碳、氮源對紅曲黃色素色價和色調(diào)值的影響

毛 鵬,張薄博,許贛榮

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

碳、氮源對紅曲黃色素色價和色調(diào)值的影響

毛 鵬,張薄博,許贛榮*

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

本文對紅曲黃色素發(fā)酵條件進行了探究,紅曲菌sjs-6發(fā)酵所得紅曲黃色素,僅在420 nm處有單吸收峰。不同碳源種類對色素產(chǎn)量有較大影響,對產(chǎn)色素種類影響不大;氮源對黃色素種類和產(chǎn)量均有較大影響,有機氮源可促使橙、紅色素的產(chǎn)生,而無機氮源更有利于單產(chǎn)黃色素。發(fā)酵進程曲線顯示,72～120 h,菌體量處于穩(wěn)定水平,是紅曲菌sjs-6產(chǎn)黃色素的關(guān)鍵時期,120 h之后隨著碳源耗盡,菌體自溶,產(chǎn)色素能力下降,色價保持穩(wěn)定。通過正交實驗可得,當以6%(w/v)玉米淀粉為碳源,0.4%(w/v)硫酸銨為氮源時,培養(yǎng)基初始pH為5.0,發(fā)酵溫度為30 ℃時,發(fā)酵144 h,黃色素色價可達378 U/mL。產(chǎn)量是國內(nèi)現(xiàn)有報道水平(110 U/mL)的3倍多。由于菌株非突變株,具有較好的穩(wěn)定性。由此,為實現(xiàn)紅曲黃色素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

紅曲,黃色素,發(fā)酵條件,色價,正交實驗

紅曲色素分為紅色素(Rubropunctamine與Monascorubramine)、橙色素(Rubropunctatine與Monascorubrine)和黃色素(Ankaflavine與Monascin)[1]。從食品的顏色上看,使用黃色素的場合日漸增多,例如飲料、食用油、醬、肉、糕點等食品都以黃色為主。目前的許多果汁飲料都采用化學(xué)合成色素。如果采用天然黃色素替代,色素產(chǎn)量將相當可觀。微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)天然紅曲黃色素不受季節(jié)影響,成本較低,轉(zhuǎn)化率高,且基本安全無毒,發(fā)展前景十分廣闊[2]。

紅曲紅色素已實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn),但紅曲黃色素仍處于研究、開發(fā)階段,研究者大都采用誘變方式改造菌種以期提高黃色素產(chǎn)量[3-4],發(fā)酵依然停留在搖瓶水平,且色價及色調(diào)值偏低。如華南理工大學(xué)周波等人通過選育突變株進行液態(tài)發(fā)酵,其黃色素色價僅達到110 U/mL[3],并不適合工業(yè)生產(chǎn)。泰國科學(xué)家通過誘變得到單產(chǎn)黃色素的菌株,固態(tài)[5-6]與液態(tài)發(fā)酵[7]方面都有一定研究成果,但仍未實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。日本目前已實現(xiàn)了紅曲黃色素的工業(yè)化生產(chǎn),產(chǎn)品名為日本天然No.393[8]。

紅曲色素的生物合成途徑并不是完全清楚,研究表明,紅曲紅、黃色素均由橙色素轉(zhuǎn)化而來。因此控制橙色素的轉(zhuǎn)化路徑尤為關(guān)鍵。橙色素在一定的條件下若轉(zhuǎn)化為紅色素,則不僅改變了紅曲色素的類型,更減少了黃色素的產(chǎn)量。在獲得生產(chǎn)菌種及發(fā)酵新方法的基礎(chǔ)上[9],從紅、黃、橙色素的分子結(jié)構(gòu)推測,培養(yǎng)基中碳、氮源的種類及濃度有可能是控制黃色素色價及發(fā)酵液色價的因素之一。本課題在前人研究[9-10]的基礎(chǔ)上,又經(jīng)過不斷的菌種篩選,確定了最佳紅曲菌株后,再從培養(yǎng)基碳、氮源的角度進一步深入研究其對黃色素色價及色調(diào)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅曲菌sjs-6 江南大學(xué)固態(tài)發(fā)酵研究室保藏菌種。

PDA培養(yǎng)基(g/L) 馬鈴薯 200,葡萄糖 20,瓊脂20,pH自然;種子培養(yǎng)基(g/L) 玉米淀粉40,玉米漿粉 10,酵母膏10,KH2PO42.0,K2HPO42.0,MgSO4·7H2O 0.5,初始pH為4.0。搖瓶發(fā)酵基本培養(yǎng)基(g/L) 碳源60,氮源5.0,KH2PO42.0,K2HPO42.0,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl20.1,FeSO4·7H2O 0.01,ZnSO4·7H2O 0.01,MnSO4·H2O 0.03,NaNO32.0,初始pH為4.0。

HY-G-a型回旋式恒溫調(diào)速搖床柜 上海躍進醫(yī)療器械廠;U3900型紫外可見分光光度計 日立;PYX-XHS-405型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠;KDC-16H型臺式高速冷凍離心機 Sigma公司。

1.2 種子培養(yǎng)與發(fā)酵方法

斜面菌種在30 ℃下恒溫培養(yǎng)7～10 d,使菌產(chǎn)生孢子;種子液在30 ℃,180 r/min 培養(yǎng)2～3 d;采用新型萃取發(fā)酵的方法(專利號:201410116854.6),搖瓶發(fā)酵條件為50 mL/500 mL裝量,180 r/min,30 ℃培養(yǎng)5 d。發(fā)酵實驗設(shè)三個平行,計算平均值。

1.3 發(fā)酵正交實驗設(shè)計

選擇玉米淀粉濃度、硫酸銨濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH作為考察因素,以黃色素色價為考察指標,進行了四因素三水平的正交實驗,具體因素及對應(yīng)水平如表1所示。

表1 正交實驗因素水平表

1.4 發(fā)酵液色價及色調(diào)測定方法

[11]，將發(fā)酵液用研磨混勻后取5 mL于50 mL比色管中,用75%的乙醇定容至50 mL,置于55 ℃恒溫水浴中浸提1 h。冷卻至室溫后6000 r/min離心5 min。用相同濃度的乙醇稀釋,并以同種乙醇為空白對照在420 nm處進行全波長掃描,測定OD值。

黃色價(U/mL)=OD420×總稀釋倍數(shù)

色調(diào)值=OD420/OD505

1.5 菌體量測定方法

將發(fā)酵液充分混合均勻后精確量取10 mL過濾,濾渣用蒸餾水洗滌3次后用烘干至恒重的濾紙(m1)抽濾,105 ℃烘干至恒重。用電子天平稱菌體和濾紙總重量,記作m2。菌體量記作X。

X(g/L)=(m2-m1)/10-2

1.6 總糖測定

采用苯酚硫酸法測定發(fā)酵液中的總糖含量[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源種類對黃色素發(fā)酵的影響

本文分別選擇了6%(w/v)葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、糊精、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、糯米粉(后三者均不含氨基酸、蛋白質(zhì)類物質(zhì))作為碳源。結(jié)果表明,淀粉、米粉類的碳源較麥芽糖等簡單碳源更適合黃色素發(fā)酵。如圖1所示,產(chǎn)黃色素效果:玉米淀粉>馬鈴薯淀粉>糯米粉>糊精>麥芽糖>蔗糖>葡萄糖。

圖1 不同碳源種類對黃色素色價及色調(diào)的影響Fig.1 Effects of different carbon sourceson yellow pigments yields

當以玉米淀粉為碳源時,黃色素的色價達到200 U/mL以上,紅曲菌液態(tài)發(fā)酵過程中,淀粉、米粉等碳源成分相對復(fù)雜,會在紅曲菌自身產(chǎn)生的淀粉酶和糖化酶的作用下根據(jù)紅曲菌自身的需要緩慢分解,使發(fā)酵液中可利用的單糖濃度始終維持在較低水平,不會造成菌體的大量生長,同時有利于次級代謝產(chǎn)物紅曲色素的產(chǎn)生和積累。同時,玉米淀粉中不含氨基酸、蛋白質(zhì)類物質(zhì),避免了蛋白類物質(zhì)與橙色素反應(yīng)生成紅色素。而葡萄糖作為底物時色價最低,不到100 U/mL,有報道,這可能是因為葡萄糖屬于速效碳源,高濃度的葡萄糖作為底物時,會產(chǎn)生乙醇,從而抑制了菌體的生長和色素的合成[13-14]。

2.2 氮源種類對黃色素發(fā)酵的影響

分別以蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨六種氮源以0.5%(w/v)的濃度進行發(fā)酵。從不同氮源發(fā)酵所產(chǎn)紅曲色素的全波長掃描圖(見圖2、圖3)發(fā)現(xiàn),硫酸銨等無機氮源產(chǎn)生的紅曲色素,在300～600 nm之間吸收峰單一,位于420 nm處;而有機氮源產(chǎn)生的紅曲色素有多個吸收峰,說明以蛋白胨等有機氮源發(fā)酵會產(chǎn)生多種色素。如圖3所示,蛋白胨作為氮源時產(chǎn)生的紅曲色素吸收光譜曲線在404 nm和501 nm處有吸收峰;氮源為酵母膏時產(chǎn)生的紅曲色素的光譜吸收曲線在405 nm及465 nm處有吸收峰;尿素為氮源時光譜吸收峰在371 nm和510 nm左右。由此得出,硫酸銨等無機氮源更適合黃色素發(fā)酵,同時也驗證了周波等人[15]對無機氮源更有利于紅曲菌產(chǎn)黃色素的報道。

圖2 無機氮源發(fā)酵產(chǎn)生黃色素的全波長掃描圖Fig.2 Spectral absorption curves ofyellow pigments produced by inorganic nitrogen sources

圖3 無機氮源發(fā)酵產(chǎn)生黃色素的全波長掃描圖Fig.3 Spectral absorption curves ofyellow pigments produced by organic nitrogen sources

由于紅曲菌在代謝過程中會產(chǎn)生蛋白酶,有機氮源(蛋白胨、酵母膏、尿素)作為紅曲菌sjs-6發(fā)酵的氮源時,會被分解產(chǎn)生多種氨基酸,很容易與發(fā)酵產(chǎn)生的橙色素發(fā)生反應(yīng),從而將橙色素轉(zhuǎn)變成紅色素[16],同時減小了通往黃色素合成方向的代謝流,因此由有機氮源發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲色素的全波長掃描圖中會有多個吸收峰。無機氮源中不含氨基酸類物質(zhì),所以不會出現(xiàn)該種現(xiàn)象。

不同種類的氮源發(fā)酵產(chǎn)生的黃色素色價(420 nm處)如表2所示,三種無機氮源對應(yīng)的黃色素色價都在200 U/mL以上,其中硫酸銨為氮源時黃色素色價可以達到258 U/mL。而有機氮源產(chǎn)生的色素在420 nm處均不具有吸收峰。

2.3 發(fā)酵條件正交優(yōu)化實驗

在確定了紅曲菌sjs-6發(fā)酵紅曲黃色素的最佳碳源和氮源分別為玉米淀粉和硫酸銨之后,為了進一步考察多種因素對發(fā)酵的影響,進行了四因素三水平正交實驗,結(jié)果如表3所示。

表2 不同氮源種類對紅曲菌sjs-6產(chǎn)色素的影響

表3 四因素三水平正交結(jié)果

表4 紅曲黃色素液態(tài)發(fā)酵條件及黃色素產(chǎn)量比較

實驗表明,四個因素對紅曲菌sjs-6發(fā)酵產(chǎn)紅曲黃色素影響程度:玉米淀粉濃度>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)基初始pH>氮源濃度。玉米淀粉作為碳源是紅曲菌發(fā)酵過程中一大重要因素,其濃度影響著菌體的生長進而影響色素的最終產(chǎn)量,此外,紅曲菌sjs-6發(fā)酵過程對溫度,pH這兩個條件也相對敏感,溫度在2 ℃范圍內(nèi)波動依然對黃色素的產(chǎn)量有較大影響。因此,在發(fā)酵控制中應(yīng)對這兩個因素進行嚴格控制。從k值來看,最優(yōu)組合為A2B2C2D3。由表3中可見,現(xiàn)有組合A2B1C2D3黃色素的產(chǎn)量可達到最高水平,色價為316.0 U/mL，兩個組合僅硫酸銨濃度不同。對A2B2C2D3與A2B1C2D3兩組進行進一步實驗比較,得出,A2B2C2D3((322.7±5.3)U/mL)優(yōu)于A2B1C2D3((317.4±4.5)U/mL)，色價相差不大。綜合原料成本，故選擇玉米淀粉濃度為6%(w/v),硫酸銨濃度為0.4%(w/v),培養(yǎng)基初始pH為5.0,培養(yǎng)溫度30 ℃(A2B1C2D3)為紅曲菌sjs-6產(chǎn)紅曲黃色的發(fā)酵條件。鑒于本次實驗采用的是搖瓶發(fā)酵,發(fā)酵液pH的實時變化情況尚不清楚,其對發(fā)酵產(chǎn)色素的影響仍需進一步研究。

2.4 菌體生長與底物消耗及色素生成的關(guān)系

紅曲黃色素作為紅曲菌的一種次級代謝產(chǎn)物,其發(fā)酵類型屬于生長非偶聯(lián)型發(fā)酵,由圖4可見,0～18 h菌體生長緩慢,屬于菌體生長的遲滯期;24～72 h菌體量迅速增長,達到30 g/L以上;隨后菌體量一直維持在該水平,呈現(xiàn)穩(wěn)定的狀態(tài)。0～72 h階段,色素增長較為緩慢;72～120 h階段,色素生成速度呈直線上升態(tài),是色素生成的黃金時期,120 h以后菌體生長呈現(xiàn)出衰退,色素濃度依然處于緩慢的上升狀態(tài),但其增長速度呈現(xiàn)出減小趨勢(120～144 h),在144 h時黃色素色價達到378 U/mL,接下來的24 h,色價僅增長了7 U/mL,之后基本處于穩(wěn)定,原因可能是碳源基本耗盡,菌體開始出現(xiàn)自溶,產(chǎn)色素能力下降導(dǎo)致產(chǎn)物增長緩慢,濃度趨于穩(wěn)定。因此,在優(yōu)化的發(fā)酵條件下將144 h(6 d)作為一個發(fā)酵周期更為合適。在發(fā)酵過程中保證充足的碳源,維持菌體的生產(chǎn)狀態(tài)是黃色素生產(chǎn)的一大關(guān)鍵。上述發(fā)酵結(jié)果是在分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上得到的,流加發(fā)酵仍有待進一步研究。

圖4 紅曲菌sjs-6的發(fā)酵進程曲線Fig.4 Fermentation process curveof Monascus sp. sjs-6

2.5 紅曲黃色素液態(tài)發(fā)酵條件研究及產(chǎn)量比較

在紅曲黃色素液態(tài)發(fā)酵研究方面,目前已有的研究中,黃色素的最大吸收波長有330、370、410 nm三種。僅有泰國的B.Yongsmith等人由誘變獲得的突變株所產(chǎn)黃色素色價可達到600 U/mL(吸收峰在370 nm);而國內(nèi)周波的誘變菌株發(fā)酵液色價僅有110 U/mL[3]。突變菌株具有不穩(wěn)定的特點,因此,保持菌種及其產(chǎn)量的穩(wěn)定性是一大關(guān)鍵,本研究所用菌株為實驗室保藏的原始菌株,未經(jīng)誘變,不會存在回復(fù)突變等隱患,具有較好的穩(wěn)定性,相對適合發(fā)酵放大及生產(chǎn)。

3 結(jié)論

碳、氮源的種類及濃度對紅曲菌sjs-6發(fā)酵產(chǎn)紅曲黃色素均有較大影響。相比于簡單碳源淀粉類復(fù)雜碳源更有利于提高黃色素產(chǎn)量,其中玉米淀粉效果最好;氮源的種類對色素的種類有顯著影響,無機氮源發(fā)酵僅產(chǎn)生單一的黃色素,而有機氮源發(fā)酵會產(chǎn)生多種其他色素,氮源優(yōu)選硫酸銨。正交實驗表明,濃度為6%(w/v)的玉米淀粉,0.4%(w/v)的硫酸銨,培養(yǎng)基初始pH為5.0,培養(yǎng)溫度30 ℃更適合紅曲菌sjs-6發(fā)酵產(chǎn)紅曲黃色素。在優(yōu)化的條件下以144 h(6 d)作為發(fā)酵周期,黃色素色價可以達到370 U/mL以上,進而為發(fā)酵放大以至生產(chǎn)的實現(xiàn)奠定了產(chǎn)量基礎(chǔ)。

參考文獻

[1]Feng Y,Shao Y,Chen F. Monascus pigments[J]. Application of microbiology and biotechnology,2012,96:1421-1440.

[2]周波,吳吉林,朱明軍,等. 微生物黃色素的研究進展[J]. 微生物學(xué)通報,2010,37(9):1362-1368.

[3]周波,王菊芳,吳振強,等. 高產(chǎn)紅曲黃色素菌株的選育[J]. 微生物學(xué)通報,2008,35(12):1909-1914.

[4]Yongsmith B,Tabloka W,Yongmanitchai W,et al. Culture conditions for yellow pigment formation byMonascussp. KB 10 grown on cassava medium[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,1993,9(1):85-90.

[5]Yongsmith B,Thongpradis P,Klinsupa W,et al. Fermentation and quality of yellow pigments from golden brown rice solid culture by a selectedMonascusmutant[J]. Applied microbiology and biotechnology,2013,97(20):8895-8902.

[6]Yongsmith B,Kitpprechavanich V,Chitradon L,et al. Color mutants ofMonascussp. Kb9 and their comparative glucoamylase on rice solid culture[J]. J Mol Catal B:Enzymatic,2000,10:263-272.

[7]Yongsmith B,Krairak S,Bavavoda R. Production of yellow pigments in submerged culture of a mutant ofMonascusspp[J]. Journal of fermentation and bioengineering,1994,78(3):223-228.

[8]Martinkova L,Patakova Juzlova P,Kren V,et al. Biological activities of oligoketide pigments ofMonascuspurpureus[J]. Food Additive Contaminent,1999(16):15-24.

[9]許贛榮,毛鵬等. 一種偶聯(lián)原位萃取發(fā)酵紅曲黃色素的雙液相發(fā)酵方法[P].專利號201410116854.6.

[10]黃艷,王璐,毛鵬,等. 紅曲液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)橙、黃色素及其色調(diào)研究[J]. 食品工業(yè)科技,2014(19):142-145.

[11]Lian XJ,Wang CL,Guo KL. Identification of new red pigments produced byMonascusruber[J]. Dyes Pigments,2007,(73):121-125.

[12]姜瓊,謝妤. 苯酚-硫酸法測定多糖方法的改進[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(12):316-318.

[13]Chen M H,Johns M R. Effect of carbon source on ethanol and pigment production byMonascuspurpureus[J]. Enzyme and microbial technology,1994,16(7):584-590.

[14]穆洪霞,丁雪梅,黃六斌,等. 紅曲霉發(fā)酵不同底物產(chǎn)色素的研究進展[J]. 中國釀造,2014,33(1):1-4.

[15]周波,浦躍武,朱明軍,等. 氮源對紅曲霉突變株產(chǎn)黃色素的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技,2008,24(2):123-127.

[16]張慧娟,沈良俊,許贛榮,等. 紅曲橙色素的提取及其穩(wěn)定性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2006,31(12):129-133.

Impacts of carbon and nitrogen sources on color value and tone value of yellowMonascuspigments

MAO Peng,ZHANG Bo-bo,XU Gan-rong*

(School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

In this study,the fermentation conditions for the yellow pigments produced by submerged fermentation ofMonascussp. sjs-6 were investigated. It was found that the carbon sources varieties had large impact on the output ofMonascusyellow pigments. However,not only the yield but also the kinds of pigment were affected by different nitrogen sources of culture medium. Organic nitrogen source could promote the production of orange,red pigment,but inorganic nitrogen source was good at the production of yellow pigment. Incubating at 30 ℃ for 6 days,a high yield(378 U/mL)ofMonascusyellow pigments(MYP)was obtained in the optimum fermentation medium,in which,6%(w/v)corn starch,0.4%(w/v)(NH4)2SO4was used as the carbon,nitrogen source,respectively with initial pH of 5.0. Moreover,the MYP had single absorption peak at 420 nm which was different from the studies by other researchers. The yield of MYP presented in this research was more than 3 times over the other reports in our country. As it was a wild strain without mutant,the strain was relatively stable than the mutant strains reported by other researchers. So,this study would lay a foundation for the subsequent large scale production of MYP.

Monascus;yellow pigments;fermentation conditions;color value;orthogonal test

2014-09-22

毛鵬(1990-)，女，碩士在讀，主要從事微生物天然色素發(fā)酵方向研究,E-mail:maopeng15@163.com。

*通訊作者:許贛榮(1957-)，男，博士，教授，主要從事紅曲色素及功能性紅曲研究，E-mail:grxu123@126.com。

國家十二五科技支撐計劃項目(2011BAD23B02)。

TS202.3

A

1002-0306(2015)15-0165-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.027