新等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌

張霞，溫華蔚，倪松，王禹，王淞，高琳，劉掘茫，鄭文杰（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461）

新等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌

張霞，溫華蔚，倪松，王禹，王淞，高琳，劉掘茫，鄭文杰*
（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461）

摘要：應(yīng)用新型等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)——交叉引物等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合免疫金標(biāo)試紙條建立檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的方法。針對(duì)小腸結(jié)腸耶爾森氏菌16-23S rDNA間區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物及探針，用54株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌及相近株細(xì)菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)；通過(guò)純菌液計(jì)數(shù)、樣品中添菌檢測(cè)進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證；對(duì)677份食品用傳統(tǒng)生化國(guó)標(biāo)法進(jìn)行比較檢測(cè)試驗(yàn)。建立方法具有較好特異性；增菌液檢測(cè)靈敏度為101cfu/mL，當(dāng)每25 g樣品中有100cfu菌時(shí)經(jīng)增菌步驟后即可檢出，樣品檢測(cè)同傳統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果比較大致相符，沒(méi)有漏檢，假陽(yáng)性率較低。建立的新型恒溫檢測(cè)方法可用于食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌初篩檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌；食品安全檢測(cè)

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是腸桿菌科、耶爾森菌屬的一個(gè)種，1974年被Bergey的細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)“第八版”列入腸桿菌科耶爾森氏菌屬[1]。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌具有致病性強(qiáng)、致病范圍廣、容易傳播等特點(diǎn)。本菌所致疾病涉及臨床各科，按其病型可分為胃腸炎型和腸道外感染兩種，可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，如心肌炎、亞急性肝炎、結(jié)膜炎、眼炎、關(guān)節(jié)炎、急性腎小球腎炎、膽囊炎、尿道炎、腦膜炎，甚至可以引起敗血病，其死亡率可達(dá)34%～50%[2]。同時(shí)，由于該菌的生存條件極廣，生長(zhǎng)溫度0℃～44℃，甚至報(bào)道在-2℃仍可生存，適應(yīng)中強(qiáng)酸堿。因此，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是對(duì)人類身體健康具有極大威脅的一種細(xì)菌。

由于經(jīng)典檢驗(yàn)方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁雜，為防控該菌的危害，保障人民的健康和生命安全，快速、特異性強(qiáng)的分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究廣泛進(jìn)行。目前針對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌PCR方法[3-5]、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)[6]、芯片雜交技術(shù)[7]及環(huán)介導(dǎo)[8]、滾環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增方法[9]等均有報(bào)道，成為日常規(guī)檢測(cè)的工具。

本研究旨在應(yīng)用新型交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[10]建立檢測(cè)方法，其結(jié)合免疫金試紙條檢測(cè)方法，避免LAMP方法結(jié)果檢測(cè)需要電泳使用EB危害、PCR產(chǎn)物污染等問(wèn)題，將分子生物學(xué)檢測(cè)進(jìn)一步推廣。

1　材料與儀器

1.1主要材料與試劑

Bst DNA polymerase large fragment：New England Biolabs；10×Bst buffer：New England Biolabs；dNTPs：Fermentas；MgSO4：Sigma；betaine：Sigma；核酸快速檢測(cè)試紙條：優(yōu)思達(dá)公司。

菌株采用4株ATCC和23株CMCC小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（涉及27個(gè)血清型），9株其它ATCC耶爾森氏菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌和其它近緣菌屬18株ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株，詳見表1。

表1 試驗(yàn)菌株Table 1　Bacterial strains for detection

1.2主要儀器與設(shè)備

PCR儀（Bio-rad，C1000 Touch）、離心機(jī)（Eppendorf，5417R）。

1.3方法

1.3.1引物及探針的設(shè)計(jì)

利用細(xì)菌16 s-23 s rDNA間區(qū)序列[11-12]（GenBank Accession No.AM286415）設(shè)計(jì)特異性引物見表2。

表2 檢測(cè)引物序列Table 2　Primers sequence for the detection

1.3.2反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

各試劑濃度為：CR/CF引物各0.4μmol/L，DR/DF引物各0.8μmol/L，DF/DP各0.1 μmol/L，0.5 mmol/L dNTPs，Bst DNA酶6個(gè)單位，2 μL 10×Bst buffer，0.5 mol/L betaine，4 mmol/L MgSO4，1 μL DNA模板。

反應(yīng)條件：63℃反應(yīng)60 min。

1.3.3特異性試驗(yàn)

對(duì)表1中菌株核酸樣本進(jìn)行試驗(yàn)，以證明交叉引物等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法是否具有通用性及特異性。

1.3.4靈敏度試驗(yàn)

以小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌ATCC49397為試驗(yàn)菌株，37℃培養(yǎng)16 h，取1 mL進(jìn)行純菌液計(jì)數(shù)后10倍稀釋，按照CPA反應(yīng)體系進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.5樣品添菌檢測(cè)

取經(jīng)證實(shí)不含目標(biāo)菌的奶粉樣品A、B在增菌前分別添加101、100cfu/25 g小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌ATCC49397菌液1mL，混勻1min，加入增菌液225mL，37℃培養(yǎng)12 h，取1 mL樣品增菌液按照本研究方法進(jìn)行檢測(cè)，未添加菌的樣品A、B作為空白對(duì)照，同時(shí)做細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.3.6實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用建立的CPA檢測(cè)方法，在出入境食品的日常檢測(cè)工作中和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.8-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行比較試驗(yàn)，共進(jìn)行677份5類不同樣品檢測(cè)工作。

2　結(jié)果與分析

2.1特異性試驗(yàn)

54株實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，其中27株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（4株ATCC、23株CMCC標(biāo)準(zhǔn)菌株），檢測(cè)結(jié)果全部為陽(yáng)性見圖1。

圖1　小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌交叉引物等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)Fig.1　CPA amplification for Y.enterocolitica strains

其顯示了部分陽(yáng)性菌株檢測(cè)結(jié)果；另外27株陰性對(duì)照菌，包括9株ATCC耶爾森氏菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌和其它近緣菌屬18株ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株，結(jié)果全部為陰性見圖2。

圖2 陰性對(duì)照菌檢測(cè)結(jié)果Fig.2 CPA amplification for non-Y.enterocolitica strains

表明近緣菌株都無(wú)假陽(yáng)性出現(xiàn)，說(shuō)明交叉引物等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合免疫金標(biāo)試紙條檢測(cè)方法特異性良好，而且對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌全血清型具有很好的通用性。

2.2檢測(cè)靈敏度

2.2.1純菌液檢測(cè)

試驗(yàn)菌株ATCC49397過(guò)夜培養(yǎng)后菌液濃度為8.6×108cfu/mL，用PBS對(duì)菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋至100cfu/mL數(shù)量級(jí)，各取1 mL提取DNA做實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖3。

圖3　小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌交叉引物等溫?cái)U(kuò)增純菌液靈敏度檢測(cè)Fig.3　Sensitivity of CPA detection for Y.enterocolitica pure culture

108cfu/mL～101cfu/mL菌液濃度時(shí)全部為陽(yáng)性，100cfu/mL時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陰性。

2.2.2樣品添菌實(shí)驗(yàn)

對(duì)準(zhǔn)備添菌的空白樣品細(xì)菌計(jì)數(shù)，本底雜菌數(shù)為3.4×102cfu/g，向樣品中添菌8.6及86 cfu/25 g，經(jīng)12 h增菌后，取1 mL增菌液做CPA檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明在有其他干擾菌的情況下，樣品有目標(biāo)菌100cfu/25 g時(shí)，經(jīng)增菌后可以檢出。

2.3實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)的5類不同種類的677份食品樣品分別用傳統(tǒng)生化國(guó)標(biāo)法與CPA兩種方法進(jìn)行比較檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3　The detection result of samples

CPA陽(yáng)性檢出高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法。以國(guó)標(biāo)法為基準(zhǔn)方法進(jìn)行CPA方法性能指標(biāo)的評(píng)價(jià)，結(jié)果見表4。

表4CPA檢測(cè)性能指標(biāo)評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4　The reslut of CPA performance

CPA方法的假陰性率=0/17=0、假陽(yáng)性率=7/653= 1.07%。

通過(guò)表4數(shù)據(jù)及該方法的假陰性率為0、假陽(yáng)性率為1.07%，可以看出，同傳統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果大致相符，沒(méi)有漏檢情況，有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性，但發(fā)生率較低，說(shuō)明CPA方法，對(duì)食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)結(jié)果達(dá)到準(zhǔn)確、可靠。

3　結(jié)論

目前國(guó)內(nèi)針對(duì)食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢測(cè)方法主要以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，該標(biāo)準(zhǔn)方法依賴于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、鏡檢觀察、生化鑒定、血清學(xué)分型等實(shí)驗(yàn)，一般的檢測(cè)周期在5 d～7 d左右，存在著檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，工作量大等缺點(diǎn)，不再適用于日益增長(zhǎng)的進(jìn)出口食品貿(mào)易。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們已創(chuàng)建了不少快速、特異、敏感的快速檢測(cè)方法，如熒光PCR法、基因芯片檢測(cè)方法等，但全部以大型的儀器設(shè)備和熟練的專業(yè)技能為前提，不適合于在基層及偏遠(yuǎn)經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)應(yīng)用，而目前食品安全的現(xiàn)狀是亟待提高基層及經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)的檢測(cè)實(shí)力。

等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生，為快速基因檢測(cè)提供了新的技術(shù)途徑，相較上述方法更具推廣性。通過(guò)本研究團(tuán)隊(duì)建立致病菌CPA檢測(cè)體系發(fā)現(xiàn)，由于引物設(shè)計(jì)原理的不同，CPA法實(shí)際檢測(cè)靈敏度要略高于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法[14-16]，但是由于樣品增菌后目標(biāo)菌濃度一般可達(dá)到104cfu/mL左右，二者添菌試驗(yàn)檢測(cè)靈敏度一致，均可應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)以及樣品的快速篩選檢測(cè)。但是本研究檢測(cè)方法是結(jié)合免疫金標(biāo)試紙條的方法，避免了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法使用電泳時(shí)PCR產(chǎn)物的二次污染和EB對(duì)人體的危害，或是使用觀察沉淀、顏色變化造成的不客觀性，在結(jié)果觀察方面CPA明顯優(yōu)于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，所以比較易于在實(shí)際檢測(cè)工作中推廣使用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 于恩庶.中國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌病研究進(jìn)展[J].中華流行病學(xué)雜志,2002,21(6):453-455

[2]Fredriksson-Ahomaa M,Korkeala H.Low occurrence of pathogenic Yersinia enterocolitica in clinical,food,and environmental samples: a methodological problem[J].Clinical microbiology reviews,2003, 16(2):220-229

[3]Ibrahim A,Liesack W,Griffiths M W,et al.Development of a highly specific assay for rapid identification of pathogenic strains of Yersinia enterocolitica based on PCR amplification of the Yersinia heat-stable enterotoxin gene(yst)[J].Journal of clinical microbiology,1997,35(6):1636-1638

[4]Thoerner P,Kingombe C I B,B?gli-Stuber K,et al.PCR detection of virulence genes in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis and investigation of virulence gene distribution[J].Applied and environmental microbiology,2003,69(3):1810-1816

[5]Weynants V,Jadot V,Denoel P A,et al.Detection of Yersinia enterocolitica serogroup O:3 by a PCR method[J].Journal of clinical microbiology,1996,34(5):1224-1227

[6]溫和心,蔣榮華,王杰,等.猴小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法的建立[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué),2011,31(2):92-95

[7]Siddique N,Sharma D,Al-Khaldi S F.Detection of Yersinia enterocolitica in alfalfa,mung bean,cilantro,and mamey sapote(Pouteria sapota)food matrices using DNA microarray chip hybridization[J]. Current microbiology,2009,59(3):233-239

[8]Zhang H,Feng J,Xue R,et al.Loop-Mediated Isothermal Amplification Assays for Detecting Yersinia pseudotuberculosis in Milk Powders[J].Journal of food science,2014,79(5):967-971

[9]姜英輝,張健,雷質(zhì)文,等.小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)方法的建立[J].食品研究與開發(fā),2013,31(22):61-63

[10]Fang R,Li X,Hu L,et al.Cross-priming amplification for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens[J]. Journal of clinical microbiology,2009,47(3):845-847

[11]Simon Lee.Analysis of the 16s-23s rDNA intergenic spacers of marine vibrios for species-specific signature DNA sequences[J].Marine Pollution Bulletin,2002,44(5):412-420

[12]Liao D.Gene conversion drives within genic sequences:concerted evolution of ribosomal RNA genes in bacteria and archaea[J].Journal of Molecular Evolution,2000,51(4):305-317

[13]張霞,吳冬雪,曲鵬,等.一種新的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)阪崎腸桿菌[J].食品科學(xué),2013,34(2):187-190

[14]劉旸,張海英,劉國(guó)紅,等.單增李斯特氏菌快速檢測(cè)方法的建立[J].食品研究與開發(fā),2012,33(9):134-136

[15]祁軍,張霞,蔣剛強(qiáng),等.交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)志賀氏菌[J].食品研究與開發(fā),2013,34(11):65-68

[16]Liu C,Zheng W,Zhang H,et al.Sensitive and rapid detection of enterobacter sakazakii in infant formula by loop-mediated isothermal amplification method[J].Journal of Food Safety,2009,29(1):83-94

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.030

收稿日期：2015-09-01

基金項(xiàng)目：質(zhì)檢總局科研《生態(tài)港外來(lái)有害動(dòng)植物疫病及食源性致病菌風(fēng)險(xiǎn)控制措施研究》資助（2014IK222）

作者簡(jiǎn)介：張霞（1975—），女（漢），高級(jí)工程師，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測(cè)。

*通信作者：鄭文杰（1969—），女，博士，研究員，研究方向：食品安全檢測(cè)。

Detection of Yersinia enterocolitica by a New Isothermal Amplification

ZHANG Xia，WEN Hua-wei，NI Song，WANG Yu，WANG Song，GAO Lin，LIU Jue-mang，ZHENG Wen-jie*
（Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Abstract：To develop a cross-priming amplification（CPA）combined with immunoblotting analysis method for the detection of Yersinia enterocolitica on food.Specific primers and probe were designed on the basis of six specific sequences in Y.enterocolitica 16S-23S rDNA internal transcribed spacer.The specificity of the method was evaluated by 54 different bacterial strains.The sensitivity of the method was evaluated by pure bacteria counted and the sample of adding Y.enterocolitica.To detect 677 samples comparing with the biochemical and culture-based assays.All of the Y.enterocolitica strains showed positive results，and the other bacteria gave negative results.The limit of detection of the CPA method was 101cfu/mL for bacteria in pure culture，and 100cfu per 25 g of sample with pre-enrichment.The result of sample detection was broadly consistent with the traditional detection，no omission，low false positive rate.This CPA method can be used for the rapid preliminary screening of Y.enterocolitica.

Key words：cross prime isothermal amplification；Y.enterocolitica；detection of food safety