倒卵葉五加多糖的羧甲基化工藝及抗氧化性

趙鵬，張婷婷，宋逍，唐志書(shū)

（陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046）

倒卵葉五加（Acanthopanax obouatus Hoo）屬五加科（Araliaceae）五加屬植物，分布于陜西、寧夏、甘肅等地，多糖是其主要的活性成分之一，具有明顯的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗氧化性等生物活 性[1-3]。目前對(duì)于倒卵葉五加多糖的研究主要集中在分離純化、藥理活性等方面，而對(duì)其進(jìn)行衍生化方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

對(duì)于多糖進(jìn)行衍生化的方法主要包括物理法、化學(xué)法及生物法等。利用化學(xué)的方法對(duì)多糖的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，能夠提高其生物活性，甚至賦予其新的生物活性。正因?yàn)槿绱?，?duì)于多糖的衍生化研究已成為多糖研究者重點(diǎn)關(guān)注的熱點(diǎn)之一[4-8]。

本研究在前期對(duì)倒卵葉五加多糖分離純化的研究基礎(chǔ)之上，利用響應(yīng)面法對(duì)倒卵葉五加多糖羧甲基化修飾的合成工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，并初步研究了羧甲基化后多糖的抗氧化性，考察羧甲基化修飾對(duì)倒卵葉五加多糖抗氧化活性的影響。本研究成果為把倒卵葉五加多糖及其羧甲基化衍生物開(kāi)發(fā)成為新型、安全、天然的藥品、功能性食品添加劑提供了一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

倒卵葉五加購(gòu)自西安萬(wàn)壽路中藥材批發(fā)市場(chǎng)，氯乙酸、異丙醇、乙醇、乙醚、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、鄰苯三酚及其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-2501PC 紫外可見(jiàn)分光光度儀，日本島津公司；FA2004 電子天平，上海精科天平廠；H2050R 臺(tái)式離心機(jī)，湖南湘儀公司；ALPHA1-4型真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)CHRIST 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 倒卵葉五加多糖的制備

將倒卵葉五加在80℃下干燥，粉碎后過(guò)60 目篩。再將其用無(wú)水乙醇在回流下脫脂兩次，過(guò)濾，濾渣晾干后，用雙蒸水，按料液比1∶15（g/mL）80℃下提取2次，提取液合并，再按1g生藥材濃縮為1mL 進(jìn)行濃縮，濃縮液經(jīng)脫蛋白、脫色處理后醇沉，即得倒卵葉五加粗多糖，用水復(fù)溶后，再用Sephadex G-100 凝膠柱進(jìn)行純化，收集多糖富集峰，濃縮后凍干即得倒卵葉五加多糖，經(jīng)測(cè)定該多糖含量為98.4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），經(jīng)高效凝膠色譜法檢測(cè)，其為均一多糖，分子量為8.7kD。

1.2.2 倒卵葉五加多糖的羧甲基化

參照文獻(xiàn)[4]的方法，先精確稱取一定量的多糖樣品，加入適量異丙醇與20%的NaOH 的混合溶液將其溶解；再將氯乙酸溶于異丙醇中，并加入適量的20%的NaOH 溶液混合均勻。在一定溫度下，往多糖溶液滴加一定量氯乙酸的異丙醇溶液。滴加完畢，恒溫反應(yīng)一段時(shí)間后，待反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，再用鹽酸溶液將反應(yīng)液調(diào)為中性。將反應(yīng)液裝入截留相對(duì)分子質(zhì)量為3500 的透析袋中用流動(dòng)水透析48h。透析液濃縮后即得羧甲基化修飾的倒卵葉五加多糖。

1.2.3 倒卵葉五加多糖羧甲基化取代度的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[4]，測(cè)定羧甲基化倒卵葉五加多糖的取代度。

1.2.4 抗氧化性能測(cè)試

參照文獻(xiàn)[9]測(cè)試樣品對(duì)超氧陰離子和羥自由基的清除效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 倒卵葉五加多糖羧甲基化的合成工藝

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間的影響

預(yù)設(shè)反應(yīng)溫度50℃，氯乙酸濃度為2.0mol/L，確定最優(yōu)的反應(yīng)時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 所示的結(jié)果說(shuō)明，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為1.0～4.0h時(shí)，多糖羧甲基化取代度的值快速增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為4.0h時(shí)，達(dá)到最大。隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，副反應(yīng)也在增多，使得氯乙酸的利用率反而降低，并且當(dāng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，反應(yīng)條件下，多糖的降解程度也在增加，從多糖的取代度及穩(wěn)定性考慮，因此確定最優(yōu)的反應(yīng)時(shí)間為4.0h。

2.1.2 氯乙酸濃度的影響

預(yù)設(shè)反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間為4.0h，確定最優(yōu)的氯乙酸濃度，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 所示的結(jié)果說(shuō)明，隨著氯乙酸濃度的逐步增加，多糖羧甲基化取代度的值逐漸提高，在此階段氯乙酸與氫氧化鈉生成氯乙酸鈉來(lái)進(jìn)攻多糖的活性中心，而生成羧甲基化的多糖，此時(shí)生成的氯乙酸鈉越多，多糖的羧甲基化取代度就越高。但隨著氯乙酸濃度的增大，體系內(nèi)的氫氧化鈉已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化為氯乙酸鈉后，其對(duì)多糖羧甲基化取代度的影響就不是很大了，而且酸性過(guò)強(qiáng)，易于引起多糖的降解，因此確定最優(yōu)的氯乙酸濃度為3.0mol/L 左右。

2.1.3 反應(yīng)溫度的影響

預(yù)設(shè)反應(yīng)時(shí)間為 4.0 h、氯乙酸濃度為3.0mol/L，確定最優(yōu)的反應(yīng)溫度，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 反應(yīng)時(shí)間的影響

圖2 氯乙酸濃度的影響

圖3 反應(yīng)溫度的影響

圖3 所示的結(jié)果說(shuō)明，隨著反應(yīng)溫度的增加，多糖羧甲基化取代度的值逐漸增大，當(dāng)?shù)?0℃達(dá)到最大。隨著溫度的進(jìn)一步提高，取代度反而降低，這是因?yàn)殚_(kāi)始隨著溫度的提高，反應(yīng)速率增加，但隨著溫度的進(jìn)一步增加，副反應(yīng)速率也在增加，使得氯乙酸的利用率反而降低，并且當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，反應(yīng)料液顏色加深，反應(yīng)條件下，溫度過(guò)高還能導(dǎo)致多糖的降解，因此反應(yīng)應(yīng)在70℃左右 進(jìn)行。

2.1.4 倒卵葉五加多糖羧甲基化工藝條件優(yōu)化

本研究按照Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，以羧甲基取代度（DS）為響應(yīng)值，選取反應(yīng)時(shí)間、氯乙酸的濃度和反應(yīng)溫度等3 個(gè)對(duì)反應(yīng)具有較大影響的單因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，來(lái)優(yōu)化倒卵葉五加多糖羧甲基化的工藝條件。實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)如表1 所示，響應(yīng)面得到的實(shí)驗(yàn)及分析結(jié)果如表2 和表3 所示。

采用Design-Expert 7.01 軟件對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到的結(jié)果進(jìn)行分析研究，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，按照各因素對(duì)取代度（y）的影響進(jìn)行二次方程擬合，擬合得到式（1）。

由方差分析表3 的分析結(jié)果可以看出，回歸方程的F 值為39.41，其顯著水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0.05，這說(shuō)明，利用響應(yīng)面法擬合得到的試驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著型極高，按照擬合模型得到的回歸方程，考察其因變量與自變量之間的線性相關(guān)系數(shù)后發(fā)現(xiàn)，r=0.9846，這一點(diǎn)表明用該數(shù)學(xué)模型來(lái)評(píng)估各相關(guān)因素對(duì)倒卵葉五加多糖羧甲基化取代度的影響相對(duì)準(zhǔn)確。對(duì)表3 的方差分析結(jié)果可以看出，響應(yīng)面試驗(yàn)組合的各單因素中，對(duì)倒卵葉五加多糖羧甲基化取代度的影響最大的是反應(yīng)溫度，其次是氯乙酸濃度，反應(yīng)時(shí)間的影響最小，各因素之間的交互影響并不明顯。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

2.1.5 響應(yīng)面圖分析

通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分析可以得到相應(yīng)的響應(yīng)面圖，響應(yīng)面圖可以更加直觀的反應(yīng)出各單因素對(duì)倒卵葉五加多糖羧甲基化取代度的影響結(jié)果以及各單因素之間交互影響的強(qiáng)弱關(guān)系。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到的等高線圖見(jiàn)4～圖6。

圖4 氯乙酸濃度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)倒卵葉五加多糖羧甲基化 取代度的影響

圖5 反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)倒卵葉五加多糖羧甲基化 取代度的影響

圖6 反應(yīng)溫度與氯乙酸濃度對(duì)倒卵葉五加多糖羧甲基化 取代度的影響

對(duì)比圖4～圖6 可知：反應(yīng)溫度對(duì)倒卵葉五加多糖羧甲基化的取代度的影響極為顯著，圖中可看出其繪制的曲線最為陡峭；氯乙酸濃度對(duì)羧甲基化的影響次之，而影響最小的則是反應(yīng)時(shí)間，相較于氯乙酸濃度而言，其曲線較為平滑一些。通過(guò)響應(yīng) 面法預(yù)測(cè)得到的回歸模型分析[10-11]， 可預(yù)測(cè)得到倒卵葉五加多糖羧甲基化的最優(yōu)合成工藝條件是：反應(yīng)時(shí)間是4.11h，氯乙酸濃度是3.26mol/L，反應(yīng)溫度是76.42℃，預(yù)測(cè)的工藝條件下，得到的羧甲基化多糖的取代度為0.559。

2.1.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照上述預(yù)測(cè)的結(jié)果，從實(shí)驗(yàn)操作的可操作性考慮，微調(diào)上述工藝條件為：反應(yīng)時(shí)間4.1 h，氯乙酸濃度是3.3 mol/L，反應(yīng)溫度75℃。分別用0.1 g 的倒卵葉五加多糖，在微調(diào)后的羧甲基化修飾的工藝條件下，做3 次多糖羧甲基化平行試驗(yàn)，得到的羧甲基化倒卵葉五加多糖基取代度的平均值為0.557，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)回歸方程預(yù)測(cè)得到的工藝條件與實(shí)際操作工藝條件十分吻合。

2.2 羧甲基化倒卵葉五加多糖的抗氧化活性

2.2.1 羥自由基的清除實(shí)驗(yàn)

本研究以Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照品，分別考察了倒卵葉五加多糖羧甲基化修飾前后對(duì)羥自由基的清除作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7 可知，經(jīng)過(guò)羧甲基化修飾后的倒卵葉五加多糖清除羥自由基的最大清除率為71.3%，比羧甲基化前多糖的最大清除率46.3%提高了25.0%，清除羥自由基的能力有了明顯的提高，其最大清除率基本可達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照品Vc 的水平。

2.2.2 超氧陰離子的清除實(shí)驗(yàn)

本研究以Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照品，分別考察了倒卵葉五加多糖羧甲基化修飾前后對(duì)超氧陰離子的清除作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8 可知，經(jīng)過(guò)羧甲基化修飾后的倒卵葉五加多糖清除超氧陰離子的最大清除率為90.3%，比羧甲基化前多糖的最大清除率26.2%提高了64.1%，清除超氧陰離子的能力也有了明顯的提高，但其清除超氧陰離子的能力不及陽(yáng)性對(duì)照品Vc。

圖7 羥自由基的清除實(shí)驗(yàn)

圖8 超氧陰離子的清除實(shí)驗(yàn)

上述抗氧化性實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，羧甲基化修飾倒卵葉五加多糖，可有效地提高其抗氧化活性，這也許是對(duì)倒卵葉五加多糖進(jìn)行羧甲基化后，其溶解性以及空間構(gòu)象發(fā)生了改變，從而改善了多糖的抗氧化活性，對(duì)于其具體的原因還在進(jìn)一步研究之中。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)倒卵葉五加多糖進(jìn)行羧甲基化修飾的工藝路線進(jìn)行研究，使用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化了其最優(yōu)的修飾工藝條件，結(jié)果表明：反應(yīng)時(shí)間4.1h，氯乙酸濃度是3.3mol/L，反應(yīng)溫度75℃，在此條件下修飾制得的羧甲基化倒卵葉五加多糖的羧甲基化取代度為0.557，利用該方法對(duì)多糖進(jìn)行羧甲基化修飾，具有反應(yīng)可操作性強(qiáng)、試劑價(jià)廉易得、多糖的羧甲基化取代度較高的優(yōu)點(diǎn)，是一種較理想的多糖羧甲基化修飾方法。通過(guò)倒卵葉五加多糖羧甲基化衍生物超氧陰離子和羥自由基的清除實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過(guò)羧甲基化修飾后的抗氧化能力較之羧甲基化修飾前的倒卵葉五加多糖有了非常明顯的改善，其抗氧化能力進(jìn)一步增強(qiáng)，關(guān)于羧甲基化能顯著增強(qiáng)多糖抗氧化性的原因還在進(jìn)一步深入研究之中。