狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因DNA免疫研究

蔣 偉，王喜軍，帥 磊，葛金英，任家琰，步志高*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150001)

狂犬病(Rabies)為由Rabies病毒(RV)引起的人獸共患傳染病，在全球范圍內(nèi)流行，以急性、漸進(jìn)性和致死性腦炎為特征，一旦出現(xiàn)神經(jīng)癥狀病死率幾乎高達(dá)100%[1]。全球每年死于狂犬病的人數(shù)高達(dá)5.5萬(wàn)，主要發(fā)生在亞洲和非洲的發(fā)展中國(guó)家[2]。自2000年以來(lái)，我國(guó)狂犬病疫情又呈現(xiàn)快速回升的趨勢(shì)，2011年造成1879人死亡，已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[3]。狂犬病控制最有效的措施是疫苗接種，傳統(tǒng)的狂犬病弱毒疫苗成本低廉，但存在毒力殘留或致病性回復(fù)突變的安全隱患；滅活疫苗安全、有效，但成本昂貴[4]。因此，研制安全有效，成本低廉的動(dòng)物狂犬病疫苗仍具有現(xiàn)實(shí)意義。

DNA疫苗可以同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，保護(hù)動(dòng)物抵抗病原體的攻擊，并且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，便于保存及運(yùn)輸，具有廣泛的應(yīng)用前景[5-6]。

RV為彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)成員[7]。囊膜蛋白(G)是病毒的受體結(jié)合蛋白和主要毒力因子之一，決定著病毒侵入神經(jīng)系統(tǒng)或組織的路徑和致病力，也是誘導(dǎo)機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)的主要抗原[8]。本研究構(gòu)建了表達(dá)哺乳動(dòng)物密碼子優(yōu)化的G基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGRVG，并對(duì)其在靶動(dòng)物犬的免疫原性進(jìn)行了評(píng)估。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、血清、細(xì)胞株和病毒株 真核表達(dá)載體pCAGGS由維斯康新大學(xué)Kawaoka博士惠贈(zèng)；抗RV國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)血清購(gòu)自O(shè)IE狂犬病參考實(shí)驗(yàn)室；抗RV鼠血清、BHK-21、RV弱毒疫苗株ERA、RV標(biāo)準(zhǔn)固定病毒株CVS11均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所人獸共患病研究室保存。

1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；Lipofectam ineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司；綠色熒光素標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(IgG-FITC)、HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(IgG-HRP)購(gòu)自Sigma公司；比格犬購(gòu)自廣州醫(yī)藥工業(yè)研究總院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究開發(fā)中心(國(guó)家犬類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心)。

1.3 真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGG-RVG的構(gòu)建與制備通過(guò)人工合成基因的方法合成按哺乳動(dòng)物偏嗜密碼子優(yōu)化的RV弱毒疫苗株ERA(FJ913470)G基因，在起始密碼子前引入 Kozak序列(GCCGCCACC)，兩端引入EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶序列，克隆至pUC57載體(GenScript NO.SD1176)中構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC57-RVG；以Bam HⅠ單酶切pCAGGS，去除其中SV40ori序列(SV40復(fù)制起始序列)，連接構(gòu)成質(zhì)粒 pCAGGS△SV40ori；再以EcoRⅠ和 XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切pUC57-RVG，將G基因亞克隆至pCAGGS△SV40ori中的雞β-actin轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子下游，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGG-RVG。提取重組質(zhì)粒用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染及動(dòng)物免疫試驗(yàn)。

1.4 pCAGG-RVG的瞬時(shí)表達(dá)及間接免疫熒光(IFA)檢測(cè) 按照Lipofectam ineTM2000說(shuō)明書方法，將pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染至生長(zhǎng)過(guò)夜、密度約為80%的單層BHK-21細(xì)胞；同時(shí)，以RV弱毒疫苗株ERA按M.O.I.為0.1的劑量感染BHK-21細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照；以轉(zhuǎn)染pCAGGS的BHK-21細(xì)胞作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染36h后，以預(yù)冷的3%多聚甲醛固定細(xì)胞30m in；1%BSA封閉20m in；以鼠抗RV血清(1∶100)為一抗，IgG-FITC為二抗(1∶200)進(jìn)行IFA檢測(cè)。

1.5 Western blot分析 將2μg的pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染至生長(zhǎng)過(guò)夜、密度約為80%的單層BHK-21細(xì)胞。36h后收獲、裂解細(xì)胞，加入電泳緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE電泳；將蛋白電轉(zhuǎn)印至尼龍膜上，以鼠抗 RV 血清(1∶100)為一抗，IgG-HRP(1∶2500)為二抗，DAB顯色進(jìn)行western blot檢測(cè)。

1.6 動(dòng)物免疫 將pCAGG-RVG按500μg/1m L/條的劑量經(jīng)肌肉注射免疫7條RV中和抗體陰性的一年齡比格犬，間隔4周再以相同劑量、相同免疫途徑加強(qiáng)免疫一次。同時(shí)，以質(zhì)粒pCAGGS為對(duì)照免疫5條RV中和抗體陰性比格犬。分別于初次免疫前、后不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)前肢靜脈采集血液、分離血清，用于中和抗體檢測(cè)。

1.7 中和試驗(yàn) RV中和抗體的檢測(cè)參照文獻(xiàn)[9]方法在96孔板上進(jìn)行。將血清樣品于56℃滅活30min，分別以DMEM 9倍稀釋，再連續(xù)3倍稀釋，每稀釋度體積為 50μL，并與 50μL約含 100TCID50的CVS11病毒液混合，37℃感作1h，每孔加入約105BHK-21細(xì)胞，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照及細(xì)胞空白對(duì)照。(陽(yáng)性對(duì)照為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)血清，起始血清稀釋滴度為0.5IU/m L)，血清每個(gè)稀釋度做4個(gè)平行孔，5%CO237℃培養(yǎng)48h后進(jìn)行IFA檢測(cè)，并計(jì)算血清RV中和抗體滴度。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 將人工合成的表達(dá)RV G蛋白的重組質(zhì)粒pCAGG-RVG以EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，得到大小約為1650bp和4400bp的兩個(gè)片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符，表明RV G蛋白基因在真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS中獲得重組。

圖1 pCAGG-RVG的酶切鑒定Fig.1Identification of pCAGG-RVG by restriction enzyme digestions

圖3 Western blot檢測(cè)RV G蛋白在BHK-21細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3Western blot analyses of expression RV G protein in BHK-21cells

2.2 G蛋白表達(dá)的IFA鑒定 以pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，36h后以抗RV鼠血清為一抗，IgGFITC為二抗進(jìn)行IFA檢測(cè)。結(jié)果顯示，抗RV鼠血清檢測(cè)pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞以及檢測(cè)RV ERA株感染BHK-21細(xì)胞時(shí)也呈現(xiàn)綠色陽(yáng)性熒光信號(hào)(圖2A、B)，而檢測(cè)pCAGGS轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞時(shí)則呈現(xiàn)陰性熒光信號(hào)(圖2C)。表明pCAGGRVG在轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后能夠表達(dá)RV G蛋白。

圖2 間接免疫熒光檢測(cè)RV G蛋白在BHK-21細(xì)胞中的表達(dá)(100×)Fig.2Detection of RV G protein expression in BHK-21cells by IFA(100×)

2.3 G蛋白表達(dá)的western blot檢測(cè) 以pCAGGRVG轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞裂解物上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后以抗RV鼠血清為一抗，western blot顯示出特異的67ku條帶，與G蛋白理論值相符(圖3)。表明RV G蛋白在pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞中獲得表達(dá)。

2.4 血清中和試驗(yàn) 分別以pCAGGS和pCAGGRVG免疫比格犬，免疫后不同時(shí)間采血。中和試驗(yàn)結(jié)果表明，初次免疫后4周，pCAGG-RVG免疫犬血清RV中和抗體平均滴度為3.23IU/m L(7.9IU/m L、0.38IU/m L、1.14IU/m L、5.92IU/m L、2.6IU/m L、0.29IU/m L和4.5IU/m L)，而pCAGGS免疫犬血清RV中和抗體為陰性。加強(qiáng)免疫后2周，平均滴度上升到峰值8.21IU/m L(13.50IU/m L、7.79IU/m L、13.5IU/m L、4.5IU/m L、5.92IU/m L、7.79IU/m L和4.5IU/m L)，隨后逐漸下降。初免后27周，平均滴度下降到 3.99IU/m L(7.79IU/m L、3.24IU/m L、2.6IU/m L、2.6IU/m L、2.6IU/m L、0.87IU/m L 和1.14IU/m L)。然而初免后第54周，平均滴度仍然可達(dá) 2.88IU/m L(7.79IU/m L、2.6IU/m L、2.6IU/m L、2.6IU/m L、2.6IU/m L、0.87IU/m L和 1.14IU/m L)。表明pCAGG-RVG是一個(gè)具有良好免疫效力的犬狂犬病候選DNA疫苗(圖4)。

圖4 狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG對(duì)犬的免疫效力Fig.4Immunogenic efficacy of the pCAGG-RVG in dogs

3 討 論

本研究構(gòu)建了表達(dá)哺乳動(dòng)物密碼子優(yōu)化的RV囊膜糖蛋白G基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGRVG。IFA和western blot結(jié)果表明，RV G蛋白在pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞中獲得正確表達(dá)，并且具有良好的反應(yīng)原性。應(yīng)用該重組質(zhì)粒作為DNA疫苗免疫比格犬，可以誘導(dǎo)顯著而持久的RV中和抗體反應(yīng)。

免疫動(dòng)物血清中RV中和抗體水平是評(píng)價(jià)狂犬病疫苗免疫效力的一個(gè)重要指標(biāo)。Osorio等研究結(jié)果顯示，以1個(gè)劑量(100μg/條)表達(dá)RV CVS株G蛋白的DNA疫苗經(jīng)肌肉注射途徑免疫犬，僅能誘導(dǎo)低水平的RV中和抗體反應(yīng)；然而將免疫劑量提高到300μg/條時(shí)，可以增強(qiáng)RV中和抗體反應(yīng)[10]。這些研究結(jié)果提示，狂犬病DNA疫苗免疫犬可以誘導(dǎo)劑量依賴性的RV中和抗體反應(yīng)，增加免疫劑量可能會(huì)獲得更高水平的RV中和抗體反應(yīng)。我們的研究結(jié)果也證明這一推測(cè)，以狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG按500μg/只的劑量免疫犬，可以誘導(dǎo)顯著的RV中和抗體，初次免疫后4周免疫犬血清中RV中和抗體滴度平均值可達(dá)3.23IU/m L。

另外，Perrin等研究表明：以1個(gè)劑量(100μg/只)的表達(dá)RV PV株G蛋白的DNA疫苗經(jīng)肌肉注射途徑免疫犬，僅能誘導(dǎo)低水平的RV中和抗體反應(yīng)，但間隔一定時(shí)間進(jìn)行加強(qiáng)免疫可以增強(qiáng)RV中和抗體反應(yīng)[11]。這與本研究結(jié)果一致，我們以狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG按500μg/條的劑量免疫犬，可以誘導(dǎo)顯著的RV中和抗體反應(yīng)，初次免疫后4周免疫犬血清中RV中和抗體滴度平均值可達(dá)3.23IU/m L；間隔4周以相同劑量、途徑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，可以顯著增強(qiáng)RV中和抗體反應(yīng)，加強(qiáng)免疫后2周免疫犬血清中RV中和抗體滴度平均值高達(dá)8.21IU/m L。

盡管本研究以狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG免疫犬的血清中RV中和抗體滴度峰值平均值(8.21IU/m L)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于前期研究中分別以RV ERA疫苗株(106FFU/只)、表達(dá)RV G蛋白基因的重組新城疫病毒rLa-RVG(109.3EID50/只)和表達(dá)RV G蛋白基因的重組犬瘟熱病毒rCDV-RVG(106TCID50/只)誘導(dǎo)的RV中和抗體滴度峰值平均值(70.4IU/m L、96IU/m L和96.71IU/m L)[12-13]，然而狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG免疫犬血清中的RV中和抗體滴度下降更為緩慢，初次免疫后54周免疫犬血清中RV中和抗體滴度平均值仍可達(dá)2.88IU/m L，而0.5IU/m L的RV中和抗體滴度是能夠保護(hù)動(dòng)物免受致死劑量RV街毒攻擊的最小滴度[13]。這一結(jié)果提示：pCAGG-RVG的免疫接種能夠?yàn)槿峁?年以上的有效保護(hù)。因此，狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG是一個(gè)有希望的狂犬病候選疫苗。

[1]OsinubiM O V,Wu X,Franka R,et al.Enhancing comparative rabies DNA vaccine effectiveness through glycoprotein gene modifications[J].Vaccine,2009,27(51):7214-7218.

[2]Martinez L.Global infectious disease surveillance[J].Int J Infect Dis,2000,4(4):222-228.

[3]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.2012年中國(guó)狂犬病年會(huì)在京召開[EB/CD].http://www.moh.gov.cn/wsb/01100213/201205/54985.shtm l,2009.

[4]Akbar S K,Horrike N,Onji M.Prognostic importance of antigen-presenting dendritic cells during vaccine therapy in a murine hepatitis B virus carrier[J].Immunology,1999,96(1):98-108.

[5]韓岳，王希良.DNA疫苗的免疫機(jī)制及其優(yōu)化策略[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2005，2(2)：143-146.

[6]Leclerc C.New approaches in vaccine development[J].Comp Immunol M icrobiol Infect Dis,2003,26(5/6):329-341.

[7]華濤，陶麗紅，葛金英，等.表達(dá)綠色熒光蛋白重組狂犬病病毒Flury-LEP的構(gòu)建及其用于中和抗體檢測(cè)的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，8：581-585.

[8]Johnson N,Mansfield K L,Fooks A R.Canine vaccine recipients recognize an immunodom inant region of the rabies virus glycoprotein[J].JGen Virol,2002,83(11):2663-2669.

[9]Reed L,Muench H.A simplemethod of estimating fifty percent endpoints[J].Am JEpidemiol,1938,27:493-497.

[10]Osorio JE,Tom linson C C,Frank R S,et al.Immunization of dogs and cats with a DNA vaccine against rabies virus[J].Vaccine,1999,17(9-10):1109-1116.

[11]Perrin P,Jacob Y,Aguilar-Sétien A,et al.Immunization of dogs with a DNA vaccine induces protection against rabies virus[J].Vaccine,2000,18(5-6):479-486.

[12]Ge Jin-ying,Wang Xi-jun,Tao Li-hong,et al.Newcastle disease virus-vectored Rabies vaccine is safe,highly immunogenic,and provides long-lasting protection in dogs and cats[J].J Virol,2011,85(16):8241-8252.

[13]Wang Xi-jun,Feng Na,Ge Jin-ying,et al.Recombinant canine distemper virus serves as bivalent live vaccine against rabies and canine distemper[J].Vaccine,2012,30(34):5067-5072.