螺旋藻體外清除自由基的ESR研究

趙淑銳，鄭美青，吳英婷，薛　冰（首都醫(yī)科大學醫(yī)學實驗與測試中心，北京100069）

螺旋藻體外清除自由基的ESR研究

趙淑銳，鄭美青，吳英婷，薛冰
（首都醫(yī)科大學醫(yī)學實驗與測試中心，北京100069）

摘要：利用DPPH、Fenton反應、SNAP、黃嘌呤氧化酶氧化黃嘌呤反應產生活性有機氮自由基、羥自由基（·OH）、一氧化氮（NO）自由基、超氧陰離子（·O2-）自由基，以電子順磁共振法（ESR）研究了螺旋藻體外清除上述四種自由基的作用。該方法操作簡單易行，結果直觀。結果表明螺旋藻能有效清除上述4種自由基，而且隨濃度的增加抗氧化能力也增加，濃度在40 mg/mL時對超氧陰離子和有機氮自由基的清除率達到了90%以上。

關鍵詞：螺旋藻；DPPH；羥自由基；一氧化氮自由基；超氧陰離子；電子順磁共振

tron paramagnetic resonance

自由基是一種含不成對電子的分子、原子或離子，是生物體在新陳代謝過程中產生的中間代謝產物[1]。常見的自由基有：超氧陰離子自由基、羥自由基、脂質自由基、一氧化氮自由基、有機自由基等。自由基很不穩(wěn)定，極容易與其它物質反應生成新的自由基，因而產生連鎖反應[2]。自由基通過各種不同的途徑，干擾重要的生理過程[3]，與心臟疾病、腦血管疾病、糖尿病、腫瘤、高血壓、衰老、皮膚皺紋、老年癡呆、老年性白內障、靜脈曲張等70多種疾病有關[4]。因此，研究抑制自由基反應的抗氧化劑有重大意義。

電子順磁共振（ESR）是直接檢測和研究含有未成對電子的順磁性物質的一種現(xiàn)代分析方法[5]。ESR技術是利用具有單電子的物質在靜磁場作用下吸收電磁波能量而完成電子能級間躍遷的這種特性，對順磁性的物質進行檢測和分析，它也是檢測單電子的唯一直接的方法，ESR檢測技術具有靈敏度高、無干擾、樣品不受破壞等優(yōu)點，是目前檢測自由基最直接、最有效的方法之一[6]。

近幾年有大量研究表明，螺旋藻具有降血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗凝血、抗氧化及增強機體免疫力等生物活性[7]。本實驗利用電磁共振技術，選取常見的不同種自由基，初步研究了鈍頂螺旋藻對不同自由基的清除能力。

1　材料與方法

1.1材料

鈍頂螺旋藻粉：云南天然坊生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）、5，5-二甲基-1-氧化吡咯啉（DMPO）、S-亞硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、二乙基三胺五乙酸（DETAPAC）均購自美國Sigma公司；N-甲基-葡萄糖胺（MGD）；二氧六環(huán)、30%過氧化氫：分析純，北京化工廠；七水合硫酸亞鐵：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；超純水：美國Millipore公司Milli-Q Academic A10超純水系統(tǒng)生產。

1.2儀器設備

JES-FA300電子自旋共振儀及配套設備：石英標準樣品管（內徑為4 mm）。

1.3方法

1.3.1樣品預處理

準確稱取40 mg鈍頂螺旋藻粉，加1 mL蒸餾水，充分振蕩，得到濃度為40 mg/mL的懸濁液，然后用蒸餾水稀釋至20、10、5、1、0.5 mg/mL。

1.3.2試劑的配置

稱取8 mg DPPH，溶解于10 mL二氧六環(huán)中，濃度為2×10-3mol/L。稱取七水合硫酸亞鐵27.8 mg，溶解于10 mL蒸餾水中，濃度為10 mmol/L。稱取MGD7.3 mg，溶解于1 mL蒸餾水中，濃度為25 mmol/L。稱取SNAP 2.2 mg，溶解于10 mL蒸餾水中，濃度為1 mmol/L。將30%的H2O2用蒸餾水稀釋至濃度為1%的H2O2。稱取黃嘌呤300 mg，溶于3.5 mL蒸餾水中，濃度為560 mmol/L。吸取黃嘌呤氧化酶100 μL，用蒸餾水稀釋至1 mL。稱取DETAPAC 1 mg，溶解于3 mL蒸餾水中，濃度為0.9 mmol/L。稱取DMPO 22.6 mg，溶于2 mL蒸餾水中，濃度為100 mmol/L，加入200 mg活性炭，攪拌10 min，過濾，備用。以上試劑均需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3Fenton反應產生·OH及清除活性測定

本實驗利用Fe2+經H2O2氧化成Fe3+產生的羥自由基，由自旋捕捉劑DMPO捕捉，經電子順磁共振儀掃描，得到羥自由基的特征譜圖。10 mmol/L的七水合硫酸亞鐵溶液，蒸餾水，100 mmol/L的DMPO水溶液，1%的H2O2溶液。以上4種試劑按順序各取5 μL注入EP管，混勻后快速裝入石英毛細管中，然后外加樣品保護測試管，一并放入ESR波譜儀的諧振腔中進行測定，作為對照樣品，以扣除試劑本身對自由基的影響。測樣品時用樣品溶液代替蒸餾水，其余操作同上。每個濃度做3個平行樣，測量后取平均值，結果見圖1。

自由基清除率（%）的計算公式：I=（h0-hx）/h0×100，式中：h0為對照樣品中ESR譜信號強度測量值；hx為樣品中ESR譜信號強度測量值。由圖1可見，I值越大，清除自由基能力越強。樣品測試條件為：掃描時間1min、中心磁場336 mT、掃描寬度15 mT、微波功率1 mW、調制寬度0.35 mT。

1.3.4清除NO自由基的測定

本實驗利用SNAP作為NO自由基供體，用鐵鹽絡合物MGD-Fe捕捉NO自由基。經電子順磁共振儀掃描，得到一氧化氮自由基的特征譜圖。10 mmol/L的七水合硫酸亞鐵溶液，25 mmol/L的MGD水溶液，蒸餾水，1 mmol/L的SNAP水溶液。以上4種試劑按順序各取5 μL注入EP管，混勻后快速裝入石英毛細管中，然后外加樣品保護測試管，一并放入ESR波譜儀的諧振腔中進行測定，作為對照樣品，以扣除試劑本身對自由基的影響。測樣品時用樣品溶液代替蒸餾水，其余操作同上。每個濃度做3個平行樣，測量后取平均值，結果見圖2。

圖1　羥自由基（·OH）圖譜Fig.1　Spectrum of hydroxyl radical（·OH）

圖2　一氧化氮（NO）自由基圖譜Fig.2　Spectrum of nitric oxide radical（NO）

自由基清除率（%）的計算公式：I=（h0-hx）/h0×100，式中：h0為對照樣品中ESR譜信號強度測量值；hx為樣品中ESR譜信號強度測量值。由圖2可見，I值越大，清除自由基能力越強（見圖2）。樣品測試條件為：掃描時間1 min、中心磁場330 mT、掃描寬度15 mT、微波功率1 mW、調制寬度0.35 mT。

1.3.5清除超氧陰離子自由基的測定

本試驗利用黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶反應生成超氧陰離子，用DMPO捕捉超氧陰離子。經電子順磁共振儀掃描，得到超氧陰離子的特征譜圖。100 mmol/L 的DMPO溶液，0.9 mmol/L的DETAPAC水溶液，560 mmol/L的黃嘌呤水溶液，蒸餾水，稀釋10倍后的黃嘌呤氧化酶水溶液。以上4種試劑按順序各取5 μL注入EP管，混勻后快速裝入石英毛細管中，然后外加樣品保護測試管，一并放入ESR波譜儀的諧振腔中進行測定，作為對照樣品，以扣除試劑本身對自由基的影響。測樣品時用樣品溶液代替蒸餾水，其余操作同上。每個濃度做3個平行樣，測量后取平均值，結果見圖3。

圖3　超氧陰離子自由基（·O2-）圖譜Fig.3　Spectrum of Superoxide anion（·O2-）

自由基清除率（%）的計算公式：I=（h0-hx）/h0×100，式中：h0為對照樣品中ESR譜信號強度測量值；hx為樣品中ESR譜信號強度測量值。由圖3可見，I值越大，清除自由基能力越強。樣品測試條件為：掃描時間1 min、中心磁場336 mT、掃描寬度15 mT、微波功率5 mW、調制寬度0.05 mT。

1.3.6清除DPPH有機自由基的測試方法

2×10-3mol/L的DPPH溶液，蒸餾水，以上2種試劑各取10 μL注入EP管，混勻后快速裝入石英毛細管中，然后外加樣品保護測試管，一并放入ESR波譜儀的諧振腔中進行測定，作為對照樣品，以扣除試劑本身對自由基的影響。測樣品時用樣品液代替蒸餾水，其余操作同上。每個濃度做3個平行樣，測量后取平均值，結果見圖4。

圖4　DPPH有機氮自由基圖譜Fig.4　Spectrum of organic nitrogen radicals（DPPH）

自由基清除率（%）的計算公式：I=（h0-hx）/h0×100，式中：h0為對照體系中ESR譜信號強度測量值；hx為樣品體系中ESR譜信號強度測量值。由圖4可見，I值越大，清除自由基能力越強（見圖4）。

樣品測試條件為：掃描時間1 min；中心磁場中心磁場336 mT、掃描寬度15 mT、微波功率1 mW、調制寬度0.35 mT。

2　結果與討論

2.1螺旋藻對不同自由基的清除作用

2.1.1螺旋藻對羥自由基的清除效果

螺旋藻對羥自由基的清除效果見圖5。

圖5　不同濃度的測試樣品對羥自由基（·OH）的清除效果圖Fig.5　Scavenging effect of different concentrations of test samples on hydroxyl radical（·OH）

2.1.2螺旋藻對一氧化氮自由基的清除效果

螺旋藻對一氧化氮自由基的清除效果見圖6。

2.1.3螺旋藻對超氧陰離子自由基的清除效果

螺旋藻對超氧陰離子自由基的清除效果見圖7。

圖7　不同濃度的測試樣品對超氧陰離子（·O2-）自由基的清除效果圖Fig.7　Scavenging effect of different concentrations of test samples on Superoxide anion（·O2-）

2.1.4螺旋藻對DPPH有機自由基的清除效果

螺旋藻對DPPH有機自由基的清除效果見圖8。

圖8　不同濃度的測試樣品對DPPH有機氮自由基的清除效果圖Fig.8　Scavenging effect of different concentrations of test samples on organic nitrogen radicals（DPPH）

2.2螺旋藻對不同自由基清除作用的分析

由圖1、圖2、圖3、圖4可以看出，螺旋藻對不同種自由基均表現(xiàn)了較好的清除能力。將螺旋藻對不同自由基的清除率作圖分析，見圖9。

圖9　螺旋藻在不同濃度下對不同自由基的清除率Fig.9　The radical scavenging rate of spiraling in different concentrations

由圖5～圖9可以看出鈍頂螺旋藻不僅對不同自由基有較好的清除作用，而且隨著濃度的增加，清除的效率也在提高。螺旋藻在40 mg/mL時對超氧陰離子自由基的清除作用達到了90%，對DPPH有機自由的清除作用達到了97%。

3　結論

隨著年齡增長，機體內自由基水平呈增長趨勢，但由于機體老化，自由基清除機制卻逐步退化，結果造成體內自由基大量積聚[7]。由此自由基對機體的健康危害日益加重，引發(fā)了多種生理功能的障礙，促進多種老年疾病的發(fā)生發(fā)展，導致機體的衰亡。近年來有大量資料表明這些細胞的衰老、死亡，許多屬于自由基引發(fā)的細胞凋亡[8]。

針對幾種常見的自由基，運用ESR法直接測試螺旋藻的抗氧化能力[9]，也較好地反映螺旋藻對不同自由基的清除能力。進一步說明了鈍頂螺旋藻粉具有降血脂、抗腫瘤[10]、抗病毒、抗輻射、抗凝血、抗氧化及增強機體免疫力等生物活性[11]。

運用ESR（順磁共振）法可以直接對鈍頂螺旋藻粉進行測試，而不需要對其進行烘干、研磨、提取等繁瑣步驟，不會破壞其自身的成分，更能直觀地表現(xiàn)其抗氧化能力。相比其他的紫外分光光度計方法，酶聯(lián)免疫法具有較大優(yōu)勢，減少了處理步驟，避免了鈍頂螺旋藻粉里活性物質的丟失，更能真實地反映其的抗氧化能力。另外該方法快速靈敏，可用于其它食品的研究。另外，國際上已經將抗氧化檢測用于抗衰老保健食品的評價[12]，對保健食品的開發(fā)具有重要的作用與意義。此次研究對于開發(fā)以螺旋藻為原料的保健食品或新藥具有一定指導意義。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.023

收稿日期：2014-07-16

作者簡介：趙淑銳（1983—），女（漢），主管技師，碩士，研究方向：大型儀器分析在食品和藥品中的應用。

Investigation with ESR on the Radical Scavenging Effect of Spirulina in Vitro

ZHAO Shu-rui，ZHENG Mei-qing，WU Ying-ting，XUE Bing
（Medical Experiment and Test Center，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Abstract：Organic nitrogen radicals，hydroxyl radicals（·OH），nitric oxide（NO）radicals，superoxide anion radicals（·O2-）were produced by DPPH，F(xiàn)enton reaction，SNAP，oxidation reaction of xanthine and xanthine oxidase.The antioxidant activities of spirulina in different concentrations were determined by the four radicals scavenging activity using electron paramagnetic resonance（ESR）Technology.The method was simple and easy to observe the results.Experimental results showed that spirulina have strong free radical scavenging capacity.The free radicalscavenging capacitywasincreasedby increasing concentrations.when the concentration in 40 mg/mL，

the scavenging rates of Superoxide anion and organic nitrogen radicals reached more than 90%.

Key words：spirulina；DPPH；hydroxyl（OH）radicals；nitric oxide（NO）radicals；superoxide anion；elec