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    miRNA-145抑制肺癌A549細(xì)胞增殖活性的機(jī)制

    2015-07-22 09:39:04王丹
    關(guān)鍵詞:報(bào)告基因熒光素酶肺癌

    王丹

    (第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部神經(jīng)生物學(xué)教研室,上海200433)

    miRNA-145抑制肺癌A549細(xì)胞增殖活性的機(jī)制

    王丹

    (第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部神經(jīng)生物學(xué)教研室,上海200433)

    目的:研究miRNA-145(miR-145)抑制肺癌A549細(xì)胞增殖活性的機(jī)制。方法:應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)Sp1基因3′-UTR區(qū)與miR-145的結(jié)合位點(diǎn)并通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因法進(jìn)行驗(yàn)證;轉(zhuǎn)染miRNA-145擬似物和阻遏物到A549細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-145含量,蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中Sp1蛋白含量;同時(shí)采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24,48和72 h A549細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果:熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證結(jié)果表明,成功預(yù)測(cè)了miR-145與人Sp1基因3′-UTR區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)。與單獨(dú)轉(zhuǎn)染組比較,miR-145擬似物和miR-145阻遏物與野生型熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染可以明顯抑制或增強(qiáng)熒光素酶活性(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-145擬似物和阻遏物能明顯抑制或者促進(jìn)A549細(xì)胞內(nèi)Sp1蛋白的表達(dá)(P均<0.05)。實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染后48 h,與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較,擬似物組細(xì)胞內(nèi)miR-145含量明顯上升,而阻遏組細(xì)胞內(nèi)miR-145含量明顯下降(P均<0.05),陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組miR-145相對(duì)含量間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染72 h后,擬似物組細(xì)胞增殖活性明顯降低,而阻遏組細(xì)胞活性明顯增高(P均<0.05)。結(jié)論miR-145通過(guò)抑制Sp1基因表達(dá),明顯抑制A549細(xì)胞的增殖活性。

    轉(zhuǎn)錄因子Sp1;A549細(xì)胞;miR-145;增殖活性

    我國(guó)每年新發(fā)肺癌約70萬(wàn)例,對(duì)74個(gè)城市肺癌抽樣調(diào)查顯示,肺癌死亡率占各種惡性腫瘤死亡率的首位[1-2]。因此,尋找潛在的基因靶點(diǎn)和新的治療手段,已成為肺癌治療中迫切需要解決的問(wèn)題。Sp1基因編碼相對(duì)分子質(zhì)量為105 000的蛋白質(zhì),當(dāng)Sp1蛋白中的激活區(qū)與被調(diào)控基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA結(jié)合后,可以影響基因轉(zhuǎn)錄活性[3]。Sp1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),在多種腫瘤,如胃癌、胰腺癌、乳腺癌和甲狀腺腫瘤中都有高表達(dá)[4-5]。多項(xiàng)研究指出,在同一患者體內(nèi),腫瘤組織中的Sp1蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織,且與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-7]。Sp1在不同類型腫瘤中異常表達(dá)的原因不盡相同,而呈現(xiàn)多樣性。

    據(jù)報(bào)道,Sp1蛋白在肺癌中高表達(dá)[8],而微小RNA(microRNA,miRNAs)則可通過(guò)調(diào)控Sp1蛋白影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9-10]。我們使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)Sp1基因3′-UTR區(qū)可能存在理論靶位的miRNAs,發(fā)現(xiàn)存在miR-145理論結(jié)合位點(diǎn)。我們據(jù)此推測(cè),肺癌細(xì)胞內(nèi)Sp1基因高表達(dá)可能與miR-145的低表達(dá)相關(guān),如果miR-145與Sp1基因具有靶位關(guān)系,很可能肺癌細(xì)胞中miR-145的低表達(dá)會(huì)減弱其對(duì)Sp1基因的調(diào)控作用,這也有可能是腫瘤細(xì)胞中Sp1蛋白高表達(dá)的原因之一。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)has-miR-145與人Sp1之間可能存在的靶位關(guān)系,并通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證;在A549細(xì)胞內(nèi)干預(yù)miR-145,觀察Sp1蛋白表達(dá)以及細(xì)胞增殖能力的變化,進(jìn)而明確miR-145在肺癌調(diào)控中的作用和機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞與試劑

    人肺癌A549細(xì)胞和293細(xì)胞均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑盒(Trizol)及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLV)均為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品,熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體(pGL3-Promoter)和熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(Promega公司),Sp1蛋白一抗及二抗均為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品,細(xì)胞總蛋白提取及定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒均為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品,miRNA合成、測(cè)序均由Invitrogen公司進(jìn)行,MTT和DMSO為Sigma公司產(chǎn)品。

    1.2 儀器和設(shè)備

    細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品,水平離心機(jī)、高速低溫離心機(jī)以及微量移液器為Eppendorf公司產(chǎn)品,電泳儀、垂直電泳槽及轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于上海天能公司,酶標(biāo)儀及紫外分光光度檢測(cè)儀為Thermo公司產(chǎn)品,PCR儀為TaKaRa公司產(chǎn)品。

    1.3 方法

    1.3.1 miR-145靶基因預(yù)測(cè) 采用TargetScan預(yù)測(cè)軟件對(duì)Sp1(NM_003109)3′-UTR區(qū)進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),分析是否存在miR-145的結(jié)合位點(diǎn)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖1),hsa-miR-145在Sp1的3′-UTR區(qū)存在6個(gè)堿基的種子區(qū)。

    圖1 hsa-m iR-145與Sp1的靶位關(guān)系預(yù)測(cè)

    1.3.2 has-miR-145與Sp1預(yù)測(cè)靶位關(guān)系的驗(yàn)證

    1.3.2.1 熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體的構(gòu)建 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293細(xì)胞,Trizol裂解法提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。針對(duì)Sp1基因3′-UTR區(qū)設(shè)計(jì)PCR引物:上游引物,5′-GCTCTAGATTGTATATCCTATATAGG-3′,下游引物,5′-GCTCTAGAAAGCATAACAGGGGCCTGATT-3′,引物兩端分別添加XbaⅠ酶切位點(diǎn),PCR擴(kuò)增包含miR-145靶位5′-ACTGGA-3′在內(nèi)的219 bp的堿基序列。取2μL cDNA為模板,使用上面引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)數(shù)為38個(gè)。擴(kuò)增后使用XbaⅠ對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切處理,酶切回收目的片段后克隆至pGL3-Promoter熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體,重組載體經(jīng)序列分析后命名為pGL3-Pro-WT-Sp1。以pGL3-Pro-WT-Sp1為基礎(chǔ),對(duì)miR-145靶位進(jìn)行點(diǎn)突變,即將5′-ACTGGAA-3′突變?yōu)?′-TGAACAG-3′,構(gòu)建突變型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pGL3-Pro-MT-Sp1。對(duì)兩組熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取。同時(shí),化學(xué)法合成miR-145擬似物,miR-145阻遏物和miR-145陰性對(duì)照。

    1.3.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性檢測(cè) 選取生長(zhǎng)狀況良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代293細(xì)胞,用胰酶消化并制備細(xì)胞懸液,臺(tái)酚藍(lán)染色后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),使用完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL,將細(xì)胞接種到6孔板,每孔加2 mL細(xì)胞懸液,37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,參照Lipofectmaine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒和RNA共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為9組:293細(xì)胞對(duì)照組,293細(xì)胞+pGL3-WT組,293細(xì)胞+pGL3-MT組,293細(xì)胞+NC+pGL3-WT組,293細(xì)胞+NC+pGL3-MT組,293細(xì)胞+ miR-145擬似物+pGL3-WT組,293細(xì)胞+miR-145擬似物+pGL3-MT組,293細(xì)胞+miR-145阻遏物+pGL3-WT組,293細(xì)胞+miR-145阻遏物+pGL3-MT組。同時(shí)每組細(xì)胞轉(zhuǎn)染100 ng的海腎熒光素酶(pGL-TK)作為熒光霉素活性的檢測(cè)參照。轉(zhuǎn)染后48 h,使用Promega公司的雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)和熒光素酶檢測(cè)儀檢測(cè)熒光素酶含量。

    1.3.3 轉(zhuǎn)染miR-145對(duì)肺癌A549細(xì)胞株胞內(nèi)Sp1蛋白表達(dá)的影響

    1.3.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞,胰酶消化后1 000×g離心2 min收集細(xì)胞,用含10%FBS的DMEM重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至1× 105個(gè)/mL,接種細(xì)胞到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔添加2 mL細(xì)胞懸液,37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染過(guò)程按照Lipofectmaine 2000說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分為4組,即轉(zhuǎn)染對(duì)照組(只加轉(zhuǎn)染試劑),陰性對(duì)照(negative-control,NC)序列轉(zhuǎn)染組,miR-145擬似物轉(zhuǎn)染組(擬似組)和miR-145阻遏物轉(zhuǎn)染組(阻遏組)。

    1.3.3.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Sp1的表達(dá)量 轉(zhuǎn)染后48 h,去掉細(xì)胞培養(yǎng)基,每孔加入1 mL無(wú)菌PBS洗細(xì)胞2遍,加入0.5 mL細(xì)胞裂解液,按照試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總蛋白,BCA法定量細(xì)胞總蛋白濃度。定量后的細(xì)胞總蛋白以每組10μL進(jìn)行垂直電泳,SDS-PAGE分離膠濃度為10%,110 V電泳90 min后,立春紅染色觀察蛋白條帶是否完整,400 mA轉(zhuǎn)膜90 min,轉(zhuǎn)膜后以5%脫脂牛奶封閉2 h,4℃一抗孵育過(guò)夜,Sp1和GAPDH一抗稀釋(TBST)比分別為1∶300和1∶1 000;TBST洗膜3次,加入二抗孵育2 h,羊抗鼠二抗稀釋比為1∶4 000;TBST洗膜3次,添加化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)底物,暗室曝光,掃描曝光底片,統(tǒng)計(jì)目的條帶光密度值(D值)。D值目的蛋白/D值GAPDH,即為Sp1蛋白的相對(duì)含量。

    1.3.3 A549細(xì)胞增殖活性的檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后48 h,胰酶消化法制備A549細(xì)胞懸液,離心收集細(xì)胞沉淀,用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL,接種細(xì)胞到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔添加100μL細(xì)胞懸液,輕晃培養(yǎng)板使其分布均勻,37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞,并于接種后的24,48和72 h,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。檢測(cè)前,每孔細(xì)胞加入5mg/mLMTT溶液10μL,輕晃使其分布均勻,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,去上清,每孔加入150μL DMSO溶液,37℃孵育15 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)細(xì)胞液的D值,根據(jù)D值制作細(xì)胞對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)曲線。

    1.3.4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miR-145含量檢測(cè) 細(xì)胞樣本獲取的時(shí)間點(diǎn)與MTT檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)一致,細(xì)胞培養(yǎng)使用6孔板,接種密度為2×105個(gè)/孔。細(xì)胞收集前,每孔使用4℃預(yù)冷的無(wú)菌PBS洗去細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)液及血清;去掉PBS,每孔加入1 mL 4℃預(yù)冷的Trizol細(xì)胞裂解液,震蕩培養(yǎng)板充分裂解細(xì)胞,4℃,12 000×g離心5 min,將分層后的溶液上清轉(zhuǎn)移到無(wú)菌1.5 mL離心管,酚氯仿法抽提RNA,得到沉淀后用20μL DEPC溶解,瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA純度及完整性,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。取2μg的總RNA,反轉(zhuǎn)錄制備cDNA,特異反轉(zhuǎn)錄引物:H.sapiens 6 snRNA:5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′,miR-145:5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAAGGGAT-3′,取2μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板,熒光定量法檢測(cè)miR-145含量。2ΔΔCt法分析定量結(jié)果,內(nèi)參選用U6(NM_001101.3)。PCR反應(yīng)引物序列:U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′,下游引物5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′;miR-145上游引物5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3′,下游引物5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3′。PCR反應(yīng)使用20μL體系,其中,SYBR Premix Ex Taq 10μL,引物(20μmol/L)各取0.2μL,模板使用量為2μL,反應(yīng)體系用無(wú)菌水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件:95℃變性10 s;58℃退火10 s;72℃延伸10 s,循環(huán)數(shù)設(shè)置為40。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 has-miR-145與Sp1靶位關(guān)系驗(yàn)證

    2.1.1 熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體構(gòu)建 通過(guò)PCR擴(kuò)增得到特異的PCR產(chǎn)物,經(jīng)過(guò)與DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物比對(duì),其長(zhǎng)度與理論值(219 bp)完全相符(圖2)。成功構(gòu)建野生型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體,并通過(guò)點(diǎn)突變成功構(gòu)建突變型熒光素酶基因表達(dá)載體,測(cè)序分析結(jié)果顯示,與標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致(圖3)。

    圖2 瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物

    圖3 野生型、突變型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體序列分析

    2.1.2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的熒光素酶活性 9組293細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,熒光素酶相對(duì)活性檢測(cè)結(jié)果顯示,與野生型報(bào)告基因單獨(dú)轉(zhuǎn)染組(293+pGL3-WT)比較,miR-145-擬似物(293+pGL3-WT+miR-145擬似物)能夠明顯抑制野生型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體的熒光素酶活性(P<0.01),而miR-145阻遏組(293+pGL3-WT+miR-145阻遏物)野生型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體的熒光素酶活性則明顯上升(P<0.01)。突變性熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體單獨(dú)轉(zhuǎn)染組(293+pGL3-MT)與miR-145擬似物共轉(zhuǎn)染組(293+pGL3-MT+miR-145擬似物)熒光素酶活性間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-145阻遏物轉(zhuǎn)染(293+pGL3-MT+miR-145阻遏物)對(duì)突變型熒光素酶報(bào)告基因活性也無(wú)明顯影響(P>0.05);miR-145-NC與pGL3-WT共轉(zhuǎn)染組(293+ pGL3-WT+miR-145-NC)對(duì)野生型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05),miR-145-NC與pGL3-MT共轉(zhuǎn)染組(293+ pGL3-MT+miR-145-NC)對(duì)突變型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性亦無(wú)明顯影響(P>0.05),說(shuō)明RNA轉(zhuǎn)染本身對(duì)熒光素酶活性無(wú)影響。以上數(shù)據(jù)和結(jié)果說(shuō)明,has-miR-145與Sp1基因之間的預(yù)測(cè)靶位確實(shí)存在。見圖4。

    圖4 9組293細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性的比較

    2.2 轉(zhuǎn)染后各組A549細(xì)胞內(nèi)Sp1蛋白的含量

    蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染48 h后,與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較,阻遏組細(xì)胞內(nèi)Sp1蛋白含量明顯增加(P<0.05),而擬似組細(xì)胞內(nèi)Sp1蛋白含量明顯降低(P<0.01)。轉(zhuǎn)染對(duì)照組與陰性序列轉(zhuǎn)染組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說(shuō)明Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染過(guò)程對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)Sp1蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。見圖5。

    圖5 4組A549細(xì)胞中Sp1蛋白的表達(dá)

    2.3 miR-145含量變化對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的影響

    細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果(圖6)顯示,轉(zhuǎn)染后48 h和72 h,與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較,擬似組A549細(xì)胞增殖活性明顯降低(P<0.05和0.01),而阻遏組細(xì)胞增殖活性在轉(zhuǎn)染72 h后,明顯高于轉(zhuǎn)染對(duì)照組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后24,48和72 h,收集細(xì)胞,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-145含量。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后各個(gè)時(shí)間段,擬似組細(xì)胞內(nèi)的miR-145表達(dá)量均明顯高于轉(zhuǎn)染對(duì)照組(P均<0.05)。而阻遏組miR-145的表達(dá)均明顯低于轉(zhuǎn)染對(duì)照組(24 h和72 h時(shí)P<0.05,48 h時(shí)P<0.01)。陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)miR-145表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    圖6 m iR-145含量變化對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的影響

    3 討論

    miRNAs是一類分布廣泛的內(nèi)源性非編碼RNA,核酸長(zhǎng)度一般為20~25個(gè)堿基。miRNAs具有高度保守的遺傳學(xué)特性,通過(guò)與基因3′-UTR區(qū)的靶點(diǎn)結(jié)合,對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[11]。miRNA的表達(dá)與多種腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后相關(guān),可作為腫瘤的標(biāo)志分子[12-15]。研究顯示,固有的miRNA調(diào)控機(jī)制失常是多種腫瘤中癌基因及抑癌基因異常表達(dá)的內(nèi)在原因[16-17]。

    Sp1是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種基因調(diào)控蛋白,特異性地結(jié)合在受調(diào)控的基因啟動(dòng)子區(qū)域,選擇性活化啟動(dòng)子引導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。Sp1在多種腫瘤中高表達(dá),并與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后差等密切相關(guān),提示Sp1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中亦起重要作用。針對(duì)Sp1的研究,多以Sp1作為轉(zhuǎn)錄因子對(duì)其下游基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控展開,而對(duì)于Sp1蛋白本身異常的原因,目前尚未見報(bào)道。尋找Sp1在腫瘤中異常的原因,才能追根溯源,為腫瘤的基因治療提供理論基礎(chǔ)。近幾年來(lái)miRNAs與腫瘤的關(guān)系始終是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),已有報(bào)道顯示miRNAs通過(guò)Sp1對(duì)多種腫瘤產(chǎn)生調(diào)控作用[18-20]。鑒于miR-145與Sp1在A549細(xì)胞中表達(dá)具有顯著相關(guān)性,我們有理由相信,miR-145可能通過(guò)對(duì)Sp1的表達(dá)調(diào)控影響肺癌細(xì)胞A549的生物學(xué)功能。

    本研究在miR-145與Sp1表達(dá)具有相關(guān)性的基礎(chǔ)上,通過(guò)生物信息學(xué)方法尋找兩者的結(jié)合位點(diǎn),并通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行位點(diǎn)驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上,嘗試通過(guò)干預(yù)miR-145含量肺癌細(xì)胞產(chǎn)生影響的作用途徑,并最終通過(guò)miRNA調(diào)控理論來(lái)解釋miR-145-Sp1與A549細(xì)胞之間的關(guān)系。研究中,首先利用miRNA靶位的生物學(xué)預(yù)測(cè)在線軟件TargetScan進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在Sp1的3′-UTR有兩處位置存在hsa-miR-145的結(jié)合位點(diǎn),位于序列保守區(qū)(3′-UTR的第3481-3487位)。進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證預(yù)測(cè)的理論幾何位點(diǎn),miR-145可以通過(guò)其位于保守區(qū)的結(jié)合位點(diǎn),結(jié)合于3′-UTR,并對(duì)其上游基因翻譯產(chǎn)生抑制作用。而非保守區(qū)位點(diǎn)為無(wú)效位點(diǎn),之所以出現(xiàn)這樣的原因,可能與位點(diǎn)所處位置有關(guān),另外,從miRNA進(jìn)化角度考慮,其對(duì)于靶基因結(jié)合區(qū)域的物種間保守性也是要求較高的。

    本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染miR-145擬似物和阻遏物到A549細(xì)胞,Sp1蛋白含量檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明,通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法可以在A549細(xì)胞中抑制或增強(qiáng)Sp1蛋白的表達(dá)。其中擬似物轉(zhuǎn)染組胞內(nèi)Sp1蛋白含量較轉(zhuǎn)染對(duì)照組明顯下降,而阻遏物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)Sp1蛋白含量較轉(zhuǎn)染對(duì)照組明顯上升。細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果則表明,過(guò)表達(dá)miR-145可明顯抑制細(xì)胞增殖活性,抑制miR-145則增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖活性。miR-145含量檢測(cè)結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染后48 h,擬似物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)miR-145成熟體含量明顯上升,而阻遏物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)miR-145含量則較轉(zhuǎn)染對(duì)照組明顯下降。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)提示,miR-145的異常表達(dá)可能是A549細(xì)胞中Sp1基因異常的關(guān)鍵原因。事實(shí)上,通過(guò)干預(yù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)miR-145的含量改變Sp1蛋白表達(dá),從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞A549的增殖也經(jīng)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究的意義在于證實(shí)miR-145是肺癌細(xì)胞中Sp1基因異常表達(dá)的主要調(diào)控因素之一,這為以新的基因?yàn)榘悬c(diǎn)的藥物開發(fā)提供了思路。

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    M echanism ofm iRNA-145 inhibits cell proliferation of A549 cells

    WANG Dan
    (Department of Neurobiology,the Second Military Medical University,Shanghai200433,China)

    Objective:To investigate the mechanism underlying how miR-145 inhibits cell proliferation in A549 cells.M ethods:The putativemiR-145 binding sites in the 3′-UTR region of Sp1 gene were predicated by bioinformatics and was predicted by a luciferasemethod.miR-145 levelsweremeasured by qPCR and Sp1 protein levels weremeasured by Western blotting after transiently transfected with eithermiR-145 mimics or inhibitors into A549 cells.MTT assayswere employed to evaluate cell proliferation in A549 cells simultaneously at 24,48 and 72 h after transfection.ResultsThrough report of luciferase analysis,the study successfully predicted and verified the putative miR-145 binding site in the 3′-UTR of human Sp1 gene.The luciferase activity of the wild type is reported that it could be significantly reduced and induced 48 h post-transfection ofmiR-145 mimics and inhibitors respectively and it had significant difference between the above two groups(P<0.05).Compared to the control,transfection ofmiR-145 mimics ormiR-145-inhibitors reduced or induced Sp1 protein levelswith the significant difference(P<0.05).Data from real-time qPCR indicated that transfection ofmiR-145-mimics and inhibitors induced and reduced miR-145 levels respectively compared to the negative control with a significant difference(P<0.05).There was no significant difference between the negative control transfection group and transfection control group(P>0.05).Finally,transfection ofmiR-145-mimics and miR-145-inhibitor could significantly reduce and induce cell proliferation of A549 cells.Seventy-two hours post transfection,there had significant difference betweenmiR-145-mimics transfection group and the negative control transfection group(P<0.05).Conclusion:miR-145 inhibited cell proliferation of A549 cells through reducing Sp1 gene expression.

    book=312,ebook=41

    Sp1 transcription factor;A549 cell;miR-145;cell proliferation

    R734.2

    A

    1671-7783(2015)04-0311-06

    10.13312/j.issn.1671-7783.y150041

    王丹(1980—),女,遼寧大連人,助理實(shí)驗(yàn)師,主要從事膠質(zhì)環(huán)境與神經(jīng)再生研究。

    2015-03-06 [編輯]陳海林

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