超聲輔助提取海帶褐藻多糖硫酸酯的工藝研究

戴圣佳，劉振鋒，2，*，呂衛(wèi)金，張浚偉，陳士國(guó)，葉興乾（.浙江宇翔生物科技有限公司，浙江杭州 0024；2.浙江藍(lán)色海洋生物科技有限公司，浙江舟山6000；.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州0058）

超聲輔助提取海帶褐藻多糖硫酸酯的工藝研究

戴圣佳1，劉振鋒1，2，*，呂衛(wèi)金1，張浚偉1，陳士國(guó)3，葉興乾3
（1.浙江宇翔生物科技有限公司，浙江杭州 310024；2.浙江藍(lán)色海洋生物科技有限公司，浙江舟山316000；3.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

摘要：通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)海帶褐藻多糖硫酸酯的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。確定最佳工藝條件為超聲功率250W、超聲時(shí)間25min、料液比1∶70（g/mL）、溫度60℃，多糖提取率達(dá)5.58%，粗多糖中巖藻糖含量20.93%，硫酸酯基含量26.87%，均高于熱水法提取的多糖。熱水提取方法和超聲輔助提取方法所得的多糖均不含蛋白質(zhì)和核酸，超聲輔助提取的多糖色素更少。

關(guān)鍵詞：海帶；褐藻多糖硫酸酯；超聲；正交試驗(yàn)

褐藻多糖硫酸酯又名褐藻糖膠、巖藻聚糖硫酸酯、巖藻聚糖等，是一類(lèi)含有相當(dāng)數(shù)量巖藻糖和硫酸基的水溶性雜聚糖。它是由高度支鏈化的α-L-巖藻糖-4-硫酸酯形成的聚合物，還伴有半乳糖、甘露糖、糖醛酸、木糖、氨基己糖等，組成和結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，且在不同褐藻中種類(lèi)及含量差異很大[1]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)褐藻多糖硫酸酯具有多種生理活性，包括抗凝血、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫、降血糖和血脂、保護(hù)腎臟、抗腫瘤及抗病毒等[2-5]。

目前，國(guó)內(nèi)外提取海藻多糖主要采用稀堿、稀酸與熱水抽提的方法。這些方法工藝簡(jiǎn)單、操作方便、成本低，但是也存在著提取率較低、活性損失大、過(guò)濾純化困難等缺點(diǎn)，大大限制了海藻多糖大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。近年來(lái)，微波輔助提取、超聲輔助提取與酶解輔助提取等新提取技術(shù)的發(fā)展[6-8]，使得對(duì)海藻多糖的深入研究成為可能。

本試驗(yàn)主要研究了超聲輔助提取技術(shù)對(duì)海帶褐藻多糖硫酸酯提取率的影響，通過(guò)正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化提取工藝以獲得相關(guān)參數(shù)，并對(duì)多糖的部分理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，以期為深度開(kāi)發(fā)海帶資源提供技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

海帶：購(gòu)于杭州世紀(jì)聯(lián)華超市。將海帶洗凈曬干粉碎后過(guò)60目篩，獲得海帶干粉，置干燥器中以備后續(xù)處理。

L-巖藻糖（Sigma）；葡萄糖、濃硫酸、苯酚、明膠、氯化鋇、硫酸鉀、三氯乙酸、無(wú)水乙醇、L-半胱氨酸鹽酸鹽、95%乙醇、濃鹽酸等均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

JY88-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝科器研究所；HH2型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海嘉鵬科技有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-2550：日本SHIMADZU公司；FD1.0-60型冷凍干燥機(jī)：丹麥Heto公司；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)：美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3方法

1.3.1樣品制備

參考劉旭等[9]的方法并稍作修改。取海帶干粉4g，在不同條件下超聲輔助提取，離心后取上清液抽濾，濾液濃縮，加95%乙醇至其體積分?jǐn)?shù)為30%，靜置1 h，離心去除褐藻膠，上清液加入95%乙醇至其體積分?jǐn)?shù)為70%，離心收集沉淀并用無(wú)水乙醇、丙酮洗滌，冷凍干燥即得褐藻多糖硫酸酯粗品。

1.3.2多糖含量的測(cè)定

多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[10]。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)單糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在490 nm處測(cè)定吸光度，以糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，得到回歸方程為Y＝0.043 3X+0.006，R2＝0.996 2。多糖提取率按下式計(jì)算。

式中：X為在Y吸光度下根據(jù)回歸方程計(jì)算所得的值；ρ為校正系數(shù)，以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，ρ=0.9。

1.3.3巖藻糖含量的測(cè)定

巖藻糖含量的測(cè)定采用半胱氨酸鹽酸鹽法[11]。以L(fǎng)-巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程為Y＝0.001 8X+0.001 6，R2＝0.997 2，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算其巖藻糖含量。

1.3.4硫酸酯基含量的測(cè)定

硫酸酯基含量的測(cè)定采用明膠-氯化鋇法[10]。以標(biāo)準(zhǔn)的硫酸酯基溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到的回歸方程為Y＝12.769X＋0.031 4（R2＝0.992 7），其中以硫酸酯基質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)。

樣品含量測(cè)定：取一定量樣品，加1mol/LHCl配成1.5mg/mL的溶液，在100℃水浴鍋中水解2 h，取出冷卻至室溫，取0.6m L按標(biāo)準(zhǔn)品方法測(cè)其吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算其硫酸酯基含量。

1.3.5單因素試驗(yàn)

以超聲功率、料液比、時(shí)間和溫度為4個(gè)單因素，按表1進(jìn)行試驗(yàn)。

表1　褐藻多糖硫酸酯提取的單因素試驗(yàn)Table 1　Single factor test for theextraction of fucoidan

1.3.6正交試驗(yàn)

整合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，用正交試驗(yàn)進(jìn)行條件優(yōu)化。以多糖提取率、粗多糖中巖藻糖含量、硫酸酯基含量為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)海帶干粉多糖進(jìn)行超聲輔助提取試驗(yàn)。

1.3.7蛋白質(zhì)與核酸的檢驗(yàn)

取多糖樣品溶液在紫外分光光度計(jì)上掃描200nm～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收曲線(xiàn)。觀(guān)察多糖樣品的吸收曲線(xiàn)在280 nm和260 nm波長(zhǎng)條件下有無(wú)吸收峰，確定樣品中是否含有蛋白質(zhì)或核酸。

1.3.8超聲波輔助提取法與熱水提取法[12]的比較

取一定量的海帶干粉，按1.3.6節(jié)優(yōu)化后的提取條件和熱水法分別提取，所得粗多糖按1.3.2節(jié)、1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)的方法，分別測(cè)定多糖含量、巖藻糖含量和硫酸酯基含量，并對(duì)各種指標(biāo)進(jìn)行比較。

1.3.9數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0制圖，采用SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)置為P＜0.05，圖中不同字母（a、b、c）表示不同水平間存在顯著差異。

2　結(jié)果與分析

2.1超聲輔助提取多糖的單因素試驗(yàn)

2.1.1料液比對(duì)多糖提取率的影響

料液比對(duì)多糖提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.1　Effect of solid/liquid ratio on theextraction of fucoidan

從圖1可以看出，超聲輔助提取多糖的提取率隨著料液比增加而不斷提高，從最初料液比為1∶30（g/mL）時(shí)的4.84%上升到最后料液比為1∶80（g/mL）時(shí)的5.20%。這可能是由于超聲波能有效地將細(xì)胞壁破碎，溶出有效成分，然而同時(shí)也溶出了大量的黏性液質(zhì)，不利于傳質(zhì)擴(kuò)散[13]，而增大料液比，提高溶劑的比例，可以有效地降低提取液的黏度，從而有利于多糖的提取。但在實(shí)際操作過(guò)程中，溶液體積過(guò)大不利于后續(xù)的濃縮和醇沉實(shí)驗(yàn)，同時(shí)也會(huì)增加生產(chǎn)成本，因此根據(jù)試驗(yàn)條件選取合適的料液比，設(shè)定正交表中料液比的3個(gè)水平為1∶60、1∶70、1∶80（g/mL）。

2.1.2超聲功率對(duì)多糖提取率的影響

超聲功率對(duì)多糖提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　超聲功率對(duì)多糖提取率的影響Fig.2　Effectof ultrasonic power on the extraction of fucoidan

從圖2可以看出，超聲功率對(duì)多糖提取率有顯著的影響。超聲輔助提取技術(shù)利用超聲波具有的強(qiáng)烈震動(dòng)、強(qiáng)烈空化效應(yīng)以及高速攪拌作用，使植物細(xì)胞內(nèi)的有效物質(zhì)快速進(jìn)入溶劑[14]，而超聲功率決定了超聲波與介質(zhì)相互作用的程度，從而影響有效成分的提取率。結(jié)果所示，多糖提取率從超聲功率為100W時(shí)的4.24%迅速增加，并在超聲功率為250W時(shí)達(dá)到最大的5.16%，提高21.7%，之后呈下降趨勢(shì)。這可能是由于超聲作用進(jìn)一步增強(qiáng)，使提取液流動(dòng)加速，從而物料停留在超聲場(chǎng)中的時(shí)間減少，破壁作用減弱，多糖溶出速率減緩；另一個(gè)原因可能是超聲功率過(guò)大會(huì)引起部分多糖的降解。故根據(jù)試驗(yàn)條件，設(shè)定正交表中超聲功率的3個(gè)水平為200、250、300W。

2.1.3超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic tim eon theextraction of fucoidan

從圖3可以看出，多糖提取率和超聲時(shí)間之間緊密相關(guān)。超聲5min時(shí)，提取率為4.31%，之后隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)而顯著上升，在超聲25min時(shí)達(dá)到最大為5.04%，提高16.94%，隨后有所下降。由于褐藻多糖硫酸酯主要存在于細(xì)胞間和細(xì)胞壁中，超聲能在短時(shí)間內(nèi)破碎細(xì)胞，使其釋放出來(lái)。當(dāng)超聲處理時(shí)間太短時(shí)，還不足以破碎細(xì)胞釋放多糖；而時(shí)間太長(zhǎng)，超聲波的機(jī)械剪切作用會(huì)使多糖降解，破壞多糖結(jié)構(gòu)[15]，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量不溶物及黏液質(zhì)等溶出，從而增大了傳質(zhì)阻力，影響了有效成分的提取。故根據(jù)試驗(yàn)條件，設(shè)定正交表中超聲時(shí)間的3個(gè)水平為20、25、30min。2.1.4溫度對(duì)多糖提取率的影響

溫度對(duì)多糖提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.4　Effectof tem peratureon the extraction of fucoidan

溫度是影響多糖提取率的重要因素之一，溫度過(guò)低，不利于有效成分的溶出；溫度過(guò)高則可能會(huì)使多糖發(fā)生降解或者失去活性。溫度對(duì)多糖提取率的影響變化趨勢(shì)如圖4所示。從圖中可以看出，多糖提取率隨著溫度的上升而不斷提高。當(dāng)溫度為20℃～50℃時(shí)，多糖提取率上升速度較快，從4.61%提高至5.16%，之后在溫度為50℃～70℃時(shí)，多糖提取率保持緩慢增加。為保證較高的多糖提取率，同時(shí)避免因溫度過(guò)高而引起多糖失活或發(fā)生降解，設(shè)定正交表中提取溫度的3個(gè)水平為50、60、70℃。

2.2超聲輔助提取多糖的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定超聲功率、超聲時(shí)間、料液比、溫度4因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。褐藻多糖硫酸酯的化學(xué)組成以L(fǎng)-巖藻糖和硫酸酯基為主，且其生物活性與硫酸酯基的含量呈正相關(guān)[13]，因此，選擇以多糖提取率、巖藻糖含量和硫酸酯基含量作為優(yōu)化指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　正交試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)Table2　Factorsand levelsin orthogonalarray design

表3　超聲輔助提取褐藻多糖硫酸酯正交試驗(yàn)結(jié)果Table3 O r thogonalarray designmatrix and cor responding results

由表3極差分析結(jié)果可以看出，以多糖提取率為指標(biāo)的因素影響程度依次為：A、B、D、C，即超聲功率＞超聲時(shí)間＞溫度＞料液比，最佳組合為：A2B2C3D2；以粗多糖中巖藻糖含量為指標(biāo)的因素影響程度依次為：A＞B＞C＞D，即超聲功率＞超聲時(shí)間＞料液比＞溫度，最佳組合為：A2B1C2D3；以硫酸酯基含量為指標(biāo)的因素影響程度依次為：A＞D＞C＞B，即超聲功率＞溫度＞料液比＞超聲時(shí)間，最佳組合為：A2B2C2D2。

3個(gè)指標(biāo)單獨(dú)分析出來(lái)的最佳組合條件并不一致，所以需要根據(jù)因素對(duì)3個(gè)指標(biāo)的影響程度綜合考慮，確定最優(yōu)工藝條件。超聲功率對(duì)3個(gè)指標(biāo)的影響都是第一位，且都是A2，因此超聲功率就選擇250W；超聲時(shí)間對(duì)指標(biāo)的影響有兩個(gè)第二位，所以考慮B1和B2，但取B2可以獲得更高的多糖提取率和硫酸酯基含量，所以超聲時(shí)間選擇25min；料液比對(duì)指標(biāo)的影響有兩個(gè)第三位，且都是C2，故料液比選擇1∶70（g/mL）；溫度對(duì)硫酸酯基含量的影響排第二位，對(duì)多糖提取率的影響排第三位，并且都是取D2較好，所以溫度選擇60℃。經(jīng)過(guò)綜合分析可知，本試驗(yàn)的最優(yōu)條件為A2B2C2D2，即超聲功率250W、超聲時(shí)間25min、料液比1∶70（g/mL）、溫度60℃。

2.3超聲輔助提取法與熱水提取法的比較

根據(jù)正交試驗(yàn)所得的超聲輔助提取最優(yōu)工藝條件與熱水法提取褐藻多糖硫酸酯的對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　超聲輔助提取法和熱水提取法的比較Table 4　Com parison between thism ethod and hotwater extractionmethod

由表4可知，超聲輔助法的多糖提取率為5.58%，與劉群等[16]測(cè)得的結(jié)果（5.641%）非常接近，與高溫長(zhǎng)時(shí)間的熱水提取相當(dāng)，而明顯優(yōu)于相同時(shí)間下熱水法的多糖提取率。超聲輔助提取的巖藻糖含量為20.93%，與尤瑜敏等[17]測(cè)得的結(jié)果（19.56%）相近，而硫酸酯基含量為26.87%，高于王健等[18]測(cè)得的21.49%，但低于劉旭等[19]測(cè)得的37.14%。但是，兩者均顯著高于熱水法提取，尤其是高溫長(zhǎng)時(shí)間提取獲得的粗多糖中硫酸酯基含量最低，這可能是由于較高的溫度會(huì)在一定程度上破壞多糖分子結(jié)構(gòu)，降低其硫酸酯基含量。

結(jié)果表明，超聲輔助提取工藝所需時(shí)間短、溫度較低，能夠增加多糖提取率并保持其生物活性，另外，兩種方法提取的多糖均不含蛋白質(zhì)或核酸。超聲輔助提取獲得的多糖產(chǎn)品顏色也較淺，說(shuō)明超聲輔助提取法能有效減少色素的析出，有利于簡(jiǎn)化除色素等預(yù)處理步驟?？梢钥闯?，超聲波輔助提取法是一種良好的多糖提取新工藝。

3　結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)，初步考察了超聲輔助提取海帶褐藻多糖硫酸酯工藝中超聲功率、超聲時(shí)間、料液比、溫度對(duì)多糖提取率的影響，確定了正交試驗(yàn)方案并進(jìn)行條件優(yōu)化。經(jīng)極差分析，多重比較，得出海帶褐藻多糖硫酸酯的最佳提取條件為：超聲功率250W、超聲時(shí)間25min、料液比1∶70（g/mL）、溫度60℃。在此工藝條件下獲得多糖樣品，多糖提取率為5.58%，粗多糖中巖藻糖含量為20.93%，硫酸酯基含量為26.87%，均顯著高于熱水法提取。超聲輔助提取工藝能夠增加多糖提取率并保持其生物活性，還能減少色素、蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)的溶出，有利于后續(xù)的分離純化過(guò)程，為海帶的高價(jià)值化應(yīng)用提供了理論參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]Jiang ZD,Okimura T,Yokose T,et al.Effects of sulfated fucan,ascophyllan,from the brown Alga Ascophyllum nodosum on various cell lines:A comparative study on ascophyllan and fucoidan[J]. Journalofbioscienceand bioengineering,2010,110(1):113-117

[2]王凌,孫利芹,周妍.小球藻多糖體外免疫調(diào)節(jié)活性研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2013,34(7):30-32

[3]Hyun JH,Kim SC,Kang JI,etal.Apoptosis Inducingactivityof fucoidan in HCT-15 colon carcinoma cells[J].Biological&pharmaceuticalbulletin,2009,32(10):1760-1764

[4]馮珍鴿,王力,吳永沛,等.褐藻中巖藻聚糖的化學(xué)成分及其對(duì)超氧離子的抑制作用[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2010,31(3):66-68

[5]Veena C K,Josephine A,Preetha S P,et al.Renal peroxidative changesmediated by oxalate:the protective role of fucoidan[J].Life sciences,2006,79(19):1789-1795

[6]Zhong K,Lin W J,WangQ,etal.Extraction and radicalsscavenging activity of polysaccharides with microwave extraction from mung bean hulls[J].International journal of biological macromolecules, 2012,51(4):612-617

[7]Hahn T,Lang S,Ulber R,etal.Novelprocedures for the extraction of fucoidan from brown algae[J].Process Biochemistry,2012,47(12): 1691-1698

[8]王曉林,鐘方麗,楊蕾.微波法輔助提取玉竹多糖的工藝[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2012,33(3):46-50

[9]劉旭,曲桂燕,周裔彬,等.海帶廢渣中提取巖藻聚糖硫酸酯的工藝研究[J].海洋科學(xué),2012,36(12):25-30

[10]張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1987

[11]GibbonsM N.Thedetermination ofmethylpentoses[J].Analyst,1955, 80(949):268-276

[12]丁曉萍,謝玲,顏秀花.海帶中提取巖藻多糖[J].廣州化工,2012, 40(16):82-83

[13]王永良,范賢,李玉蘭,等.超聲輔助提取異枝麒麟菜硫酸酯多糖的工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué),2010,31(6):6-10

[14]張昌軍,原方圓,邵紅兵.超聲波法在提取多糖類(lèi)化合物中的應(yīng)用研究[J].化工時(shí)刊,2007,21(2):54-56

[15]廖建民,張瑾,沈子龍.超聲波法提取海帶多糖的研究[J].藥物生物技術(shù),2002,9(3):157-160

[16]劉群,徐中平.海帶硫酸酯多糖的酶法提取工藝條件[J].河北漁業(yè),2007(6):55-57

[17]尤瑜敏,許時(shí)嬰.羊棲菜中褐藻糖膠的提取工藝[J].無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào),2002,21(3):233-238

[18]王健,吳永沛,于立國(guó).超濾制備海帶巖藻聚糖的工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2012,33(19):210-213

[19]劉旭,曲桂燕,周裔彬.海帶廢渣中提取巖藻聚糖硫酸酯的工藝研究[J].海洋科學(xué),2012,36(12):25-31

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.007

收稿日期：2014-04-22

基金項(xiàng)目：杭州市“雛鷹計(jì)劃”（20131131k132）；杭州市科研攻關(guān)專(zhuān)項(xiàng)（20140432B72）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31301417）

作者簡(jiǎn)介：戴圣佳（1984—），男（漢），本科，研究方向：海洋生物資源開(kāi)發(fā)與利用。

*通信作者：劉振鋒（1980—），男（漢），高級(jí)工程師，博士，研究方向：海洋生物資源開(kāi)發(fā)與利用。

Ultrasonic-assisted Extraction of Fucoidan from Laminaria japonica

DAISheng-jia1，LIU Zhen-feng1，2，*，LüWei-jin1，ZHANG Jun-wei1，CHENShi-guo3，YEXing-qian3
（1.Zhejiang Yuxiang Biotech Co.Ltd.，Hangzhou 310024，Zhejiang，China；2.Zhejiang Bluemarine Biotech Co.Ltd.，Zhoushan 316000，Zhejiang，China；3.Schoolof BiosystemsEngineeringand Food Science，ZhejiangUniversity，Hangzhou 310058，Zhejiang，China）

Abstract：One-factor-at-a-time and orthogonalarraymethodswere used to investigate the optimalultrasonicassisted extraction processof fucoidan from Laminaria japonica in thiswork.The optimum extraction conditions wereultrasonic treatmentpowerof250W，ultrasonic treatmenttimeof25min，material/liquid ratioof1∶70（g/mL）and extraction temperature of60℃.Under thisoptimum condition the extraction rate，the contentsof fucose and sulfate group were 5.58%，20.93%and 26.87%，respectively，higher than obtained by hotwater extraction. Neither protein nornucleic acid was found in fucoidan obtained using hotwaterextraction or ultrosonic-assisted extraction method，and less pigment was found in fucoidan obtained using ultrosonic-assisted extraction method.

Keywords：Laminaria japonica；fucoidan；ultrasonic；orthogonalarray design