薄層色譜法用于生附子指紋圖譜及質(zhì)量評價的研究

曹玲麗 余馬 舒曉燕 侯大斌

摘要：優(yōu)化了薄層色譜條件，并建立生附子薄層色譜指紋圖譜，便于快速準確評價生附子質(zhì)量。結(jié)果表明，以正己烷/乙酸乙酯/甲醇（6.4∶3.6∶1.0，V/V/V）為展開劑，硅膠板-展開劑雙重氨蒸氣飽和20 min，并在氨蒸氣環(huán)境下展開，噴稀碘化鉍鉀溶液顯色，薄層色譜圖效果最佳。生附子薄層色譜圖指紋圖譜共有7個特征斑點，斑點顏色深淺與HPLC含量測定結(jié)果基本相符。薄層色譜法可用于生附子生產(chǎn)實際中的質(zhì)量初步評價，結(jié)果準確可靠。

關(guān)鍵詞：生附子；薄層色譜；高效液相色譜；質(zhì)量評價

中圖分類號：O658.1+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2738-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.047

Research on Fingerprint and Quality Evaluation of Aconite Roots Using

Thin-Layer Chromatography

CAO Ling-li1，YU Ma1，SHU Xiao-yan1，HOU Da-bin1，2

（1.College of Life Science and Engineering， Southwest Science and Technology University， Mianyang 621000， Sichuan， China；

2.Engineering Research Center for Biomass Resource Utilizaiton and Modification of Sichuan Province， Mianyang 621000， Sichuan，China）

Abstract： Improve TLC condition and establish TLC fingerprint of aconite roots as well as appraising its quality preliminarily. The results showed that under the condition of high ammonia， normal hexane-ethyl， acetate-methanol（6.4∶3.6∶1.0，V/V/V） as developing solvent and final visualization with diluted iodized bismuth potassium solution， the effects of TLC were optimal. Additional， the TLC fingerprint of 8 batches of aconite roots had 7 common characteristic spots. Moreover，the colors of the spot simulation match well with the content of 3 diester-type alkaloids. The method provided a specific，exact and simple way to control the quality of aconite roots and its products.

Key words：aconite roots；thin layer chromatography （TLC）；high performance liquid chromatography （HPLC）；quality evaluation

生附子為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）的子根，味辛、甘，性大熱，具有回陽救逆、補火助陽、逐風寒濕邪的功效[1]，是著名四川道地藥材。生附子中主要活性成分烏頭堿類化合物的臨床藥效顯著[2]，也常作為殺蟲劑在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域廣泛應用[3]，生產(chǎn)研究中常將生物堿含量的高低作為評價生附子質(zhì)量的重要指標，且多采用高效液相色譜法（HPLC）[4-7]，但此法對儀器要求高，成本較高，在實際生產(chǎn)中難以廣泛應用，因此尋求快速、準確的檢測方法是非常必要的。

薄層色譜法常用于快速分離和定性分析，這種技術(shù)所使用的設(shè)備和操作比較簡便，可行性較高[8]。目前薄層色譜指紋圖譜已被廣泛用于蒼術(shù)[9]、何首烏[10]、穿心蓮[11]、當歸[12]、吳茱萸[13]等眾多中藥材的種源鑒定及質(zhì)量評價。

本研究通過參考2010年版《中華人民共和國藥典》（下稱《中國藥典》）及附子薄層色譜相關(guān)研究優(yōu)化生附子薄層色譜條件，以8份生附子為材料，3種雙酯型生物堿為對照，建立了生附子薄層色譜指紋圖譜，并為生附子質(zhì)量的初步評價提供準確快捷的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

前期在四川江油附子種質(zhì)資源中篩選的8份特異性較強的生材料，并經(jīng)GAP種質(zhì)資源圃進一步繁育，于2013年12月集中種植于西南科技大學試驗基地。生附子材料編號為H1—H8，種植行長1.5 m，行距0.3 m，每行8株，株距0.1 m。生附子材料均由西南科技大學生命科學與工程學院侯大斌教授鑒定，為烏頭的子根，生附子材料來源見表1。生附子于2014年7月采收，先自來水清洗泥土，再去離子水漂凈，切片，105 ℃烘30 min，65 ℃烘至恒重，打粉過80目篩，備用。

1.2 儀器與試劑

儀器：薄層層析硅膠板（G型）；2 μL薄層毛細點樣管；Varian1200LC/MS高效液相色譜儀（美國Varian公司）；KQ5200B型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI公司）。

試劑：新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿標準品購于中國藥品生物制品檢定所；乙腈、乙二胺為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 生附子薄層色譜條件考察 按2010年版《中國藥典》[1]附子鑒別項下薄層色譜方法配制對照品溶液及供試品溶液，對照品溶液為3種生物堿標準品（濃度均為1 mg/mL）。以4份供試品（H1～H4）為材料，采用單因素法考察氨蒸氣飽和方法，展開劑及顯色劑，得到生附子薄層色譜最優(yōu)條件。單因素考察條件見表2。

1.3.2 生附子薄層色譜指紋圖譜的構(gòu)建 按“1.2.1”項下的生附子最優(yōu)薄層色譜條件對8份生附子供試品進行薄層色譜分析，每份材料3次重復，分析生附子共有特征斑點，建立生附子薄層色譜指紋圖譜。比較與生物堿對照品相對應斑點的顏色差異，分別以數(shù)字1、2代表淺、深兩個顏色等級。

1.3.3 HPLC色譜法測定生附子生物堿含量 采用HPLC法[14]制備3種標準品的標準曲線，并同時測定8份生附子3種生物堿含量，每份材料重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 生附子薄層條件考察結(jié)果

2.1.1 氨蒸氣飽和方法考察 在展開時間相同的情況下，硅膠板-展開劑氨蒸汽雙重飽和20 min后，立即在氨蒸氣環(huán)境下展開的薄層效果最好，分離度較好，斑點清晰，斑點形狀圓整，無拖尾現(xiàn)象，這是由于生附子主要成分生物堿顯堿性，G硅膠板顯弱酸性，兩者在硅膠色譜板上能形成鹽而使Rf值很小或形成復斑[15]，因此保證展開環(huán)境的充分堿性，展開效果較佳。

2.1.2 展開劑考察 《中國藥典》中的正己烷/乙酸乙酯/甲醇（6.4∶3.6∶1.0，V/V/V）展開劑展開效果較好，在相同時間內(nèi)，分離度合適，最高斑點和最低斑點的Rf值分別為0.34和0.81，展距適宜，符合《中國藥典》的規(guī)定。

2.1.3 顯色劑考察 稀碘化鉍鉀顯色效果較好，斑點清晰，且噴霧法操作快捷簡便；10%硫酸-乙醇顯色劑顯色效果較差且顯色斑點數(shù)較少。前者作為顯色劑專一性較強，對于堿性較強的生物堿成分顯色靈敏[16]，后者作為顯色劑是利用其氧化性，高溫下生物堿氧化加劇而呈現(xiàn)紫色斑點，相同條件下兩種顯色結(jié)果比較，前者顯色效果較佳，斑點顏色清晰，容易辨別。

2.1.4 生附子最佳薄層色譜條件 最佳色譜條件為硅膠板-展開劑雙重氨蒸氣飽和20 min，并在氨蒸氣環(huán)境下以正己烷/乙酸乙酯/甲醇（6.4∶3.6∶1.0，V/V/V）為展開劑密封展開40 min，展距為9 cm，稀碘化鉍鉀顯色。此薄層色譜條件下重復3次，薄層色譜圖效果穩(wěn)定良好。裴妙榮等[17]對烏頭堿薄層色譜的研究表明其Rf值與氨蒸氣飽和時間在30 min內(nèi)呈線性關(guān)系，超過此時間范圍，Rf值也隨之增大，烏頭堿斑點也隨之擴散，本試驗過程也證明了此觀點，因此氨蒸氣環(huán)境下展開時間不能過長，40 min較為合適。同時本試驗過程中所用硅膠板充分干燥，展開環(huán)境嚴格密封，薄層色譜層析環(huán)境相對穩(wěn)定，保證了生附子薄層色譜結(jié)果的可重復性。。

2.2 生附子薄層色譜指紋圖譜的建立

8份生附子供試品薄層色譜圖的7個共有斑點代表了生附子提取液中7種生物堿物質(zhì)，其中4、5、7號斑分別為標準品新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿，其余特征斑成分待進一步指示。7個斑點顏色深淺不一，表明7種成分含量的顯著差異，7個特征斑共同構(gòu)成了生附子薄層色譜指紋圖譜（圖1）。8份生附子3種生物堿斑點的顏色深淺表現(xiàn)出顯著差異，4號斑顏色等級分別為1、2、1、1、2、1、1、2；5號斑顏色等級分別為1、2、1、1、2、1、1、2；7號斑顏色等級分別為1、1、1、2、2、1、2、2。

2.3 HPLC色譜法測定生附子生物堿含量

3種生物堿標準品以平均峰面積對質(zhì)量濃度（mg/L）進行線性回歸，在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，根據(jù)回歸方程測定8份生附子3種生物堿含量（表3、表4）。

2.4 HPLC色譜法與薄層色譜法結(jié)果比較

薄層色譜結(jié)果中3種生物堿對應斑點的顏色深淺程度與HPLC色譜法精確定量的結(jié)果初步相符，并且兩種方法相比較，薄層色譜法操作簡單快速，成本較低，這表明通過薄層色譜法初步判斷雙酯型生物堿含量有其獨特優(yōu)勢，可以為附子生產(chǎn)上的高含量雙酯型生物堿品種的初步篩選及進一步研究提供準確、便捷的方法。

3 小結(jié)與討論

附子是重要的商品藥材，目前以生物堿為標準評價生附子質(zhì)量的相關(guān)指紋圖譜研究主要側(cè)重于HPLC法，但HPLC法操作復雜，分析成本高，實際生產(chǎn)研究中難以廣泛應用。薄層色譜指紋圖譜有快速、靈敏度高、成本低、操作方便、專屬性強的優(yōu)點，嚴格控制操作過程與環(huán)境，同樣可以進行較為準確的含量測定，能夠為生附子在實際生產(chǎn)中的應用提供準確、便捷的方法。本研究豐富了生附子指紋圖譜研究，為實際生產(chǎn)中生附子的質(zhì)量初步評價提供科學依據(jù)。

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