精子形態(tài)對體外受精結(jié)局的影響

廖宏慶 聶玉林* 趙 魁 李 銳1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院（湖南衡陽 41001）； .南華星輝生殖健康?？漆t(yī)院； . 婁底市中心醫(yī)院

精子形態(tài)對體外受精結(jié)局的影響

廖宏慶1，2聶玉林2*趙 魁3李 銳2
1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院（湖南衡陽 421001）； 2.南華星輝生殖健康專科醫(yī)院； 3. 婁底市中心醫(yī)院

目的 探討精子形態(tài)對常規(guī)體外受精（IVF）及單精子卵胞漿內(nèi)注射（ICSI）周期的受精率、卵裂率、優(yōu)胚率及妊娠率的影響。方法 將2011年6月至2014年6月在我院行IVF/ICSI治療的周期根據(jù)精子形態(tài)進行分組：IVF周期分為A組（正常精子形態(tài)＜2%），B組（2%≤正常精子形態(tài)＜4%），C組（正常精子形態(tài)≥4%）；ICSI周期分為D組（正常精子形態(tài)＜2%），E組（2%≤正常精子形態(tài)＜4%），F(xiàn)組（正常精子形態(tài)≥4%），分別比較各組間受精率、卵裂率、優(yōu)胚率及妊娠率的差異。 結(jié)果 IVF周期中C組受精率顯著高于B組和A組，差異具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），卵裂率、優(yōu)胚率及妊娠率在A、B、C組之間則無顯著性差異（P＞0.05）；ICSI周期中D組、E組、F組受精率、卵裂率、優(yōu)胚率及妊娠率無顯著性差異（P＞0.05）。 結(jié)論 畸形精子癥會影響IVF周期的受精率，對ICSI周期的受精率無顯著性影響。

精子/畸形； 精子注射， 細胞質(zhì)內(nèi)； 治療結(jié)果

2010年《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版［1］對精子形態(tài)作了詳細的判斷標(biāo)準(zhǔn)，同時根據(jù)近12個月讓女性自然受孕的男性受試者的精液樣本，以95%的可信區(qū)間定義了精子形態(tài)學(xué)參考值。精子正常形態(tài)百分率低反映了精子生成或成熟過程存在某些異常，然而當(dāng)精子濃度較高時，正常形態(tài)精子總數(shù)也能達到較高水平，同時形態(tài)正常的精子并不一定具有正常的精子功能，因此一直以來使用精子形態(tài)來預(yù)測精子功能存在爭議［2-4］。

近年體外受精技術(shù)得到迅速的發(fā)展，已成為治療不孕不育的常用手段，而體外受精對男性精液的要求與自然受精具有一定的差別，尤其是單精子卵胞漿內(nèi)注射，對精子的要求更低，但是研究發(fā)現(xiàn)某些特殊類型的精子，仍可導(dǎo)致全部卵子受精失敗、全部卵子異常受精或者胚胎發(fā)育異常［5］。本研究回顧性的分析了精子形態(tài)對IVF/ICSI結(jié)局的影響，從而為男性不育治療提供參考。

對象與方法

一、研究對象

收集南華星輝生殖健康專科醫(yī)院2011年6至2014 年6月行常規(guī)體外受精及單精子卵胞漿內(nèi)注射（IVF/ ICSI）助孕的684個周期，所有周期均為采用長方案和超長方案進行促排卵，男方禁欲2～7d取精。

二、分組

將IVF周期根據(jù)精子形態(tài)分為A組（正常精子形態(tài)＜2%）、B組（2%≤正常精子形態(tài)＜4%）和C組（正常精子形態(tài)≥4%） 3組；將ICSI周期根據(jù)精子形態(tài)分為D組（正常精子形態(tài)＜2%）、E組（2%≤正常精子形態(tài)＜4%）和F組（正常精子形態(tài)≥4%）。

三、精子形態(tài)學(xué)分析

精液液化后進行精子計數(shù)，根據(jù)精子濃度取0.1～0.5mL精液置于1.5mL EP管中，用生理鹽水清洗、離心兩遍，棄上清，留取0.5mL底層混勻，制片，根據(jù)嚴(yán)格的精子形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進行評估，每份精液樣本制片兩張，經(jīng)過兩位熟練的閱片者審閱，每次計數(shù)200個以上精子（極度少精子癥者除外），計算出正常形態(tài)精子比例。

四、受精及胚胎培養(yǎng)

女方注射絨毛膜促性腺激素（HCG）后（35±1）h，在B超下經(jīng)陰道介導(dǎo)取卵，在體視顯微鏡下找到的卵丘-卵母細胞復(fù)合體（OCCC）裝于2003管中，3～5個卵子/管，管中為1mL 90%的處理液G-IVF。擰松管蓋置于濃度為6%的CO2、溫度為37.0℃的培養(yǎng)箱中平衡。

IVF受精及培養(yǎng)：注射HCG后（39.5±0.5）h 授精，先將1.0×105個精子加入裝有1mL 90%GIVF的2003管中，將卵子轉(zhuǎn)移至已加入精子的2003管中。精卵混合培養(yǎng)（17±0.5）h 觀察原核形成情況，然后在已經(jīng)過CO2濃度為6%、溫度為37.0℃培養(yǎng)箱中平衡過的95%的G1（為卵裂期胚胎培養(yǎng)基）中培養(yǎng)，（65±1）h 觀察胚胎情況。

ICSI受精及培養(yǎng)：注射HCG后（40±0.5）h 用透明質(zhì)酸酶將卵子顆粒細胞去掉，經(jīng)95%G-MPOS洗滌后置于1006皿的95%G-MPOS小滴中，注射HCG后（41.5±0.5）h 將精子在PVP中制動，在95% G-MPOS小滴中對MⅡ卵子行ICSI。授精后（16±0.5）h 觀察原核形成情況，然后在已經(jīng)過CO2濃度為6%、溫度為37.0℃培養(yǎng)箱中平衡過的95%的G1中培養(yǎng)，（65±1）h觀察胚胎情況。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組的基本情況對比

A組、B組、C組之間的女方年齡、男方年齡、女方體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、女方不孕年限、原發(fā)不孕比例、內(nèi)膜厚度及回收卵數(shù)均無明顯差異；D組、E組、F組之間的女方年齡、男方年齡、女方BMI指數(shù)、女方不孕年限、內(nèi)膜厚度及回收卵數(shù)也無明顯差異。D組較E組和F組的女方原發(fā)不孕比例稍高一點，這主要受男方因素影響，見表1。

表1 6組的基本情況表

二、各組之間體外受精結(jié)局的比較

1. A、B、C三組之間受精率具有顯著性差異（P＜0.05），而其他指標(biāo)無顯著性差異（P＞ 0.05），見表2。

2. D組、E組、F組ICSI受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、妊娠率無顯著性差異（P＞0.05），見表3。

表2 A、B、C 3組各項IVF數(shù)據(jù)結(jié)果

表3 D、E、F 3組的各項ICSI數(shù)據(jù)結(jié)果

討 論

精子形態(tài)學(xué)評估已經(jīng)成為男性不育檢查的常規(guī)項目之一，在WHO第五版《人類精液檢查與處理實驗室手冊》推出以來，這種標(biāo)準(zhǔn)的精子形態(tài)檢查程序和嚴(yán)格的精子形態(tài)學(xué)評估方法已經(jīng)被各個男科實驗室所采納，同時男科學(xué)實驗室質(zhì)量控制和室間質(zhì)評也大大的提高了精子形態(tài)學(xué)評估的精確性和準(zhǔn)確性，然而精子形態(tài)只能在一定程度上反映精子的質(zhì)量，并不能準(zhǔn)確地預(yù)估精子功能，因此，值得我們探討的問題是：在精子形態(tài)中究竟是哪個指標(biāo)主要影響了體外受精。

本研究結(jié)果表明，按照嚴(yán)格的精子形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評估精子形態(tài)，在常規(guī)體外受精中隨著精子正常形態(tài)百分率增加，A組、B組、C組受精率呈逐漸升高的趨勢，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，這與Lundin等［6］的研究相符。 當(dāng)精子在生成和成熟的過程中存在某種異常，就可能造成大量的畸形精子產(chǎn)生，而這些畸形精子可能存在染色體缺陷、基因缺陷、精子DNA碎片增多、精子結(jié)構(gòu)或亞細胞結(jié)構(gòu)異常、精子蛋白異常等［5］，從而影響精子的正常功能。IVF治療中與受精關(guān)系最密切的精子結(jié)構(gòu)是精子頂體和精子的尾部，精子頂體區(qū)含有與卵子結(jié)合的蛋白和頂體酶系，而精子尾部的中段含有微管微絲及線粒體［7］，精子尾部的這些結(jié)構(gòu)是精子運動的前提。當(dāng)精子出現(xiàn)這些部位異常的時候，就會出現(xiàn)受精率下降甚至完全不受精。另外，當(dāng)精子異常形態(tài)比例較高時，存在精子內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能異常的概率也會較高。然而ICSI周期中，各組的受精率無統(tǒng)計學(xué)差異，可能因為ICSI是將精子直接注射到卵胞漿內(nèi)，不需要精子游動到卵子透明帶周圍與卵子透明帶發(fā)生黏附、識別和穿透，因此，精子的這些缺陷可以在一定程度上被彌補。而且，使用嚴(yán)重的畸形精子甚至不成熟精子和精子細胞都有成功的報道［8］，說明精子形態(tài)對ICSI 受精的影響有限。

當(dāng)精子頭部核區(qū)出現(xiàn)空泡、過大、過小、形態(tài)嚴(yán)重異常，這可能導(dǎo)致精子的遺傳物質(zhì)出現(xiàn)異常，而精子遺傳物質(zhì)異常則可導(dǎo)致受精及胚胎發(fā)育及妊娠預(yù)后異常。然而本研究表明，A組的優(yōu)胚率和妊娠率雖然低于B組與C組，但是其差異不具有顯著性，同時在ICSI的C組與D組、E組中同樣存在此現(xiàn)象。說明了具有受精能力的精子，其出現(xiàn)遺傳物質(zhì)異常的概率下降。在最近幾年，活動精子細胞器形態(tài)學(xué)檢查（motile sperm organelle morphology examination，MSOME）技術(shù)和胞質(zhì)內(nèi)形態(tài)學(xué)選擇精子注射（intracytoplasmic morphologicall selected injection，IMSI）技術(shù)應(yīng)用于輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域。有研究表明通過這項技術(shù)選擇的無空泡精子用于受精，能夠得到更優(yōu)質(zhì)的胚胎、更高的著床率和妊娠率［9］，說明存在空泡的精子對胚胎發(fā)育是有影響的。另外，一些特殊精子形態(tài)異常，如圓頭精子癥［10］等，可導(dǎo)致IVF甚至ICSI完全受精失敗，但是諸如此類的精子發(fā)生率非常罕見，因此對整體的影響并不大，即便是形態(tài)正常的精子也不能排除精子存在功能上的缺陷。另一方面某些形態(tài)異常的精子并非意味著精子功能一定存在異常，有可能與個體差異有關(guān)［11］。而且“WHO第五版《人類精液檢查與處理實驗室手冊》對于精子形態(tài)的評估，尚不能評估精子細胞器的缺陷，更不能發(fā)現(xiàn)精子更細微的結(jié)構(gòu)異常。

從本研究結(jié)果來看，精子正常形態(tài)百分率對IVF受精率的影響較為明顯。然而由于在IVF/ICSI技術(shù)中，用于受精的精子均通過了精液處理技術(shù)，將活力較好的精子優(yōu)選出來，可在一定程度上將形態(tài)異常的精子去除，而且這種篩選方法因精液樣本的不同也可能存在差異，同時正常形態(tài)精子百分率反映的是比例，當(dāng)精子濃度、活力均較高時，正常形態(tài)精子總數(shù)仍可能較多。因此，今后有必要在處理后正常形態(tài)精子總數(shù)對體外受精結(jié)局的影響方面作進一步的研究。

1 World Health Organization. Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th ed. geneva: World Health Organization， 2010: 7-124

2 Ghirelli-Filho M， Mizrahi FE， Pompeo AC， et al. In uence of strict spermmorphology on the results of classic in vitro fertilization. Int Braz J Urol 2012； 38（4）: 519-28

3 Demir B， Arikan II， Bozdag G， et al. Effect of sperm morphology on clinical outcome parameters in ICSI cycles. Clin Exp Obstet Gynecol 2012； 39（2）: 144-146

4 Kruger TF， Coetzee K. The role sperm morphologyin assisted reproducti-on. Hum Reprod 1999； 5（2）: 172-178

5 Menkveld R. Clinical significance of the low normal sperm morphology value as proposed in the fth edition of the WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. Asian J Androl 2010； 12（4）: 47-58

6 Lundin K， S?derlund B， Hamberger L. The relationship between sperm morphology and rates of fertilization，pregnancy and spontaneous abortion in an in-vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection programme. Hum Reprod 1997； 12（12）: 2676-2681

7 熊承良， 吳明章， 劉繼紅， 等. 人類精子學(xué). 武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社， 52-69

8 陸金春. 精子形態(tài)學(xué)分析的標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量控制. 臨床檢驗雜志 2012； 30（10）: 834-836，841

9 Wilding M， Coppola G， Matteo L， et al. Intracytoplasmic injection of morphologically selected spermatozoa （ IMSI）improvesoutcome after assisted reproduction by deselecting physiologicallypoor quality spermatozoa. J Assist Reprod Genet 2011； 28（3）: 253-262

10 黃東，蔣凌英，徐維海. 圓頭精子受精能力、胚胎發(fā)育潛能及遺傳風(fēng)險的研究. 中華醫(yī)學(xué)雜志 2010； 90（33）: 2351-2353

11 Franken DR， Oehninger S. Semen analysis and sperm function testing. Asian J Androl 2012； 14（2）: 6-13

（2015-05-21收稿）

The in uence of sperm morphology on IVF/ICSI outcome

Liao Hongqing1，2， NieYulin2*， Zhao Kui3， Li Rui2
1.The Second Af liated Hospital of the University of South China， Hengyang 421001， Hunan， China
2. Nanhua Xinghui Reproductive Healt Hospital； 3.The Center Hospital of Lou Di Corresponding author: NieYulin， E-mail: nieyulin200520@sina.com

Objective To investigate the effects of sperm morphology on the fertilization rate， cleavage rate， embryo rate and pregnancy rate of conventional in vitro fertilization （IVF） or intracytoplasmic sperm injection （IVF/ICSI） cycles. Methods The patients who received the IVF/ICSI treatment cycles from June 2011 to June 2014 in our hospital， were divided into groups according to sperm morphology: IVF cycles is divided into group A （normal sperm morphology ＜ 2%）and group B （2% or less of normal sperm morphology ＜ 4%）， group C （normal sperm morphology 4% or higher）； ICSI cycles divided into D group （normal sperm morphology group ＜ 2%）， E （2% or less of normal sperm morphology ＜ 4%），group F （normal sperm morphology 4% or higher）. The fertilization rate， cleavage rate， optimal embryo rate， pregnancy rate between differences groups were comparatively analyzed. Results In the IVF cycles，the fertilization rate of group C was signi cantly higher than that of group A and group B. There were no signi cant difference between the group A， B，and C in the cleavage rate， optimal embryo rate and pregnancy rate； In the ICSI cycles， there were no signi cant difference between the group D， E and F in the fertilization rate， cleavage rate， optimal embryo rate and pregnancy rate. Conclusion Teratozoospermia may affect the fertilization rate of IVF cycle， but no signi cant in uence on that of ICSI cycles.

spermatozoa/abnormalities； sperm Injections， intracytoplasmic； treatment outcome

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.08.010

R 698.2

*通訊作者， E-mail: nieyulin200520@sina.com