超高效液相色譜－四極桿飛行時間質譜法快速篩查水產(chǎn)品中28種酸性合成色素

王萍亞， 周 勇， 戴意飛， 黃 鸝， 趙巧靈

（舟山市食品藥品檢驗檢測研究院，舟山市質量技術監(jiān)督檢測研究院，浙江舟山316021）

近年來，在食品中非法添加和濫用酸性合成色素的現(xiàn)象層出不窮。因此相關的檢測方法［1-5］也隨之受到關注和研究。合成色素與天然色素有著本質區(qū)別，合成色素由于色澤鮮艷、容易上色等特點主要應用于工業(yè)生產(chǎn)中。如對羊毛、皮革、蠶絲等進行染色處理，但均有一定程度的毒性。然而有些不法分子為節(jié)省成本，在食品中非法添加酸性合成色素，如酸性黃［6］、酸性紅［7］等，對人體健康和社會穩(wěn)定產(chǎn)生了極大的危害。但考慮到酸性合成色素種類繁多，無法一一列明，因此有必要針對目前市場上常見的28種酸性合成色素建立篩查方法，從而為有效遏制非法添加行為和食品安全風險預警提供技術手段。

目前色素的檢測方法很多，如毛細管電泳法［8］、高 效 液 相 色 譜 法［9-11］、液 相 色 譜-質 譜法［12-15］等。液相色譜與質譜聯(lián)用技術能夠在一定程度上排除基質干擾，對于基質復雜、需要高靈敏度、寬適用范圍的檢測工作而言，它已成為最佳的手段之一。四極桿飛行時間質譜（Q-TOF MS）作為高分辨質譜，能測定得到精確質量數(shù)，并且通過數(shù)據(jù)庫進行一級、二級質量數(shù)匹配和同位素匹配等進行化合物鑒定，特別是對非特定的目標化合物進行鑒定，同時可以對檢測到的陽性目標物進行定量。但目前對未知添加色素的篩查技術研究較少，且未見水產(chǎn)品中未知添加色素檢測的相關報道。

因此，本文以水產(chǎn)品為研究對象，對其中28種禁用的酸性合成色素進行分析，建立了UPLC-QTOF MS篩查方法。對樣品前處理方法、液相色譜條件、質譜條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，為水產(chǎn)品中酸性合成色素高通量的篩查和確證提供了可行的方法。

1 實驗部分

1.1

儀器與試劑

Agilent UHPLC和Agilent 6540-Q-TOF MS（Agilent，美國）；Avanti?J-E 高速冷凍離心機、Talboys渦旋混合器、N-EVAPTM-112氮吹儀、樣品萃取管；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；無水硫酸鎂、乙酸銨、丙酮、正己烷、乙醇和氨水（質量分數(shù)25%～28%）為分析純；C18填料（40 ～63 μm）、聚酰胺粉（100 ～200目）均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗用水為Milli-Q超純水。

標準物質：莧菜紅（Amaranth，純度89%）、日落黃（Sunset Yellow FCF，純度 90%）、靛藍（Indigo carmine 91%）、亮黑 BN（Brilliant Black BN，純度91%）、萘酚黃（Naphthol Yellow，純度 89%）、酸性紅（New Coccine，純度 91%）、酸性黃（Acid Yellow，純度89%）、喹林黃（Quinoline Yellow，純度 91%）、酸性紅 2G（Acid Red 1，純度 89%）、亮綠 SF（Light Green SF Yellowish，純度 91%）、偶氮玉紅（Carmoisine，純度91%）、酸性紅26（Ponceau Xylidine，純度91%）、羊毛綠（Wood Green S，純度 91%）、橙色 I（Orange I，純度 91% ）、橙色 II（Orange II，純度91%）、監(jiān)牢綠 FCF（Fast Green FCF，純度 91%）、萘酚藍黑（Naphthol Blue Black，純度91%）、酸性藍（Brilliant Blue FCF，純度91%）、酸性紅 52（Sulforhodamine B，純度 91%）、赤蘚紅（Erythrosine，純度91%）、熒光桃紅（Phloxine B，純度 91%）、酸性黃 36（Metanil Yellow，純度 91%）、酸性綠 3（Guinea Green B，純度91%）、熒光素鈉（Uranine，純度 91%）、孟加拉玫瑰紅（Rose Bengal，純度91%）、酸性紅87（Eosin Y，純度91%）、麗春紅 SX（Ponceau SX）均購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取28種酸性合成色素標準品各10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1 g／L的單標準儲備液（-20℃保存），再分別吸取1 g／L的28種單標準儲備液各1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容得10 mg／L的混合標準溶液。用初始流動相將其稀釋成相應的標準工作溶液，于4℃保存。

1.3 樣品前處理

稱取2.0 g樣品于50 mL帶蓋聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL 氨水和乙醇水溶液（2∶7∶1，v／v／v），渦旋混勻后于80℃水浴中濃縮至4 mL，用200 g／L檸檬酸調節(jié)提取液 pH值至 4.0，以 10 000 r／min冷凍離心10 min，將上清液轉移至基質分散管中，管內裝有氨基化吸附劑（1 000 mg無水硫酸鎂、50 mg C18粉末、200 mg聚酰胺粉末），振蕩基質分散管5 min，以10 000 r／min冷凍離心10 min，去除上清液，然后向沉淀中加入5 mL氨水-甲醇（30∶70，v／v）洗脫，重復洗脫一次后合并兩次洗脫液，用氨化甲醇定容10 mL，取1 mL用氮氣吹干，再用 0.2 mL 甲醇-水（50∶50，v／v）溶解，過 0.22 μm有機濾膜后供UPLC-Q-TOF MS分析測定。

1.4 色譜－質譜條件

1.4.1 色譜條件

Agilent Eclipse Plus-C （100 mm ×3.0 mm，1.8 μm）作為分析柱，柱溫為30℃；流動相A相為5 mmol／L 乙酸銨-0.1% （v／v）甲酸水溶液，B 相為乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，5%B～20%B；1～10 min，20%B ～100%B；10 min～15 min，100%B。進樣體積為3 μL；流速為0.2 mL／min。

1.4.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子（ESI）源；掃描方式：負離子全掃描；全掃描范圍：m／z 50～1 100；毛細管電壓：3 500 V；離子源噴霧電壓：1 500 V；離子化電壓：130 V；鞘氣溫度：350℃；干燥氣溫度：325℃；鞘氣流速：11 L／min；干燥氣流速：8 L／min；數(shù)據(jù)采集模式：全息離子掃描（Allions MS／MS）。參比溶液中含三氯乙酸（C2HF3O2，精確相對離子質量為112.985 5）和六（1H，1H，3H-全氟丙氧基）磷氮的三氟乙酸加合離子（C20H19F27N3O8P+3，精確相對離子質量為1 033.9 881）。

數(shù)據(jù)采集與處理通過Agilent Mass Hunter Workstation Software （Version B.05.00）軟件完成，碎片離子數(shù)據(jù)庫建立通過Agilent Mass Hunter PCDL Manager（B.04.00）軟件完成。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

選取負離子模式，在全掃描方式下優(yōu)化離子化電壓、毛細管電壓、碰撞電壓等參數(shù)。離子化電壓和毛細管電壓是質譜離子源的一項關鍵參數(shù)，該參數(shù)直接影響目標化合物的檢測靈敏度。隨著離子化電壓和毛細管電壓的逐漸增大，離子的響應強度會逐漸增強，響應達到一定值后，離子的響應又逐漸減弱。本實驗考察了離子化電壓為100～150 V以及毛細管電壓為3 000～5 500 V的影響，結果表明在130 V的離子化電壓和3500 V的毛細管電壓下，所有的目標化合物均能夠得到比較滿意的準分子離子峰，因此本文以130 V作為最佳采樣離子化電壓，根據(jù)優(yōu)化結果采集數(shù)據(jù)。其次優(yōu)化了碰撞電壓，通過設定5～80 V的碰撞電壓，根據(jù)二級離子靈敏度的總體情況進行調節(jié)，最終選擇了兩個碰撞能量，低能量值為10 V，高能量為40 V，由于高分辨質譜的篩查需要準確質量的二級圖譜碎片進行匹配，所以通過不同的碰撞電壓進行碎裂，并用全息二級圖譜建立數(shù)據(jù)庫，最終確定了用于酸性合成色素分析的質譜條件，同時用一級質量數(shù)、同位素豐度和二級碎片信息等建成一個完整的數(shù)據(jù)庫，用于質譜篩選。

2.2 流動相的選擇

本實驗選擇甲醇-0.1%（v／v）甲酸水溶液、乙腈-0.1% （v／v）甲酸水溶液、甲醇-含 0.1% （v／v）甲酸的5 mmol／L 乙酸銨溶液、乙腈-含0.1% （v／v）甲酸的5 mmol／L乙酸銨溶液作為流動相，分析比較了多種酸性合成色素的分離效果。結果表明，乙腈的分離效果明顯優(yōu)于甲醇，同時乙腈的洗脫能力更好，提高了分析效率；而乙酸銨能夠得到較好的酸性合成色素峰形，相比之下純水的效果較差；且在乙酸銨溶液中加入0.1%（v／v）甲酸，雖然在負離子條件下靈敏度有一定程度的損失，但實驗發(fā)現(xiàn)其影響在可接受的范圍內，同時峰形和分離度有明顯改善。因此比較了在乙酸銨溶液中添加不同體積分數(shù)（0%、0.1%、0.2%、0.5%）的甲酸對色譜峰的影響，結果表明含0.1% （v／v）甲酸的5 mmol／L乙酸銨溶液和乙腈為最佳的流動相。由此，通過優(yōu)化質譜條件和流動相確定最終的采集方法，然后通過標準物質采集獲得28種酸性合成色素的分子特征提取色譜圖（見圖1）。

圖1 28種酸性合成色素的UPLC－Q－TOF MS分子特征提取離子色譜圖Fig.1 Molecular feature of extracted chromatograms of the 28 acidic artificial dyes by UPLC－Q－TOF MS

圖1 （續(xù)）Fig.1 （Continued）

通過Allions MS／MS模式一次進樣同時檢測28種酸性合成色素的質譜全掃描信息，在化學工作站設置28種酸性合成色素質譜檢測的母離子及保留時間等信息，檢測得到的質譜特征離子如表1所示。

表1 水產(chǎn)品中28種酸性合成色素的保留時間和質譜信息Table 1 Retention times and MS information of the 28 acidic artificial dyes in fishery products

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線、檢出限與精密度

配制20～10 000 μg／L的系列標準溶液，以峰面積（Y）對相應的質量濃度（X，μg／L）分別繪制28種酸性合成色素的標準曲線。將200 μg／L混合標準溶液連續(xù)檢測6次，計算峰面積的相對標準偏差（RSD）。各酸性合成色素的線性范圍、相關系數(shù)（r）和峰面積的RSD見表2。結果表明，28種酸性合成色素在各自的線性范圍內線性關系良好（r≥0.991）。

表2 28種酸性合成色素的線性范圍、相關系數(shù)（r）和200 μg／L時峰面積的RSDTable 2 Linear ranges，correlation coefficients （r）and RSDs of the peak areas of the 28 acidic artificial dyes at 200 μg／L

2.3.2 回收率、檢出限與定量限

根據(jù)3倍、10倍信噪比（S／N）分別確定檢出限（LOD）、定量限（LOQ）。在陰性的鯧魚樣品基質中添加100、200和500 μg／kg 3個水平的混合標準溶液，按1.3節(jié)方法進行預處理，每個水平重復測定6次，得到28種酸性合成色素的回收率、LOD與LOQ（見表 3）。28 種目標物的 LOD 為 5 ～50 μg／kg，LOQ 為20 ～100 μg／kg；且在 3 個不同加標水平下28種酸性合成色素的回收率分別為70.24%～106.47%，可以滿足國內外水產(chǎn)品中酸性色素檢測的要求。

表3 鯧魚中28種酸性合成色素的加標回收率、RSD、檢出限和定量限Table 3 Recoveries，RSDs，LODs and LOQs of the 28 acidic artificial dyes spiked in Pampus argenteus

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

2.4 方法的應用

選取市售22份水產(chǎn)品（白蟹、富貴蝦、小黃魚、大黃魚、龍頭魚、黃姑魚、梅童魚、鮸魚、玉禿、鯧魚、帶魚、青占魚、馬鮫魚、鰳魚、鯖魚、魷魚、烏賊、海帶、海蜇、海地瓜、蟶子和文蛤）進行檢測，結果未發(fā)現(xiàn)陽性樣品，下一步將以水產(chǎn)品加工品作為采集對象，擴大篩查范圍。按照本方法篩選，以酸性紅為例，圖2是酸性紅的二級碎片質譜圖，可獲得相應的母離子和碎片離子信息。經(jīng)過精確分子質量及標準物質譜圖數(shù)據(jù)庫的檢索，28種目標物的匹配度均大于85%，說明建立UPLC-Q-TOF MS技術可快速有效地篩查水產(chǎn)品中28種酸性合成色素。

圖2 酸性紅的二級碎片圖譜Fig.2 Fragment spectrum of New Coccine

3 結論

本文建立了UPLC-Q-TOF MS快速篩查水產(chǎn)品中28種酸性合成色素的方法，該方法簡便快速，靈敏度高，其回收率及重復性能滿足日常檢測的要求。采用氨基化吸附劑基質分散法對樣品凈化處理，可有效地減少樣本中雜質的干擾。且該方法具有高通量、高靈敏度、高分辨率、高質量精確度及可行的線性范圍，可利用四極桿串聯(lián)飛行時間質譜定性的功能，對28種酸性合成色素進行檢測篩查，適用于水產(chǎn)品中違禁添加色素化合物的快速確證。

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