轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF促進人乳腺癌細胞MDA-MB- 231細胞增殖

張曉麗，米小軼

(1.沈陽市婦嬰醫(yī)院生殖中心, 遼寧 沈陽 110014； 2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 病理科， 遼寧 沈陽 110001)

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研究論文

轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF促進人乳腺癌細胞MDA-MB- 231細胞增殖

張曉麗1，米小軼2*

(1.沈陽市婦嬰醫(yī)院生殖中心, 遼寧 沈陽 110014； 2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 病理科， 遼寧 沈陽 110001)

目的探討TRAF4在人乳腺癌細胞高表達時對細胞增殖能力的影響。方法本實驗共分兩組：實驗組(在乳腺癌細胞MDA-MB- 231中轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒)、對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3空質(zhì)粒)，用細胞免疫熒光及免疫印跡法檢測TRAF4的表達及定位，免疫印跡法檢測p70S6K及S6蛋白磷酸化，用流式細胞術檢測各期細胞比例，MTT方法檢測增殖能力。結果TRAF4在乳腺癌細胞MDA-MB- 231細胞質(zhì)及細胞核中均有表達，并且其在細胞核中的表達顯著低于細胞質(zhì)中的表達(P< 0.05)。在該細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒后，其細胞核內(nèi)TRAF4表達顯著升高(P< 0.05)， p70S6K及S6蛋白磷酸化水平顯著增加(P< 0.05，P< 0.01)，S期細胞比例顯著增加 (P< 0.01)，并且細胞增殖能力顯著上調(diào)(P< 0.01)。結論上調(diào)TRAF4在乳腺癌細胞MDA-MB- 231細胞核中的表達，可能通過促進p70S6K及S6蛋白磷酸化而促進該細胞的增殖。

乳腺癌；TRAF4；細胞增殖

腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor associated factors，TRAFs)是一類重要的胞質(zhì)銜接蛋白，主要參與腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族和toll/白介素-1受體(TIR)家族成員的信號傳導。TRAF家族可以直接或間接的與TNFR的胞質(zhì)部分結合，調(diào)節(jié)多種信號通路[1- 3]，如調(diào)節(jié)NF-κB和JNK的激活等，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、存活，分化與凋亡[4- 7]。TRAF4是腫瘤壞死因子受體相關因子家族的一員，分子含有470aa，相對分子質(zhì)量53 ku，是首先從一組乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結組織中提取mRNA，構建cDNA文庫，應用cDNA文庫差異篩選法克隆出的。目前大多數(shù)學者的實驗證明了TRAF4在人類癌癥中，例如乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌、胰腺癌、膀胱癌等均呈高表達[8]。但TRAF4具體作用機制及其核、漿蛋白表達對乳腺癌細胞生物學行為的影響是否一致仍不清楚。本實驗主要研究TRAF4在乳腺癌細胞系MDA-MB- 231中的表達與定位，以及轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF后，對該細胞增殖能力及細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞系MDA-MB- 231(美國菌種保藏中心)；L15培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibico公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；抗體：TRAF4、S6、pS6、p70S6K、p-p70S6K、β-actin、NF-κB和Lamin B1(Abcam公司)；核漿蛋白抽提試劑盒(Pirece公司)；pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF序列(Addgene公司)；Attractene質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen公司)；細胞裂解液及磷酸酯酶抑制劑(碧云天生物技術研究所)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：細胞用添加10%標準胎牛血清及100單位青鏈霉素的L15培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 Western blot：細胞經(jīng)預冷的PBS清洗3次，加入適量細胞裂解液和磷酸酯酶抑制劑，提取總蛋白。加樣，上樣蛋白量為50 μg。聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜后，室溫下5%正常小牛血清封閉2 h，將膜放在含相應一抗的封閉液中，抗TRAF4(1∶1 000)、S6(1∶1 000)、pS6(1∶1 000)、p70S6K(1∶1 000)、p-p70S6K(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、NF-κB(1∶500)和Lamin B1(1∶500)，4 ℃孵育過夜，與相應二抗室溫孵育2h，膜取出后ECL顯色液顯色。結果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀采集，進行吸光度值測定。實驗重復3次以上。

1.2.3 核漿蛋白抽提：詳見NE-PER蛋白抽提試劑盒說明書。

1.2.4 質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染：根據(jù)制造商說明書進行轉(zhuǎn)染實驗?？召|(zhì)粒pcDNA3作為陰性對照。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽(tetrazolium, MTT)法：處于對數(shù)增殖期的乳腺癌細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液(3×105個/ml)，分別接種于4 個96孔板培養(yǎng)板，將不同處理組細胞培養(yǎng)第24、48、72和96 h后分別加入MTT(5 g/L) 20 μL，繼續(xù)孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO 溶解結晶，選擇波長550 nm，在酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測儀上測定各孔吸光度。實驗重復5次。繪制細胞增殖曲線。

1.2.6 流式細胞術：處于對數(shù)增殖期的乳腺癌細胞用不含有EDTA的胰蛋白酶消化，離心細胞(1 000 r/min，5 min)，收集5×105個細胞，加入500 μL結合緩沖液懸浮細胞，避光加入Annexin V 5 μL混勻后，再加入Propidium Iodide 5 μL混勻，室溫避光10 min，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀檢測不同細胞周期細胞所占百分比。

1.2.7 免疫熒光檢測TRAF4蛋白的表達：取細胞1×104個接種于24孔板中進行細胞爬片，待細胞增殖至70%左右進行細胞免疫熒光操作。4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton-X- 100作用10 min，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min，加入TRAF4(1∶100)一抗，PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃濕盒16 h，PBS洗去一抗，加入相應熒光二抗(1∶200)37 ℃避光孵育30 min，PBS洗去二抗，DAPI(1∶20)染核，室溫孵育30 min,PBS清洗封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.8 細胞形態(tài)學觀察：尼康倒置相差顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)，拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，兩樣本間的比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 TRAF4在乳腺癌細胞系MDA-MB- 231中的表達與定位

TRAF4在乳腺癌細胞系MDA-MB- 231的細胞質(zhì)及細胞核中均有表達，并且其在細胞核中的表達顯著低于細胞質(zhì)中的表達(P< 0.05)(圖1)。

2.2 轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)?？娠@著上調(diào)MDA-MB- 231細胞核表達

在人乳腺癌細胞MDA-MB- 231中轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒之后， TRAF4在細胞核中的表達顯著上調(diào)(P<0.01)(圖2，3)。

2.3 MDA-MB- 231細胞核表達上調(diào)可明顯促進p70S6K及S6蛋白磷酸化

在人乳腺癌細胞MDA-MB- 231中轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒之后， p70S6K及S6蛋白磷酸化水平顯著上調(diào)(P<0.05,P<0.01)(圖4)。

2.4 MDA-MB- 231細胞核表達上調(diào)對細胞增殖能力及細胞周期的影響

在該細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒后，該細胞增殖能力顯著上調(diào)(P<0.01)(圖5A)。S期細胞比例顯著增加(P<0.01)，G1期細胞所占比例顯著減少(P<0.01)(圖5B)。

3 討論

TRAF家族成員在以往的大多數(shù)研究中被證實在癌組織中高表達。研究組在之前的研究中也證實了TRAF1及TRAF2在乳腺癌組織中是過表達的[9- 10]。TRAF4在乳腺癌細胞系MDA-MB- 231中的表達高于人正常乳腺細胞系MCF- 10A，在乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常乳腺組織[11- 12]。這些證據(jù)均提示TRAF4在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起到了重要的作用。但其具體作用機制仍然不清楚。TRAF4是至今為止TRAF家族中唯一一個在細胞核中有表達的成員，這提示了也許細胞核中的TRAF4表達在其可能參與的信號傳導通路中起到一定的作用。本研究分別檢測了TRAF4在人乳腺癌MDA-MB- 231細胞中的表達及定位，結果發(fā)現(xiàn)它可同時表達于細胞質(zhì)及細胞核，并且在細胞核中的表達要顯著低于細胞質(zhì)中的表達?；诓煌毎ㄎ坏谋磉_差異，由此我們設想也許其亞細胞定位與其生物學功能相關。

在隨后的實驗中，在人乳腺癌細胞MDA-MB- 231中轉(zhuǎn)染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒，結果發(fā)現(xiàn)TRAF4細胞核表達顯著增加，細胞質(zhì)表達沒有明顯改變，這首先證明了在該細胞中TRAF結構域缺失的TRAF4質(zhì)粒主要定位于細胞核。并且當外源性干預導致TRAF4單純細胞核表達增加時，該細胞處于有絲分裂期的S期細胞所占比例顯著增加，同時在TNF-α誘導下，p70S6K及S6蛋白磷酸化水平顯著增加。p70S6 絲/蘇氨酸蛋白激酶是一種調(diào)節(jié)細胞生長的重要蛋白激酶，p70S6K磷酸化可激活核糖體40S小亞基S6蛋白，使其易于結合翻譯復合物，促進蛋白質(zhì)合成，調(diào)節(jié)細胞周期及細胞新陳代謝，從而影響細胞生長、增殖、分化及凋亡[13- 14]。p70S6K與TRAF4蛋白一樣，都是核漿穿梭蛋白，TRAF4與p70S6 K可以相互作用，并可激活其底物核糖體小亞基S6蛋白磷酸化[15]。也許TRAF4在細胞核中的高表達可能通過某種方式促進p70S6K及S6蛋白磷酸化，從而促進乳腺癌細胞的增殖，其具體的作用機制還有待于我們進一步的探討。

A.immunofluorescent staining； B.Western blot圖1 TRAF4在乳腺癌細胞MDA-MB- 231中的表達Fig 1 The expression of TRAF4 in the breast cancer cell MDA-MB- 231(×400)

圖2 免疫熒光檢測pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB- 231細胞后定位于細胞核

*P<0.01 compared with vector圖3 免疫印跡法檢測pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB- 231細胞后定位于細胞核Fig 3 pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF localized in nuclei after being transfected into MDA-MB- 231 by Western blot

*P<0.05 compared with vector and blank

A.the cell cycle by FCM；B.the cell proliferation by MTT; *P<0.01 compared with vector圖5 MDA-MB- 231細胞核中TRAF4表達上調(diào)Fig 5 Up-regulation the nuclei expression of TRAF4 in MDA-MB- 231

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Transfecting pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF
improves proliferation of human breast cancer cell MDA-MB- 231

ZHANG Xiao-li1, MI Xiao-yi2*

(1.Dept. of Assisied Reproduction, Shenyang Women’s and Children’s Hospital, Shenyang 110014; 2.Dept. of Pathology, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001,China)

Objective To investigate whether overexpression of TRAF4 in human breast cancer may have impact on its cell proliferation. Methods This study has two groups, MDA-MB- 231 transfected with pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF or pcDNA3. We detected the expression and localization of TRAF4 with immunofluorescence and western blot. We detected the expression of the phosphorylation level of p70S6K and S6 with westernblot. Flow cytometry was used to detecte cell cycle. MTT Assay was used to detected cell reproductive capacity.Results TRAF4 localized in both cytoplasm and nuclei in MDA-MB- 231. Nuclear expression of TRAF4 in nuclei was lower than that in cytoplasm (P<0.05). After pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF was transfected into the cells, the expression of TRAF4 in nuclei was increased (P<0.05). The phosphorylation level of p70S6K and S6 significantly increaseced (P<0.05，P< 0.01). More S phase cells were recorded(P< 0.01) by FCM. The cell proliferation was promoted by MTT (P< 0.01). Conclusions The expression of TRAF4 in nuclei may play an important role in the cell proliferatuion by promoting p70S6K and S6 activation.

breast cancer；TRAF4；cell proliferation

2015- 04- 23

2015- 07- 02

1001-6325(2015)10-1382-05

R737.9

A

*通信作者(corresponding author)：xiaoyi_mi@163.com