）和GENMED稀釋液（Reagent C）的GENMED染色工作液到比色杯里。④加入100 μL純化的線粒體樣品，上下傾倒比色杯，輕輕混勻，再放進暗室里，在室溫下孵育10 min。⑤即刻放進熒光分光光度計測定：激發(fā)波長490 nm，散發(fā)波長590 nm，獲得相對熒光單位（RFU），RFU值反映線粒體膜電位水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間的兩兩比較采用q檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠DRG線粒體呼吸鏈氧化呼吸功能的測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠DRG線粒體呼吸功能明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.001）；與模型組比較，西藥組大鼠DRG線粒體呼吸功能明顯改善，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.001）；與模型組比較，中藥組大鼠DRG線粒體呼吸功能未見明顯改善（P > 0.05）。見圖1～2。

2.2 大鼠DRG線粒體超氧陰離子產(chǎn)生量的測量結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠DRG線粒體超氧陰離子明顯升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.001）；與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠DRG線粒體超氧陰離子水平明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01或P < 0.001）。見圖3。

2.3 大鼠DRG線粒體膜電位測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠線粒體膜電位明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.001）；與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠線粒體膜電位明顯改善，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見圖4。

3 討論

DPN是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，以下肢對稱性麻木發(fā)涼為主要表現(xiàn)，是導(dǎo)致糖尿病患者生活質(zhì)量下降甚至致殘的原因之一。DPN的發(fā)病機制至今尚未完全闡明。研究認為氧化應(yīng)激是DPN的核心發(fā)病機制[11-12]，線粒體氧化應(yīng)激在其中發(fā)揮著巨大的作用。生理狀態(tài)下，線粒體是神經(jīng)細胞內(nèi)直接利用氧氣制造能量最主要的部位，90%以上吸入神經(jīng)元的氧氣被線粒體消耗。氧是個“雙刃劍”，一方面細胞利用氧分子制造能量，另一方面氧分子在被利用的過程中會產(chǎn)生極活潑的中間體（活性氧自由基）傷害神經(jīng)細胞造成氧毒性。大量研究表明，在高血糖狀態(tài)下，這種氧毒性更加明顯，線粒體便成為神經(jīng)細胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）最主要來源[13-15]。

針對氧化應(yīng)激這一DPN發(fā)病的核心機制，抗氧化應(yīng)激治療自然成為治療DPN的熱點。在抗氧化藥物中，α-硫辛酸是目前臨床最為常用的藥物。α-硫辛酸最早在動物實驗中被證實具有很好的治療DPN的效果[16-18]，其后在人體上的RCT研究同樣證實其臨床療效，尤其是Ametov等[19]與Ziegler等[20]所做的多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照試驗。α-硫辛酸已成為治療DPN的一線治療用藥，故本研究將其作為西藥對照藥物。

本研究針對線粒體氧化應(yīng)激，觀察糖絡(luò)寧對線粒體氧化呼吸功能、超氧陰離子及膜電位的影響。結(jié)果顯示，糖尿病大鼠DRG線粒體呼吸功能下降明顯，α-硫辛酸可部分改善DRG線粒體呼吸功能，糖絡(luò)寧不能改善糖尿病DRG大鼠線粒體呼吸功能；糖尿病大鼠DRG線粒體超氧陰離子產(chǎn)生量較正常大鼠明顯增加，而西藥α-硫辛酸與中藥糖絡(luò)寧均可明顯抑制糖尿病大鼠DRG線粒體超氧陰離子的產(chǎn)生，其中硫辛酸抑制更加明顯；糖尿病大鼠DRG線粒體膜電位水平較正常大鼠明顯下降，而線粒體膜電位下降與細胞凋亡密切相關(guān)；與糖尿病大鼠比較，使用中藥糖絡(luò)寧與西藥α-硫辛酸治療的大鼠均可顯著提高線粒體膜電位水平，進而改善細胞凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)糖絡(luò)寧可抑制DRG線粒體超氧陰離子的產(chǎn)生，從而直接減少線粒體中氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，同時改善線粒體膜電位，減少DRG細胞凋亡的發(fā)生，這兩點可能是糖絡(luò)寧治療DPN的作用機制之一。但遺憾的是，糖絡(luò)寧未能恢復(fù)糖尿病大鼠受損的線粒體呼吸功能，可能是由于糖絡(luò)寧的作用靶點不在線粒體呼吸功能上。

[參考文獻]

[1] 中華醫(yī)學會糖尿病分會.2013年中國2型糖尿病防治指南[J].中華糖尿病雜志，2014，6（7）：469-470.

[2] Pop-Busui R，Boulton AJ，F(xiàn)eldman EL，et al. Diabetic neuropathy：a position statement by the American Diabetes Association [J]. Diabetes Care，2017，40（1）：136-154.

[3] 高彥彬，呂仁和，于秀辰，等.糖絡(luò)寧治療糖尿病周圍神經(jīng)病變臨床觀察[J].北京中醫(yī)藥大學學報，1997，27（4）：50-53.

[4] 周暉，高彥彬，劉銅華，等.糖絡(luò)寧治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的臨床研究[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2002，32（4）：59-61.

[5] 高彥彬，周暉，張濤靜，等.糖絡(luò)寧治療糖尿病周圍神經(jīng)病變臨床研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（6）：1673-1677.

[6] 彭芳，楊遠華.實驗性糖尿病動物模型制備及指標測定評價[J].大理學院學報，2003，2（1）：1-3.

[7] 林心君，王麒又，辛金鐘，等.高成模率和高穩(wěn)定性的糖尿病大鼠模型制備——高脂高糖膳食+STZ體重聯(lián)合體表面積法構(gòu)建糖尿病大鼠模型[J].中國老年學雜志，2013，33（9）：2051-2054.

[8] 洪麗莉，許冠蓀，申國明，等.SD大鼠2型糖尿病模型的建立[J].實驗動物科學與管理，2005，（4）：1-3.

[9] 張濤靜，龔燕冰，周暉，等.糖絡(luò)寧對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體抗氧化劑活性的影響[J].疑難病雜志，2015，14（2）：179-181.

[10] 張秀麗，于德江，劉德勝，等.梓醇對魚藤酮致小鼠中腦和紋狀體線粒體酶活性改變的改善作用[J].中國藥理學與毒理學雜志，2012，26（5）：618-623.

[11] 牟忠卿，陳麗.糖尿病中氧化應(yīng)激的研究進展[J].國外醫(yī)學：內(nèi)科學分冊，2005，32（12）：510-512，524，529.

[12] 孫青.中藥筋脈通對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠氧化應(yīng)激及細胞凋亡的影響[D].北京：清華大學醫(yī)學部，北京協(xié)和醫(yī)學院，中國醫(yī)學科學院，2012.

[13] Akude E，Zherebitskaya E，Chowdhury SK，et al. Diminished superoxide generation is associated with respiratory chain dysfunction and changes in the mitochondrial proteome of sensory neurons from diabetic rats [J]. Diabetes，2011，60（1）：288-297.

[14] Roy CSK，Zherebitskaya E，Smith DR，et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in dorsal root ganglia of Streptozotocin-induced diabetic rats and its correction by insulin treatment [J]. Diabetes，2010，59（4）：1082-1091.

[15] Akude E，Zherebitskaya E，Roy CSK，et al. 4-Hydroxy-2-nonenal induces mitochondrial dysfunction and aberrant axonal outgrowth in adult sensory neurons that mimics features of diabetic neuropathy [J]. Neurotox Res，2010， 17（1）：28-38.

[16] Vincent AM，Russell JW，Low P，et al. Oxidative stress in the pathogenesis of diabetic neuropathy [J]. Endocr Rev，2004，25（4）：612-628.

[17] Ziegler D，Sohr CGH，Nourooz-Zadeh J，et al. Oxidative stress and antioxidant defense in relation to the severity of diabetic polyneuropathy and autonomic neuropathy [J]. Diabetes Care，2004，27（9）：2178-2183.

[18] 王俐，蔡美琴，劉秀玲，等.α-硫辛酸對高糖和H2O2致ECV304細胞線粒體氧化損傷的保護作用[C].//第九屆長三角科技論壇暨營養(yǎng)科技論壇論文集，上海交通大學上海市預(yù)防醫(yī)學研究院，2012：24-29.

[19] Ametov A，Barinov A，Ziegler D，et al. The sensory symptoms of diabetic polyneuropathy are improved with α-lipoic acid：the SYDNEY trial [J]. Diabetes Care，2003，26（3）：770-776.

[20] Ziegler D，Ametov A，Barinov A，et al. Oral treatment with α-lipoic acid lmproves symptomatic diabetic polyneuropathy：the SYDNEY 2 trial[J]. Diabetes Care，2006，29（11）：2365-2370.

（收稿日期：2018-03-13 本文編輯：任 念）