芩丹顆粒對微波輻射小鼠心臟損傷的防護(hù)作用

朱文赫，鐘秀宏，徐俊杰，張紅，呂士杰

（吉林醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)教研室，吉林吉林132013)

芩丹顆粒對微波輻射小鼠心臟損傷的防護(hù)作用

朱文赫，鐘秀宏，徐俊杰，張紅，呂士杰

（吉林醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)教研室，吉林吉林132013)

目的探討芩丹顆粒對微波輻射小鼠心臟損傷的防護(hù)作用。方法60只小鼠隨機(jī)分為正常對照組、100 mW·cm-2輻射損傷組、輻射損傷+芩丹顆粒2.5，5.0和10.0 g·kg-1防護(hù)組。芩丹顆粒防護(hù)組小鼠于輻射前7 d每天ig給藥1次。輻射后6 h，取靜脈血，用生化法檢測血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶（CK）活性。取心肌組織，用比色法檢測三磷酸腺苷（ATP）含量、線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ和Ⅴ活性，用光鏡和電鏡觀察心肌組織結(jié)構(gòu)的變化，用Western蛋白印跡法檢測細(xì)胞色素c（Cyt c）和激活型胱天蛋白酶3表達(dá)的變化。結(jié)果與正常對照組比較，微波輻射組小鼠心肌細(xì)胞水腫、線粒體數(shù)量減少且形態(tài)異常，血清中GOT，CK和LDH活性升高（P＜0.01），線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ和Ⅴ活性顯著下降（P＜0.01），心肌細(xì)胞Cyt c和激活型胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。與輻射損傷組比較，芩丹顆粒5.0和10.0 g·kg-1防護(hù)組小鼠心肌細(xì)胞體積正常，細(xì)胞核和細(xì)胞器形態(tài)完好，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷程度顯著緩解；心肌組織ATP含量、線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ和Ⅴ活性均顯著升高（P＜0.01）；心肌細(xì)胞Cyt c和激活型胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)均顯著下降（P＜0.01）。結(jié)論芩丹顆粒對微波輻射致小鼠心肌細(xì)胞損傷具有一定的防護(hù)作用，其機(jī)制可能與其改善微波所致心肌細(xì)胞能量代謝有關(guān)。

微波輻射；芩丹顆粒；ATP；線粒體呼吸鏈

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2015.04.005

微波已經(jīng)廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)、通訊、電視、醫(yī)療和軍事等各個(gè)領(lǐng)域，其在給人們帶來極大益處的同時(shí)，所引起的廣泛的生物學(xué)損傷效應(yīng)也越來越受到重視［1］。已有的研究表明，心臟是微波輻射敏感的靶器官之一，微波輻射可造成心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的損傷［2-4］。心臟是循環(huán)系統(tǒng)的動(dòng)力器官，其結(jié)構(gòu)和功能的異常將影響機(jī)體血液供應(yīng)，對全身各系統(tǒng)器官造成不良影響。氟伐他汀、丹參、參麥注射液、安多霖膠囊、抗輻靈膠囊和白細(xì)胞介素3等藥物雖然能減輕輻射對機(jī)體的損傷，但目前未見能夠有效防治微波輻射致心臟損傷的藥物［5］。

中藥方劑具有副作用小、可從整體水平提高身體機(jī)體功能的特點(diǎn)，在微波防治藥物極其缺乏的情況下，研發(fā)可用于防治微波輻射致心臟損傷的中藥方劑是可行而且是必要的。芩丹顆粒具有清熱涼血、滋陰生津和扶正固本功效。本研究旨在探討芩丹顆粒對微波輻射致小鼠心臟損傷的防護(hù)作用，為其今后在微波輻射防護(hù)方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ和Ⅴ及ATP試劑盒購于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，GOT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和肌酸肌酶（creatine kinase，CK）活性測定試劑盒購于南京建成生物工程研究；兔抗人細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt c）、激活型胱天蛋白酶3（cleaved caspase 3）和β肌動(dòng)蛋白抗體購于Santa cruz公司；山羊抗兔IgG二抗購于武漢博士德生物工程有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。MY8C-1型微波輻射儀，南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司，頻率為2450 MHz；550酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司；MTN-658A生化分析儀，長春市曼特諾醫(yī)療器械有限公司。

1.2 芩丹顆粒的研制

芩丹顆粒由本實(shí)驗(yàn)室自行研制，由黃芩25 g，麥冬25 g，沙參20 g，梔子20 g，丹皮20 g和黃芪20 g等十幾味中藥材組成［6］。用HPLC法測定芩丹顆粒中黃芩苷、梔子苷和丹皮酚含量，對芩丹顆粒主要成分進(jìn)行質(zhì)量控制［7］。

1.3 動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)分組

清潔級(jí)BALB/c雄性小鼠60只，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-吉2008-0005，體質(zhì)量16～18 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)分5組，正常對照組、100 mW·cm-2輻射損傷組、芩丹顆粒2.5，5.0和10.0 g·kg-1防護(hù)組，每組12只。將芩丹顆粒溶于蒸餾水中，4℃冰箱保存。防護(hù)組小鼠于輻射前7 d每天ig給藥1次（20 mL·kg-1）。正常對照組和輻射損傷組每天給予等體積蒸餾水。末次給藥12 h后，進(jìn)行輻射處理。

1.4 微波輻射條件

小鼠置于自制有機(jī)玻璃盒內(nèi)，加蓋（有孔），小鼠在盒內(nèi)為固定體位，背上腹下位，左側(cè)胸部暴露于輻射場中，其余部位用微波防護(hù)材料屏蔽。輻射強(qiáng)度為100 mW·cm-2，輻射時(shí)間為6 min，環(huán)境溫度為19.5～20.5℃，相對濕度40%。微波輻射后6 h，用1%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉。

1.5 生化指標(biāo)及心肌組織ATP含量、線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ和Ⅴ活性檢測

腹主動(dòng)脈取血，制備血清，應(yīng)用生化檢測儀檢測血清中GOT，CK和LDH活性。

冰浴條件下取心肌組織，生理鹽水沖洗，冰浴中充分研磨，800×g離心5 min，取上清液12 000×g離心10 min，沉淀為線粒體成分，用保存液懸浮沉淀，采用Bradford法［8］檢測線粒體蛋白含量。利用磷鉬酸比色法檢測ATP含量、線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ和Ⅴ活性，按照各試劑盒操作方法進(jìn)行操作。

1.6 心肌組織病理學(xué)檢查

微波輻射后，將小鼠麻醉，冰浴下立即取小鼠心臟心尖部位，固定于4%甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，在光鏡下觀察心肌組織病理變化。

1.7 心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察

微波輻射后，每組取6只小鼠心臟心尖心肌組織1 mm3，經(jīng)2.5%的戊二醛和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01的鋨酸固定后，丙酮梯度脫水、包埋，半薄切片定位，甲苯胺藍(lán)染色觀察病變部位并定位，然后超薄切片機(jī)制作超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，T20型透射電鏡下觀察，心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果采用盲法評估。

1.8 Western蛋白印跡法檢測心肌組織Cyt c和激活型胱天蛋白酶3蛋白的表達(dá)

微波輻射后，取6只小鼠心臟，低溫下將心臟組織剪碎，加入組織蛋白提取液，12 000×g離心10 min，收集上清。經(jīng)BCA法進(jìn)行蛋白定量后，每個(gè)點(diǎn)樣孔加樣20 μg蛋白樣品液，以12%SDSPAGE進(jìn)行電泳。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，兔抗人Cyt c（1∶500）、激活型胱天蛋白酶3（1∶500）和β肌動(dòng)蛋白抗體（1∶1000）4℃育過夜，用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。分再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶1000）二抗封閉液孵育1 h。TBST溶液漂洗用ECL顯影，掃描紀(jì)錄。運(yùn)用圖像分析軟件Quantity One分析條帶的吸光度值，將對照組和藥物組的目的條帶的積分吸光度值和內(nèi)參的積分吸光度值比值表示蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 芩丹顆粒對微波輻射小鼠血清GOT，CK和LDH活性的影響

表1可見，與正常對照組相比，100 mW·cm-2輻射后6 h，小鼠血清中GOT，CK和LDH活性明顯升高（P＜0.01）。與輻射損傷組相比，芩丹顆粒5.0和10.0 g·kg-1防護(hù)組小鼠血清中GOT，CK和LDH含量明顯下降（P＜0.01）。表明微波輻射后，小鼠心肌細(xì)胞受損，芩丹顆粒對微波輻射所致小鼠心肌細(xì)胞損傷具有一定的防護(hù)作用。

Tab.1 Effect of Qindan granules on activity of glutamic oxalacetic transaminase（GOT），creatinekinase（CK）and lactate dehydrogenase（LDH）in serum of mice irradiated by microwave

2.2 芩丹顆粒對微波輻射小鼠心肌ATP含量和線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ和Ⅴ活性的影響

表2可見，與正常對照組相比，100 mW·cm-2輻射后6 h，心肌組織中ATP含量、線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ和Ⅴ活性明顯降低（P＜0.01）。與輻射損傷組相比，芩丹顆粒5.0和10.0 g·kg-1防護(hù)組小鼠心肌組織ATP含量、線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ和Ⅴ活性明顯升高（P＜0.01）。表明微波輻射對小鼠心臟能量代謝具有明顯的影響，芩丹顆粒對微波輻射所致小鼠心臟損傷具有一定的防護(hù)作用。

2.3 芩丹顆粒對微波輻射小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可見，正常對照組小鼠心肌細(xì)胞呈圓柱狀，肌纖維平行排列，橫紋清晰。細(xì)胞核橢圓形，位于細(xì)胞中央（圖1 A）。輻射損傷組小鼠心肌細(xì)胞輕度水腫，肌纖維排列不整，橫紋模糊不清（圖1 B）。芩丹顆粒5.0和10.0 g·kg-1防護(hù)組小鼠心肌細(xì)胞水腫減輕明顯，肌纖維排列較整齊，細(xì)胞核固縮現(xiàn)象明顯減少（圖1 D和E），表明芩丹顆粒對微波輻射小鼠心肌細(xì)胞損傷具有防護(hù)作用。

2.4 芩丹顆粒對微波輻射小鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可見，正常對照組小鼠心肌細(xì)胞體積大小正常，細(xì)胞核染色質(zhì)均勻分布，肌絲排列整齊，各帶較明顯，閏盤較完整。線粒體和糖原顆粒豐富，線粒體排列較為規(guī)則，呈圓形、橢圓形或長桿狀，膜較完整，嵴清晰可見（圖2A）。微波輻射模型組小鼠心肌細(xì)胞線粒體和肌絲排列不緊密，肌絲明暗帶不清晰，肌絲溶解、斷裂。線粒體數(shù)量減少且形態(tài)異常，部分線粒體溶解空化基質(zhì)明顯腫脹，內(nèi)膜和外膜的完整性明顯破壞（圖2B）。而芩丹顆粒5.0和10.0 g·kg-1防護(hù)組小鼠肌細(xì)胞線粒體排列于肌絲束之間排列較規(guī)則、整齊，無肌絲溶解、斷裂，線粒體結(jié)構(gòu)較完整（圖2 D和E）。

Tab.2 Effect of Qindan granules on content of ATP，activity mitochondrial complexesⅣandⅤin myocardial tissue of mice irradiated by microwave

Fig.1 Effect of Qindan granules on pathological changes of myocardial tissue of mice irradiated by microwave（HE staining，×200）.A：normal control group；B：radiation injury group；C，D and E：Qindan granules 2.5，5.0 and 10.0 g·kg-1protective group，respectively.Arrows show the pathological changes of mild edema,muscle fiber malalignment,blurred striation in myocardial cells

Fig.2 Effect of Qindan granules on ultrastructure changes in myocardial tissue of mice irradiated by microwave（Electron microscope×1000）.A：normal control group；B：radiation injury group；C，D and E：Qindan granules 2.5，5.0 and 10.0 g·kg-1protective groups，respectively.Arrows show that mitochondria and muscle filaments were not closely arranged and the mitochondrial matrix was obviously swollen.

2.5 芩丹顆粒對微波輻射小鼠心肌細(xì)胞激活型胱天蛋白酶3和Cyt c蛋白表達(dá)的影響

Western蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖3），與正常對照組比較，微波輻射模型組小鼠心肌組織勻漿中激活型胱天蛋白酶3和Cyt c蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。與輻射模型組比較，芩丹顆粒5.0和10.0 g·kg-1防護(hù)組激活型胱天蛋白酶3和Cyt c的表達(dá)顯著下降（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of Qindan granules on protein expression of cleaved caspase 3（A）and cytochrome c（B）in myocardial tissue of mice irradiated by microwave. 1：normal control；2：radiation injury group；3，4 and 5：Qindan granules 2.5，5.0 and 10.0 g·kg-1protective group，respectively. A2 and B2 were the semiquantitativeresults of A1 and B1, respectively.IA:inntegrated absorbance.，＊＊P＜0.01，comparedwithnormalcontrolgroup；##P＜0.01，compared with radiation injury group.

3 討論

心臟是微波輻射敏感的靶器官之一，微波對心臟的損傷有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，但其規(guī)律仍未闡明［9］。研究表明，高功率微波照射對大鼠心肌組織的損傷程度存在劑量效應(yīng)關(guān)系，功率密度越大，損傷越嚴(yán)重，病變出現(xiàn)越早，恢復(fù)越遲［10］。目前，對微波輻射致心臟損傷只能依靠物理方法及裝備來達(dá)到防護(hù)目的，今后在加強(qiáng)物理方法防護(hù)同時(shí)，加大對輻射所致心臟損傷防治藥物的研究具有重要的意義［11-12］。依據(jù)微波輻射損傷作用機(jī)制，結(jié)合中醫(yī)藥理論，我們研制出抗微波輻射損傷的中藥復(fù)方制劑芩丹顆粒。本研究以小鼠為研究對象，從能量代謝和超微結(jié)構(gòu)方面探討芩丹顆粒在微波輻射所致小鼠心臟損傷的作用。

CK，GOT和LDH在心肌中含量較高，當(dāng)心肌細(xì)胞受到損傷后，三者在血清中含量陡然增高，所以血清中GOT，CK和LDH的含量水平能敏感地反映心肌細(xì)胞受損程度［13］。心臟是個(gè)高耗氧、高耗能的器官，心肌組織唯一能直接利用的能量形式是ATP。心肌細(xì)胞具有高密度的線粒體分布，線粒體通過氧化磷酸化作用為細(xì)胞的各項(xiàng)活動(dòng)提供能量［14］。因此，ATP酶活性的高低及線粒體功能是評價(jià)各種細(xì)胞能量代謝及功能有無損傷的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，經(jīng)強(qiáng)度為100 mW·cm-2微波輻射后，小鼠血清中GOT，CK和LDH含量明顯升高，心肌酶發(fā)生紊亂；同時(shí)心肌組織中ATP含量和線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ和Ⅴ活性明顯下降。芩丹顆粒防護(hù)組小鼠血清中GOT，CK和LDH含量明顯下降，心肌細(xì)胞的ATP含量及心臟組織中線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ和Ⅴ活性明顯升高。表明芩丹顆粒對微波輻射損傷小鼠心臟損傷及能量代謝具有一定的防護(hù)作用。心肌組織病理變化和超微結(jié)構(gòu)的變化趨勢與上述結(jié)果相符。

Cyt c是線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體，對線粒體能量代謝起重要的調(diào)節(jié)作用［15-16］。線粒體中的Cyt c除與細(xì)胞有氧活動(dòng)有關(guān)外，還可激活和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Cyt c自線粒體釋放至細(xì)胞漿為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)，由線粒體釋放Cyt c介導(dǎo)活化胱天蛋白酶3引起細(xì)胞凋亡［17］。Western蛋白印跡結(jié)果顯示，微波輻射后胞漿Cyt c和激活型胱天蛋白酶3蛋白的表達(dá)量明顯升高，說明微波輻射對心肌組織能量代謝具有影響，能夠誘發(fā)損傷。而芩丹顆粒防護(hù)組Cyt c和激活型胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)明顯下降，表明其對微波所致的心肌細(xì)胞損傷具有防護(hù)作用，與上述研究結(jié)果相符。

綜上，微波輻射可以導(dǎo)致心肌酶紊亂，引起ATP酶活性降低，破壞并消耗機(jī)體抗氧化物質(zhì)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體的損傷。芩丹顆粒對微波輻射損傷小鼠心臟具有防護(hù)作用，其機(jī)制可能與改善微波所致心肌細(xì)胞能量代謝損傷有關(guān)。具體的作用機(jī)制還有待深入研究。

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Protective effect of Qindan granules on mouse heart injury irradiated by microwave

ZHU Wen-he，ZHONG Xiu-hong，XU Jun-jie，ZHANG Hong，LYU Shi-jie
（Department of Biochemistry，Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

OBJECTlVETo investigate the protective effect ofQindangranules on the heart of mice irradiated by microwave.METHODSSixty mice were randomly divided into 5 groups：normal control group，100 mW·cm-2microwave radiation injury group，andQindangranules 2.5，5 and 10 g·kg-1protective groups.Six hours after microwave irradiation，Qindangranules were ig given to the mice ofQindangranules protective groups once daily for 7 d.After 6 h of treatment，blood was collected.The activities of glutamic oxalacetic transaminase（GOT），lactate dehydrogenase（LDH）and creatine kinase（CK）in serum were detected by the biochemical method.The adenosine triphosphate（ATP）content and the activity of mitochondrial complexesⅣandⅤin heart tissue were measured by colorimetric method.The changes in tissue structure were observed by light microscopy and electron microscopy.The expression of cytochrome c（Cyt c）and cleaved caspase 3 was detected by Western blotting.RESULTSMyocardial cells developed edema.The number of mitochondria decreased while abnormal morphology，the content of GOT，CK and LDH increased in serum（P＜0.01）.The activity of ATP and mitochondrial complexesⅣandⅤdecreased significantly（P＜0.01）compared with normal control in cardiac tissue and myocardial cells were also injured.The expression of Cyt c and cleaved caspase 3 was increased in myocardial cells（P＜0.01）.Compared with microwave radiation group，the activity of ATP and mitochondrial complexesⅣandⅤincreased significantly inQindangranules 2.5，5 and 10 g·kg-1protective groups（P＜0.01）.The injured myocardial cells were improved and the structure of nuclei and organelles was normalized.The expression of Cyt c and cleaved caspase 3 was decreased（P＜0.01）.CONCLUSlONQindangranules has protective effect on microwave radiation induced injury in the mouse heart.The mechanism may be related to the improvement of energy metabolism of myocardium injured by microwave.

microwave radiation；Qindangranules；ATP；mitochondrial respiratory chain

The project supported by Science and Technology Development Project of Jilin Provincial Health Bureau（2012Z066）；and Project Agreement for Science＆Technology Development of Jilin Province（20140204002YY）

LYU Shi-jie，E-mail：jlmpczwh＠163.com

R285.5

A

1000-3002（2015）04-0559-06

2015-01-12接受日期：2015-07-26）

（本文編輯：齊春會(huì)）

吉林省衛(wèi)生廳科技發(fā)展項(xiàng)目（2012Z066）；吉林省科技廳科技發(fā)展項(xiàng)目（20140204002YY）

朱文赫，男，博士，講師，主要從事生物技術(shù)制藥研究，E-mail:huolizwh＠163.com；呂士杰，男，碩士，教授，主要從事輻射損傷防治研究。

呂士杰，E-mail:jlmpczwh＠163.com