高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定防曬類化妝品中15種紫外線吸收劑

孟憲雙， 馬 強(qiáng)， 白 樺， 張 慶， 呂 慶

（中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100176）

自20世紀(jì)50年代國際上開始廣泛使用防曬化妝品以來，防曬已成為當(dāng)今化妝品領(lǐng)域的熱門話題之一。防曬劑按其防曬機(jī)理的不同，大體分為紫外線吸收劑和紫外線散射劑（物理阻擋劑）［1］，前者如水楊酸類、對(duì)氨基苯甲酸類、香豆素類等物質(zhì)，這些物質(zhì)的分子能夠吸收紫外線的能量，然后再以熱能或無害的可見光效應(yīng)釋放出來，從而保證皮膚免受紫外線的傷害；后者主要包括氧化鋅、二氧化鈦、氧化亞鐵等物質(zhì)，主要通過散射作用以減少紫外線與皮膚的接觸來防止紫外線對(duì)皮膚的侵害，其防曬效果不如前者明顯，價(jià)格較高；加之前者更易用于配方，所以市售防曬劑80%為紫外線吸收劑［2-4］。近年來，防曬化妝品的需求逐年增加，與之相對(duì)應(yīng)的安全性問題也越來越受廣大消費(fèi)者的關(guān)注。紫外線吸收劑為化學(xué)合成物質(zhì)，在紫外線作用下會(huì)分解和裂變［5，6］，降解后的小分子容易被皮膚吸收［4］，存在誘發(fā)丘疹和膿皰，甚至光毒性和皮膚過敏等風(fēng)險(xiǎn)［7］。目前歐盟及各國對(duì)紫外線吸收劑的使用分別作了限量要求［2］，我國《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007 年版）（以下簡稱《規(guī)范》）［8］對(duì) 28種防曬劑（26種紫外線吸收劑和2種紫外線散射劑）的限量做了明確規(guī)定。因此，建立防曬化妝品中紫外線吸收劑的高效、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法，對(duì)加強(qiáng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全監(jiān)管具有重要意義。

據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，國外研究者近年來的研究對(duì)象主要集中在植物［9］、魚類組織［10］、水樣［11，12］等中的紫外線吸收劑，采用的檢測(cè)手段為液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)；近幾年國內(nèi)學(xué)者對(duì)化妝品中紫外線吸收劑的檢測(cè)方法開展了相關(guān)研究，檢測(cè)方法絕大多數(shù)為 HPLC 法［1，2，13-18］。本研究在系統(tǒng)總結(jié)同行學(xué)者的相關(guān)工作后，注意到在紫外線吸收劑的選擇方面，《規(guī)范》及國內(nèi)報(bào)道［1，2，13-16］中的研究對(duì)象主要集中在甲氧基肉桂酸異戊酯、胡莫柳酯、水楊酸乙基己酯、丁基甲氧基二苯甲?；淄椤⒈交讲⑦溥蚧撬?、4-甲基芐亞基樟腦及二苯酮-3，其使用頻度也較高［19］，且《規(guī)范》也對(duì)其在化妝品中使用的限量值做了規(guī)定（見表1），少數(shù)文獻(xiàn)也研究了二乙氨基羥苯甲?；郊姿峒乎ゼ岸郊淄?，13，15，20］。二苯酮類化合物屬于市售化妝品中易添加的紫外線吸收劑品種［16］，雖然《規(guī)范》只針對(duì)其中的二苯酮-3、二苯酮-4和二苯酮-5的限量值進(jìn)行了規(guī)定，但鑒于二苯酮屬于一大類化合物，其化學(xué)性質(zhì)相近，且均可作為紫外線吸收劑或者紫外線吸收劑輔助制劑，因此，本文在選取上述9種常見紫外線吸收劑外，同時(shí)將二苯酮-1、二苯酮-2、二苯酮-6、二苯酮-8、二苯酮-10及二苯酮-12作為研究對(duì)象，總共囊括了對(duì)氨基苯甲酸（p-aminobenzoic acid，PABA）及其衍生物、水楊酸酯（salicylates）及其衍生物、肉桂酸酯類（cinnamates）、二苯甲酮類化合物 （benzophenones）、鄰氨基苯甲酸酯（anthranilate）及其衍生物、樟腦類衍生物（camphor derivatives）及二苯甲酰甲烷類（dibenzoyl methanes）在內(nèi)的15種紫外線吸收劑。針對(duì)《規(guī)范》及文獻(xiàn)中采用的樣品處理及檢測(cè)方法，歸納起來主要存在以下幾個(gè)問題：a.在前處理過程中使用的四氫呋喃和高氯酸，在上機(jī)測(cè)定前并未除去，容易對(duì)儀器管路聚醚醚酮（PEEK）材料和色譜柱造成腐蝕；b.單以甲醇作為提取溶劑不適合所有基質(zhì)類型，尤其對(duì)某些唇膏等蠟質(zhì)樣品并不能使其完全分散，從而造成回收率偏低，因此方法的普適性不高；c.流動(dòng)相采用高濃度的異丙醇極易造成柱壓上升，使系統(tǒng)難以平衡，造成基線漂移；d.采用高氯酸作為酸性改性劑，引起強(qiáng)氧化性，會(huì)縮短色譜柱的使用壽命，腐蝕儀器的管路等部件。因此，本文選取最大范圍的基質(zhì)類型（包括化妝水、乳液、膏霜及唇膏等）進(jìn)行研究，對(duì)上述文獻(xiàn)中普適性較窄的提取溶劑進(jìn)行改進(jìn)；對(duì)前處理過程中采用的合適的提取溶劑進(jìn)行濃度及用量上的優(yōu)化；對(duì)分析前不適宜的樣品溶劑進(jìn)行有效處理，選擇合適的上機(jī)溶劑且不降低物質(zhì)的響應(yīng)強(qiáng)度；對(duì)分析過程中采用的流動(dòng)相種類及改性劑進(jìn)行優(yōu)化，盡量使色譜儀在采樣過程中的基線保持平穩(wěn)，把儀器對(duì)定量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響降至最低程度。本文在系統(tǒng)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用常規(guī)的C18色譜柱，實(shí)現(xiàn)了15種紫外線吸收劑的全部基線分離，方法定量準(zhǔn)確，便于推廣普及，為防曬類化妝品的質(zhì)量安全監(jiān)管提供了實(shí)用有效的檢測(cè)方法。

表1 15種紫外線吸收劑的相關(guān)信息及在化妝品中的最大允許使用量［8］Table 1 Information and the maximum permissible contents of the 15 UV filters in cosmetics［8］

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1200高效液相色譜儀，配在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測(cè)器（美國Agilent公司）；甲醇和四氫呋喃（色譜純，美國Fisher公司）；飽和氫氧化銨溶液（分析純，北京化工廠）。

p-甲氧基肉桂酸異戊酯、4-甲基芐亞基樟腦、二苯酮-2、二苯酮-3、二苯酮-10、二苯酮-8、二苯酮-6、二苯酮-12及二苯酮-1均購自百靈威科技有限公司；胡莫柳酯、水楊酸乙基己酯、丁基甲氧基二苯甲?；淄椤⒍野被u苯甲?；郊姿峒乎?、苯基苯并咪唑磺酸及二苯甲酮購自Sigma-Aldrich公司；標(biāo)準(zhǔn)品的純度均大于92%。

樣品：市售的33份化妝品，其中包括化妝水9份、乳液7份、膏霜12份和唇膏5份。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取各紫外線吸收劑標(biāo)準(zhǔn)品50 mg（精確至0.1 mg）于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，即得1 g／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于4℃條件下；分別準(zhǔn)確量取1 mL各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至20 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成50 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用甲醇逐級(jí)稀釋成20、10、5、2、1、0.5、0.2 mg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

對(duì)于除唇膏外易于分散的試樣：稱取0.5 g（精確至0.001 g）試樣于25 mL具塞比色管中，向比色管中加入4 mL四氫呋喃（含2 g／L氫氧化銨），渦旋振蕩混勻，再加入80%（v／v）甲醇水溶液定容至10 mL，渦旋混勻，然后超聲提取10 min。取部分提取溶液轉(zhuǎn)移至10 mL具塞塑料離心管中，以10 000 r／min離心10 min，取2 mL上清液經(jīng)氮吹儀吹掃近干后，用2 mL甲醇重新溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行測(cè)定。

對(duì)于唇膏等不易分散的蠟質(zhì)試樣：加入4 mL四氫呋喃（含2 g／L氫氧化銨），渦旋振蕩，如仍不能使試樣完全分散，可采用超聲振蕩加熱（50℃）的方式使試樣分散完全，然后向比色管中加入80%（v／v）甲醇水溶液，定容至10 mL，后續(xù)步驟與其他樣品相同。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：Waters XTerra MS C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 相為水（含 0.1% （v／v）甲酸），B 相為甲醇（含 0.1% （v／v）甲酸）；流速：1 mL／min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫程序：0～5 min，55%A ～25%A；5 ～8 min，25%A ～22%A；8 ～10 min，22%A；10 ～20 min，22%A ～10%A；20 ～21 min，10%A ～5%A；21 ～23 min，5%A；23 ～24 min，5%A ～55%A；24 ～28 min，55%A。檢測(cè)波長：280 nm和311 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

化妝水、乳液、膏霜及唇膏類化妝品的組成成分千差萬別。鑒于化妝品不同類型樣品在前處理過程中的分散難易程度不同，并參考相關(guān)文獻(xiàn)［1，2］，本實(shí)驗(yàn)采用不同體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）的甲醇水溶液對(duì)空白加標(biāo)試樣中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行提取。結(jié)果表明，除唇膏等蠟質(zhì)試樣外，其他基質(zhì)類型樣品在高甲醇含量的水溶液提取條件下，仍有部分目標(biāo)物質(zhì)的提取效率不高，而且唇膏等蠟基質(zhì)試樣用甲醇也無法分散完全，從而導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)回收率較低。針對(duì)該問題，本實(shí)驗(yàn)在試樣中首先加入四氫呋喃分散樣品，然后加入80%（v／v）甲醇水溶液進(jìn)行提取的方法進(jìn)行樣品中目標(biāo)物質(zhì)的提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除唇膏類樣品外，其他基質(zhì)類型化妝品試樣在4 mL四氫呋喃及6 mL 80%（v／v）甲醇水溶液提取條件下所有目標(biāo)物質(zhì)均有較高的回收率。而對(duì)于某些唇膏等蠟基質(zhì)類型樣品，加入四氫呋喃后仍不能使其分散完全，因此本實(shí)驗(yàn)采用振蕩加熱至50℃的方式使唇膏等基質(zhì)分散完全，結(jié)果顯示，此條件下試樣分散效果較好，目標(biāo)物質(zhì)的回收率達(dá)到滿意的效果。

當(dāng)降低空白加標(biāo)水平至0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）以下時(shí)，除2-苯基苯并咪唑-5-磺酸回收率較低外，其他目標(biāo)物質(zhì)的回收率均達(dá)到80%以上。根據(jù)2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，其帶有磺酸基，在中性條件下為解離狀態(tài)，離子狀態(tài)使得其增加了在水相中的溶解度，從而導(dǎo)致其回收率偏低。因此，在提取溶劑中加入流動(dòng)相中常添加的酸性改性劑甲酸來抑制2-苯基苯并咪唑-5-磺酸中磺酸基團(tuán)的解離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在該物質(zhì)含量較低時(shí)，可以顯著提高目標(biāo)物質(zhì)回收率；但在高濃度時(shí)，回收率仍偏低?？紤]到該物質(zhì)在氨化甲醇中有良好的溶解度，因此本實(shí)驗(yàn)又考察了在四氫呋喃中添加不同濃度的氫氧化銨條件下各物質(zhì)的回收率效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加2 g／L氫氧化銨可使得2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的回收率明顯提高，而且其他物質(zhì)的回收率均不受影響。因此，最終確定采用4 mL含2 g／L氫氧化銨的四氫呋喃溶液預(yù)處理試樣，然后加入6 mL 80%甲醇水溶液進(jìn)行提取的前處理?xiàng)l件。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

色譜柱的種類對(duì)分析結(jié)果有至關(guān)重要的影響，C18柱和苯基柱是實(shí)驗(yàn)室常用的反相色譜柱。因采用不同的鍵合技術(shù)和硅羥基封端基團(tuán)的不同，雖同為C18填料，但其選擇性存在區(qū)別。本實(shí)驗(yàn)中選擇了 Waters XTerra C18、Agilent Zorbax SB-Phenyl、大連依利特公司的 Kromasil C18、Agilent Zorbax SB C184種不同品牌、選擇分離性存在差異的色譜柱（規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm）分別進(jìn)行梯度洗脫條件優(yōu)化。結(jié)果表明，二苯酮-1、二苯酮-8和二苯甲酮在Agilent Zorbax SB-Phenyl和 Kromasil C18色譜柱上難以分離；而Agilent Zorbax SB C18對(duì)水楊酸乙基己酯和胡莫柳酯的色譜分離存在難度；在Waters XTerra C18柱上經(jīng)梯度洗脫條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了15種紫外線吸收劑的全部基線分離。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

文獻(xiàn)［13，15］分別選擇了高濃度的異丙醇和四氫呋喃作為流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，異丙醇由于黏度較高，容易引起色譜系統(tǒng)的壓力上升，造成基線不穩(wěn)；而四氫呋喃作為一種常見的環(huán)醚，易被氧化，對(duì)PEEK管路造成損壞，且毒性較強(qiáng)。因此，本研究考慮采用常規(guī)的甲醇或乙腈和水添加一定濃度的酸性改性劑作為流動(dòng)相，以期實(shí)現(xiàn)15種目標(biāo)物質(zhì)的分離。采用乙腈和水為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫時(shí)，由于乙腈的洗脫能力較強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)基線分離較為困難；以甲醇和水為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫效果明顯好轉(zhuǎn)，通過梯度條件的優(yōu)化，基本實(shí)現(xiàn)全部目標(biāo)物的分離，但2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的色譜峰拖尾嚴(yán)重。

為了改善目標(biāo)物的色譜峰形，在流動(dòng)相中分別添加0.1%甲酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的色譜峰形明顯較未添加酸性改性劑時(shí)對(duì)稱，且明顯改善了各物質(zhì)間的分離度。15種紫外線吸收劑的色譜分離譜圖見圖1。

圖1 280 nm和311 nm檢測(cè)波長下15種紫外線吸收劑的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the 15 UV filters at two detection wavelengths of 280 nm and 311 nm

2.2.3 檢測(cè)波長的選擇

通過二極管陣列檢測(cè)器對(duì)15種目標(biāo)化合物在200～400 nm范圍掃描，發(fā)現(xiàn)除二苯甲酮在280 nm波長附近存在最大紫外吸收外，其他所有化合物均在311 nm波長附近有最大紫外吸收，因此，確定同時(shí)采集280 nm和311 nm波長下的色譜分離圖譜，除二苯甲酮采用280 nm波長下的紫外吸收值定量外，其他化合物均采用311 nm波長下各自的紫外吸收值進(jìn)行定量計(jì)算。

2.3 方法的線性關(guān)系及定量限

在1.4節(jié)的最佳分析條件下，分別對(duì)系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以各化合物的質(zhì)量濃度X（mg／L）為橫坐標(biāo)、色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，15種紫外線吸收劑在0.5～50 mg／L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r2≥0.999 1）（見表2）。

在不含目標(biāo)物質(zhì)的空白化妝品基質(zhì)中添加不同濃度的目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照建立的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行預(yù)處理和分析測(cè)定，以10倍信噪比（S／N=10）對(duì)應(yīng)的化合物濃度作為目標(biāo)物質(zhì)的方法定量限，結(jié)果見表2。

2.4 回收率及精密度

在經(jīng)測(cè)定不含15種紫外線吸收劑的空白樣品中添加低、中、高3個(gè)水平的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3節(jié)和1.4節(jié)下的條件進(jìn)行樣品處理和分析測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定量，計(jì)算方法的回收率。15種紫外線吸收劑在低、中、高3個(gè)添加水平下的平均回收率為84.2%～100.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.9%～9.5%（見表3）。由此可見，該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

表2 15種紫外線吸收劑的保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限Table 2 Retention times （tR），linear equations，correlation coefficients （r2）and LOQs of the 15 UV filters

表3 不同類型化妝品中15種紫外線吸收劑的加標(biāo)回收率和精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and precisions（RSDs）of the 15 UV filters spiked in blank cosmetics（n ＝6）

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

按照本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)市售的33份化妝品進(jìn)行紫外線吸收劑的測(cè)定，從1份化妝水和1份乳液樣品中檢出p-甲氧基肉桂酸異戊酯（含量分別為6.7%和8.1%），1份唇膏樣品中檢出4-甲基芐亞基樟腦（含量3.7%），其含量值均在我國規(guī)定［8］的限量范圍內(nèi)，其他樣品均未檢出。檢出的陽性樣品同時(shí)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行了確證，結(jié)果顯示被檢出樣品無假陽性；對(duì)陰性樣品進(jìn)行LC-MS／MS分析，無目標(biāo)成分被檢出。

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)總結(jié)了近幾年學(xué)者關(guān)于紫外線吸收劑檢測(cè)方法的研究工作，主要針對(duì)其方法對(duì)樣品的普適性、樣品前處理技術(shù)中的樣品分散溶劑、萃取溶劑和萃取時(shí)間、LC分析中流動(dòng)相種類等主要參數(shù)進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，并選取包括對(duì)氨基苯甲酸類、水楊酸酯類、肉桂酸酯類、二苯甲酮類、鄰氨基苯甲酸酯、樟腦類衍生物和二苯甲酰甲烷類等在內(nèi)的15種代表性紫外線吸收劑為研究對(duì)象，開發(fā)了化妝水、乳液、膏霜及唇膏等防曬類化妝品中的相關(guān)檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的方法回收率高，精密度良好；用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，成功檢出多例陽性樣品，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證，無假陽性和假陰性結(jié)果出現(xiàn)，說明本研究改進(jìn)的方法準(zhǔn)確、可靠、普適性高，可用于防曬類化妝品中15種紫外線吸收劑的實(shí)際檢測(cè)工作。

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