腸炎沙門氏菌hfq缺失株的構(gòu)建和對fliC基因的調(diào)控分析

孟 霞，孟憲臣，朱春紅，王 亨，王金秋，聶佳佳，朱國強(qiáng)

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009；2.江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州225125；3.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102442)

Hfq是細(xì)菌中的一種保守的同源六聚體熱穩(wěn)定蛋白，與真核細(xì)胞中參與RNA剪接的Sm及Sm樣蛋白質(zhì)具有同源性[1]，又稱之為類Sm蛋白。作為RNA伴侶蛋白，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)[2]。Hfq可以與細(xì)菌非編碼小RNA(sRNA)中富含AU的單鏈區(qū)緊密結(jié)合，對sRNA產(chǎn)生很強(qiáng)的保護(hù)作用，提高sRNA的穩(wěn)定性，同時(shí)Hfq還與sRNA的靶標(biāo)mRNA結(jié)合，促進(jìn)sRNA與其靶標(biāo)mRNA的相互作用[3-4]。在許多細(xì)菌中，Hfq缺失突變株表現(xiàn)出復(fù)雜并且多效性的表型。包括影響細(xì)菌的生長速度、對外界環(huán)境壓力[5]、對藥物敏感性的變化[6]以及導(dǎo)致其毒力減弱等[7]，例如霍亂弧菌hfq突變株喪失了在小鼠腸道的定殖能力[8]。銅綠假單胞菌hfq突變株可影響鞭毛和粘附相關(guān)的IV型菌毛的表達(dá)，以及胞外毒力因子彈性蛋白酶和綠膿菌素的表達(dá)，從而降低了對小鼠的毒力[9]。鼠傷寒沙門氏菌hfq突變株與野生型菌株相比，在小鼠巨噬細(xì)胞中的存活率降低，對上皮細(xì)胞的侵襲力和粘附力下降，導(dǎo)致對BALB/c小鼠的毒力減弱，表明Hfq蛋白是決定鼠傷寒沙門氏菌毒力的相關(guān)蛋白[10]。

腸炎沙門氏菌屬于泛嗜性沙門氏菌，該菌在成年家禽感染中一般呈現(xiàn)隱性感染，對養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益影響重大。隱性感染和長期排菌造成禽肉蛋產(chǎn)品的污染，并通過食物鏈將病菌傳給人類，嚴(yán)重威脅人類食品安全[11-12]。腸炎沙門氏菌具有鞭毛，其鞭毛與該菌的致病性相關(guān)。在一些病原菌中，鞭毛本身也能作為一種粘附素直接參與黏附[13]，這種粘附和侵襲可影響許多腸道致病菌的毒力。鞭毛的結(jié)構(gòu)包括基體部(Basal body)、鞭毛鉤(Hook)和鞭毛絲(Filament)三部分，其中鞭毛絲是鞭毛結(jié)構(gòu)中最大的部分，在腸炎沙門氏菌中，主要由fliC基因編碼，fliC基因的缺失可導(dǎo)致鞭毛不能正常合成，使細(xì)菌喪失運(yùn)動性。fliC基因的表達(dá)受flhDC操縱子、鞭毛合成調(diào)節(jié)基因 fliA(σ28-RNA)和 flgM(antiσ28-RNA)等基因的調(diào)節(jié)[14]。

Hfq作為多功能性的調(diào)節(jié)蛋白，在調(diào)控沙門氏菌的生長代謝，尤其是致病性方面發(fā)揮重要作用。但Hfq蛋白具體調(diào)控何種與致病力相關(guān)的蛋白或基因，目前還不清楚。fliC是鞭毛合成中的重要基因，Hfq能否通過調(diào)控該基因影響腸炎沙門氏菌的運(yùn)動性及其致病性，目前未見報(bào)道。因此，本研究以Hfq為對象，通過構(gòu)建hfq缺失突變株，探索了Hfq在調(diào)控鞭毛主要結(jié)構(gòu)基因fliC表達(dá)中的作用，為Hfq毒力調(diào)控機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)動物 腸炎沙門氏菌國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株CMCC(B)50336，大腸桿菌DH5α均由本實(shí)驗(yàn)室保存。Red同源重組[15]所需要的質(zhì)粒包括：質(zhì)粒pKD46為同源重組的輔助質(zhì)粒，含有溫度敏感復(fù)制子，阿拉伯糖誘導(dǎo)后能夠表達(dá)Gam、Beta和Exo 3個(gè)λ噬菌體重組酶；pKD3含氯霉素(Cm)抗性基因和FRT位點(diǎn)(FLP重組酶識別位點(diǎn))，為重組轉(zhuǎn)化子提供篩選標(biāo)志；pCP20是含氨芐青霉素(Amp)抗性和Cm抗性基因的溫度敏感型質(zhì)粒，能夠表達(dá)FLP重組酶，42℃誘導(dǎo)FLP重組酶表達(dá)，該質(zhì)粒用于消除FRT位點(diǎn)間的Cm基因。以上質(zhì)粒均由美國賓夕法尼亞大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈。

1.2 主要試劑和儀器 Taq DNA聚合酶、pMD18-T質(zhì)粒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kitw ith gDNA Eraser、熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq II、DNA Marker DL2000均購自 TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；Expand Long Template PCR System購自Roche公司；T4DNA連接酶購自NEB公司；M icroPulser Electroporator購自Bio-Rad公司。

1.3 Red同源重組構(gòu)建hfq突變株

1.3.1PCR引物設(shè)計(jì)用于Red同源重組的引物P1、P2分別由兩部分組成，5'端加下劃線的序列與hfq基因兩翼序列同源，3'端未加下劃線的序列與質(zhì)粒pKD3上Cm抗性基因cat兩側(cè)序列互補(bǔ)。在腸炎沙門氏菌染色體上hfq基因同源重組區(qū)域外側(cè)，設(shè)計(jì)引物P3、P4用于鑒定基因缺失菌株。引物由上?；瞪锛夹g(shù)公司合成，引物序列見表1。

1.3.2融合PCR產(chǎn)物的制備和純化以質(zhì)粒pKD3為模板，P1、P2為引物，按長引物條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第一次PCR產(chǎn)物稀釋后作為模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增，以消除模板質(zhì)粒的影響。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化并測定DNA濃度。

1.3.3Red重組功能的誘導(dǎo)和第一次同源重組將pKD46質(zhì)粒用CaCl2熱擊法轉(zhuǎn)化到腸炎沙門氏菌50336菌株中，用含有Amp的LB培養(yǎng)基篩選單個(gè)菌落并鑒定后，加入30mmol/L L-阿拉伯糖，30℃誘導(dǎo)Exo、Bet和Gam蛋白充分表達(dá)。制備含10%甘油的電轉(zhuǎn)化用感受態(tài)細(xì)胞。將上述純化的融合PCR產(chǎn)物與40μL感受態(tài)細(xì)胞混合加入到0.1cm的Bio-Rad電極杯中，以電壓1.8kV，脈沖25μF，電阻200Ω的參數(shù)進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，并涂布于含Cm的LB平板上37℃倒置培養(yǎng)過夜，篩選單個(gè)菌落，并進(jìn)一步在42℃培養(yǎng)下，對每個(gè)單菌落分別進(jìn)行Amp和Cm的抗性檢測，挑選對Amp敏感而Cm抗性的克隆，該克隆為去除pKD46質(zhì)粒的重組菌。

表1 PCR引物序列和擴(kuò)增片段大小Table1The primers for the PCR and the product sizes

1.3.4FLP位點(diǎn)專一性重組將編碼FLP位點(diǎn)專一性重組酶的質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)化至重組菌SE50336△hfq::cat，涂布于含Amp和Cm雙抗性的LB平板，30℃培養(yǎng)篩選陽性轉(zhuǎn)化子，然后將獲得的陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至無抗性的LB中，42℃培養(yǎng)過夜，劃線培養(yǎng)(37℃)分離單菌落，并對其進(jìn)行Amp和Cm抗性檢測，篩選對兩種抗生素均敏感的突變株，進(jìn)一步對菌株進(jìn)行PCR和測序鑒定。

1.4 熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測 根據(jù)發(fā)表的腸炎沙門氏菌fliC基因和解旋酶gyrA(內(nèi)參基因)的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物(表1)。將腸炎沙門氏菌50336野生株和突變株SE50336△hfq培養(yǎng)至OD值為2時(shí)，收集菌液，TRIzol法提取RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以其為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測，檢測野生株和突變株中fliC表達(dá)情況。以gyrA的表達(dá)量為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算缺失株與野生株的差異，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 半固體運(yùn)動試驗(yàn) 鞭毛運(yùn)動試驗(yàn)的觀察及確定根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行。具體操作如下：取50μL培養(yǎng)過夜的種子液重新轉(zhuǎn)接于5m L新鮮的LB中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)至OD600nm約為1.0。各取1μL滴加于0.3%的半固體運(yùn)動培養(yǎng)基上，37℃生長約18h，觀察運(yùn)動圈的大小。

2 結(jié) 果

2.1 融合PCR產(chǎn)物的制備 以質(zhì)粒pKD3做為模板，P1，P2為引物，PCR擴(kuò)增出兩端與hfq基因上下游序列同源，中間為cat基因的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定約為1.1kb，與預(yù)期值大小一致(圖略)。

2.2 第一次同源重組菌的構(gòu)建和PCR鑒定 融合PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至已含有pKD46的腸炎沙門氏菌50336菌株中，篩選陽性克隆。挑選陽性克隆接種至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，提取基因組DNA為模板，以P3和P4引物PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果重組菌擴(kuò)增出大小約1.9kb的片段，而野生型擴(kuò)增出約1.1kb的片段(圖1)。經(jīng)鑒定正確的一次同源重組菌命名為SE50336△hfq::cat。

2.3 第二次同源重組菌的構(gòu)建和PCR鑒定 將質(zhì)粒pCP20導(dǎo)入上述重組菌中，經(jīng)二次重組后獲得對Amp和Cm均敏感的二次重組菌，以P3和P4引物PCR擴(kuò)增鑒定，對照野生型約為1.1kb，而重組子約為880bp(圖1)。進(jìn)一步對獲得的突變株hfq兩側(cè)序列克隆和序列測定，結(jié)果表明突變株中hfq基因內(nèi)Cm抗性基因已敲除，相應(yīng)位置僅留下一個(gè)FRT位點(diǎn)。將此突變株命名為SE50336△hfq。

圖1 腸炎沙門氏菌50336△hfq缺失株的PCR鑒定Fig.1Identification of 50336△hfq deletionmutant by PCR

2.4 qRT-PCR檢測fliC基因的表達(dá) 以gyrA基因?yàn)閮?nèi)參，采用相對定量的方法，檢測腸炎沙門氏菌野生株與hfq突變株中fliC的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示，突變株fliC的表達(dá)量與野生株相比明顯下降，僅為野生株的3.7%(圖2)。結(jié)果表明Hfq蛋白可調(diào)節(jié)fliC基因的表達(dá)。

圖2 腸炎沙門氏菌野生株與hfq突變株中fliC基因的表達(dá)Fig.2Expression of fliC gene in S.enteritidis wild type and hfq mutant strains

2.5 半固體運(yùn)動性測定 從圖3可以看出，突變株在半固體平板上形成的運(yùn)動圈與野生株相比明顯變小，表明突變株的運(yùn)動力下降，推測Hfq蛋白的缺失導(dǎo)致fliC基因表達(dá)量下降，使鞭毛的合成量減少，從而降低了細(xì)菌的運(yùn)動性。

a:SE50336w ild type strain;b:SE50336△hfq

3 討 論

sRNA伴侶Hfq蛋白作為細(xì)菌基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)子越來越受到人們的關(guān)注。沙門氏菌Hfq蛋白的研究主要集中在鼠傷寒沙門氏菌。Sittka的研究表明Hfq是鼠傷寒沙門氏菌毒力必需的蛋白，Hfq缺失可導(dǎo)致細(xì)菌喪失運(yùn)動性，而且涉及鞭毛合成的53個(gè)基因中，80%以上的基因表達(dá)下調(diào)。體內(nèi)試驗(yàn)證明突變株對小鼠的毒力下降[10,17]。

為研究Hfq蛋白在調(diào)控腸炎沙門氏菌鞭毛合成中的作用，本研究利用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建了腸炎沙門氏菌hfq缺失突變株SE50336△hfq，通過熒光定量PCR技術(shù)分析比較了野生株與突變株中鞭毛主要結(jié)構(gòu)基因fliC的表達(dá)情況，并比較了兩個(gè)菌株的運(yùn)動能力。試驗(yàn)結(jié)果顯示，hfq的突變可導(dǎo)致fliC基因mRNA的表達(dá)量下降，只有野生株的3.7%。細(xì)菌運(yùn)動性試驗(yàn)結(jié)果顯示突變株在半固體培養(yǎng)基上的運(yùn)動能力明顯減弱，以上結(jié)果表明Hfq蛋白可以促進(jìn)fliC基因的表達(dá)；推測hfq突變后，fliC基因mRNA的表達(dá)量下降導(dǎo)致鞭毛絲合成量減少，從而影響了腸炎沙門氏菌的運(yùn)動能力。本研究首次在腸炎沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)Hfq蛋白可調(diào)控鞭毛結(jié)構(gòu)基因fliC的表達(dá)，但Hfq蛋白通過何種方式調(diào)控fliC，目前還不清楚，由于Hfq是非編碼sRNA伴侶蛋白，可協(xié)助多種sRNA發(fā)揮調(diào)控功能，增強(qiáng)sRNA的穩(wěn)定性，推測hfq的突變導(dǎo)致多種sRNA(包括調(diào)控fliC的某種或某幾種sRNA)穩(wěn)定性變差，或不能更好的與靶基因結(jié)合并發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，最終導(dǎo)致被調(diào)控基因的表達(dá)量發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)室還證明F18+大腸桿菌鞭毛在粘附仔豬上皮細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，是該菌重要的侵襲因子，是體外生物被膜形成的重要因素[18]。hfq基因的突變導(dǎo)致多種病原菌毒力下降，以及對細(xì)胞的粘附力下降，很可能與毒力相關(guān)基因如fliC基因的表達(dá)量下調(diào)有關(guān)。Hfq能否調(diào)控其它致病相關(guān)的基因，通過何種方式調(diào)控，還需進(jìn)一步研究證明。

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