不同NDV株V蛋白多克隆抗體的制備和初步應(yīng)用

傅 強(qiáng)，仇旭升，陳素娟，譚 磊，宋翠萍，于圣青，丁 鏟*，彭大新*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由 ND病毒(NDV)引起的一種高度接觸性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失[1]。NDV為單股負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA病毒，基因組依次編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，即核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)[2-4]。NDV P基因在轉(zhuǎn)錄過程中能夠通過RNA編輯機(jī)制，在編輯位點(diǎn)插入一個或兩個非模板G，從而產(chǎn)生閱讀框位移+1和+2的mRNA，分別編碼V蛋白(+1G)和W蛋白(+2G)[1]。P基因編碼的3種蛋白(P、V和W)具有共同的N端部分，而C端部分各異[5]。研究顯示，在NDV感染過程中，P基因轉(zhuǎn)錄的病毒mRNA編碼P蛋白的占68%，V蛋白占29%，W蛋白占2%[5-6]。

P編碼蛋白的功能為目前副黏病毒研究的熱點(diǎn)問題。NDV P基因編碼蛋白的相關(guān)功能研究剛剛起步的主要原因在于缺少合適的檢測手段，一方面P、V和W蛋白具有共同的N端和不同的C端，需要3種抗體區(qū)分期表達(dá)；另一方面，NDV各種基因型病毒株表達(dá)的V蛋白和W蛋白的氨基酸同源性不高，缺少通用的檢測抗體。據(jù)報道，麻疹病毒、仙臺病毒、腮腺炎病毒以及尼帕病毒等副黏病毒編碼的V蛋白具有介導(dǎo)病毒免疫逃逸的功能，包括IFN信號抑制、凋亡抑制、細(xì)胞周期改變、雙鏈RNA信號抑制和IFN生物合成等[7-9]。因此，本研究比較NDV P、V、W蛋白抗原性差異，制備能夠針對多種基因型NDV P、V、W蛋白的多克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上研究NDV感染細(xì)胞中V蛋白的表達(dá)差異。

1 材料和方法

1.1 病毒株和細(xì)胞 NDV La Sota及9a5b株由上海獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室保存，ZJ1株由揚(yáng)州大學(xué)劉秀梵教授惠贈，病毒分別接種9日齡～11日齡SPF雞胚擴(kuò)增后，-80℃凍存?zhèn)溆?；NDV NP蛋白單克隆抗體(MAb Anti-NP)由上海獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室詹媛制備并提供；9a5b V蛋白和ZJ1V蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；HeLa、DF1和Vero細(xì)胞由上海獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室保存；SPF級BALB/c小鼠和ICR小鼠購自上海實(shí)驗(yàn)動物資源中心；SPF種蛋購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.2 載體和主要試劑 pCI-9a5b-P、pCI-ZJ1-P由本實(shí)驗(yàn)室制備；pET-28a(+)購自Invitrogen公司；pCI-neo載體及轉(zhuǎn)染試劑Fugene HD Transfection Reagent購自 Promega公司；pCold TF、EcoRⅠ、XhoⅠ、Hin dⅢ、NheⅠ、Primer star酶等購自TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒及凝膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司；DH5α、BL21感受態(tài)細(xì)胞、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker購自北京康為世紀(jì)有限公司；His-Band Resin Chromatography Kit購自Novagen公司；顯影液、定影液試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；ECL發(fā)光試劑盒購自Pierce公司。

1.39 a5b V蛋白多克隆抗體的制備 以pCI-9a5b-P質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物(p9PNF/p9PNR和p9VCF/p9VCR)(表1)擴(kuò)增V蛋白PNT端和半胱氨酸富集區(qū)(CTD)端，并于PNT前引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ(G↓AATTC)，其后引入 Hin dⅢ (A↓AGCTT)；CTD前引入Hin dⅢ (A↓AGCTT)，其后引入 XhoⅠ(C↓TCGAG)。PCR擴(kuò)增后分別酶切產(chǎn)物及pET-28a(+)載體，并將PNT端和CTD端連接獲得9a5b V基因，克隆至pET-28a(+)載體中，命名為pET-28-9V。測序正確后轉(zhuǎn)化BL21細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白經(jīng)8M尿素溶解及透析復(fù)性純化包涵體，以50μg/只劑量免疫BABL/c小鼠，每次免疫間隔2周，免疫4次后采血，收集血清，獲得9a5b V蛋白多克隆抗體(Anti-V)。

1.4 ZJ1株V蛋白CTD多克隆抗體的制備 因后續(xù)反向遺傳驗(yàn)證的需要，制備針對ZJ1V蛋白CTD的多克隆抗體。設(shè)計引物p7VC-EcoRⅠ-F和p7VCSalⅠ-R(表1)，并以pCI-ZJ1-P質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增ZJ1V蛋白CTD端?？寺≈羛Cold TF載體中，命名為pCold-TF-ZJ1-VCD，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)，采用His-Band Resin Chromatography Kit進(jìn)行純化。50μg/只劑量免疫BABL/c小鼠，每次免疫間隔2周，免疫4次后采血，收集血清，獲得ZJ1VCD多克隆抗體(Anti-VCD)。

1.5 V蛋白多克隆抗體的檢測 經(jīng)間接ELISA方法測定，兩種免疫血清以1∶1000稀釋反應(yīng)效果最佳。將pCI-9a5b-V、pCI-ZJ1-V及pCI-neo轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，并將 9a5b、ZJ1株(0.5MOI)感染 DF1細(xì)胞24h，分別收集細(xì)胞樣品，進(jìn)行SDS-PAGE分析，轉(zhuǎn)印至NC膜后分別用對應(yīng)血清孵育，進(jìn)行ECL顯影。1.6V蛋白在感染細(xì)胞中的表達(dá) 將NDV 9a5b、La Sota、Herts/33和ZJ1株分別以0.5MOI感染DF1和HeLa細(xì)胞，同時設(shè)立空白對照組，病毒吸附1.5h后，洗滌3次，培養(yǎng)24h觀察細(xì)胞病變，并收取細(xì)胞樣品，分別采用Anti-V及Anti-VCD孵育，western blot檢測V蛋白；同時采用MAb Anti-NP檢測NP蛋白，作為陽性對照。

表1 引物序列Table 1Primer sequence

2 結(jié) 果

2.1 V蛋白同源性分析 將NDV ClassⅠ和ClassⅡ部分病毒株V蛋白、W蛋白及其PNT、CTD結(jié)構(gòu)域進(jìn)行氨基酸同源性分析，其中9a5b為ClassⅠ株，其余為ClassⅡ各基因型代表病毒株。結(jié)果顯示，各病毒株V、W蛋白及PNT、CTD結(jié)構(gòu)域同源性均差異較大。其中，V蛋白氨基酸同源性為60.4%～90.4%，差異明顯；W蛋白為48.3%～88.4%；而對于V蛋白結(jié)構(gòu)域，PNT同源性為57.3%～89.3%，CTD同源性為62.9%～92.4%。表明NDV各基因型病毒株V、W蛋白同源性較低。

2.29 a5b V蛋白表達(dá)及多克隆抗體的制備 經(jīng)PCR擴(kuò)增出402bp V蛋白PNT端和336bp V蛋白CTD端 (圖1)，分別酶切克隆至載體pET-28a(+)中獲得重組質(zhì)粒pET-28-9V，經(jīng)酶切測序驗(yàn)證為陽性克隆后，0.1mM IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)8h。SDSPAGE結(jié)果顯示，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白在37ku處出現(xiàn)條帶，與預(yù)測相符。重組蛋白經(jīng)超聲波裂解，SDS-PAGE檢測表明該蛋白主要以包涵體形式存在。對包涵體進(jìn)行純化及透析復(fù)性獲得純化蛋白(圖2)。

將重組蛋白免疫小鼠后獲得的抗血清進(jìn)行western blot檢測，結(jié)果顯示Anti-V能夠與9a5b V蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)(圖3)。該結(jié)果表明，所獲得的Anti-V反應(yīng)性良好。

2.3 ZJ1株V蛋白CTD多克隆抗體的制備 以pCI-ZJ1-P質(zhì)粒為模板擴(kuò)增ZJ1V蛋白CTD端(VCD)，獲得312bp的目的條帶(圖4)，采用EcoRⅠ和 SalⅠ酶切回收條帶及pCold TF載體并連接獲得重組質(zhì)粒pCold-TF-ZJ1-VCD，經(jīng)測序驗(yàn)證序列正確，轉(zhuǎn)化BL21誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示在70ku處出現(xiàn)一條蛋白帶，并且蛋白主要存在于上清中，沉淀中含量較少。利用His-Band Resin Chromatography Kit純化后獲得較為單一的目的蛋白(圖5)。將重組蛋白連續(xù)4次免疫小鼠，制備多克隆抗體，western blot檢測結(jié)果顯示多克隆抗體能夠與(轉(zhuǎn)染及感染)ZJ1V蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)(圖6)。

圖1 PCR擴(kuò)增9a5b V蛋白PNT和CTD端Fig.1PCR amplification of PNT and CTD of 9a5b V protein

圖2 SDS-PAGE檢測pET-28a-9V的表達(dá)Fig.2Purified recombinant protein from pET-28a-9V detected by SDS-PAGE

pCI-neo:Cell lysate of Vero cells transfected with pCI-neo vector after 48h;9a5b V:Cell lysate of Vero cells transfected w ith pCI-9a5b-V after 48h;Mock:Mock infected DF1cell lysate;9a5b:DF1cell lysate infected with 9a5b virus after 24h

圖4 PCR擴(kuò)增ZJ1V蛋白CTD端Fig.4PCR production of the C-terminal domain of ZJ1V gene

圖5 SDS-PAGE檢測VCD純化效果Fig.5Detection of purified recombinant VCD by SDS-PAGE

pCI-neo:Cell lysate of Vero cells transfected with pCI-neo vector after 48h;ZJ1V:Cell lysate of Vero cells transfected w ith pCI-ZJ1-V after 48h;Mock:Mock infected DF1cell lysate;ZJ1:DF1cell lysate infected with ZJ1virus after 24h

2.4 V蛋白表達(dá)的檢測 分別使用Anti-V、Anti-VCD和MAb Anti-NP經(jīng)western blot檢測9a5b、La Sota、Herts/33和ZJ1感染細(xì)胞樣品中V蛋白以及NP蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，La Sota和Herts/33株NP蛋白在HeLa和DF1細(xì)胞中表達(dá)量無明顯差別(圖7A、7B)，9a5b株在兩種細(xì)胞中NP蛋白表達(dá)量均不高，ZJ1株在DF1細(xì)胞中增殖滴度很高，但在HeLa細(xì)胞中NP蛋白的表達(dá)量低于MAb檢測極限。與NP蛋白的western blot條帶相比較，在使用Anti-VCD進(jìn)行 western blot檢測時，ZJ1、La Sota、Herts/33的V蛋白在DF1細(xì)胞中表達(dá)量高(圖7A)，而在HeLa細(xì)胞V蛋白的表達(dá)均受到大幅抑制(圖7B)。使用 Anti-V時，9a5b、La Sota、Herts/33和ZJ1的V蛋白均能夠顯出條帶，但病毒株間V蛋白表達(dá)存在差異，9a5b V蛋白表達(dá)量較低(圖7C)，同時各病毒株V蛋白在HeLa細(xì)胞中也受到抑制(圖7D)。

A,B:DF1(A)and HeLa(B)cell lysate infected w ith NDV,which incubated w ith Anti-V and MAb Anti-NP,respectively;C,D:DF1(C)and HeLa(D)cell lysate infected w ith NDV,which incubated with Anti-VCD and MAb Anti-NP,respectively

3 討 論

NDV的P基因能夠通過“RNA編輯”機(jī)制編碼額外的兩種非結(jié)構(gòu)蛋白：V蛋白(+1G)和W蛋白(+2G)[5]。盡管所有副黏病毒P基因衍生的這一系列非結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)量均不高，但對于病毒的復(fù)制卻是不可或缺的[10-12]。早期研究表明，V蛋白為一種毒力因子，與病毒的抗先天性免疫機(jī)制相關(guān)，對于病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和致病性起著重要作用[11]。

V蛋白的共同特點(diǎn)是在C端有一段保守的半胱氨酸富集區(qū)，即C端結(jié)構(gòu)域(CTD)。該區(qū)域被認(rèn)為與病毒抗IFN活性及病毒毒力有關(guān)[13-15]。對于NDV的V蛋白CTD結(jié)構(gòu)域而言，ZJ1與La Sota氨基酸同源性為72.4%，與Herts/33同源性為81.0%，與9a5b同源性為62.9%。本實(shí)驗(yàn)獲得的兩株多克隆抗體具有較好的敏感性和特異性，已能夠滿足常用NDV V蛋白檢測的需求。

NDV V蛋白主要是通過干擾IFN信號通路來拮抗宿主抗病毒反應(yīng)。研究表明，V蛋白能夠使STAT1發(fā)生泛素化降解，從而阻斷IFN信號[13-15]。2003年P(guān)ark等構(gòu)建了一株V蛋白缺失但表達(dá)禽流感病毒IFN拮抗蛋白NS1的重組病毒。結(jié)果顯示，NDV V(-)/NS1對CEF細(xì)胞的IFN抑制作用明顯強(qiáng)于人源細(xì)胞系，這意味著NDV V蛋白對其宿主嗜性存在一定的影響[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各病毒株V蛋白在不同細(xì)胞中的表達(dá)有很大差異。在DF1細(xì)胞中，V蛋白表達(dá)量豐度很高；而在HeLa細(xì)胞中，V蛋白表達(dá)則受到很大程度的抑制。分析其原因?yàn)?，ND是感染禽類的烈性傳染病，禽類尤其雞是其敏感宿主，由此，NDV在禽源細(xì)胞中復(fù)制能力及致病力強(qiáng)于其他種屬來源細(xì)胞。V蛋白是NDV重要的致病因子，V蛋白的高豐度表達(dá)是NDV在禽類細(xì)胞中增殖速度高于哺乳動物細(xì)胞的原因；反觀NDV在哺乳動物細(xì)胞中的生長，IFN拮抗因子V蛋白明顯受到了抑制?？梢酝茰y，哺乳動物細(xì)胞中存在某種抗V蛋白或抑制NDV增殖的屏障，這也就抑制了NDV對哺乳動物的感染。

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