狗棗獼猴桃多酚的純化工藝研究

左麗麗，王振宇，富校軼，王舒然，*，孫茂成，高永欣（.吉林醫(yī)藥學院公共衛(wèi)生學院，吉林吉林303；.哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱50090）

狗棗獼猴桃多酚的純化工藝研究

左麗麗1，王振宇2，富校軼1，王舒然1，*，孫茂成1，高永欣1
（1.吉林醫(yī)藥學院公共衛(wèi)生學院，吉林吉林132013；2.哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150090）

摘要：以狗棗獼猴桃粗多酚為原料，使用多通道二維色譜分離技術(shù)，在單因素的基礎(chǔ)上采用響應面法對狗棗獼猴桃粗多酚的純化條件進行優(yōu)化并建立回歸模型，得到最佳的純化條件：上樣量為57.27 mL，洗脫液濃度71.71%，洗脫柱體積2.85個。經(jīng)回歸分析表明：回歸方程的R2=0.987 1，預測得到的多酚為11.99 mg/mL。通過驗證在最佳的純化條件下，得到的多酚為11.84 mg/mL，回歸模型的預測值與實測值的相對誤差為1.22%。

關(guān)鍵詞：狗棗獼猴桃多酚；響應面；純化

狗棗獼猴桃為獼猴桃屬獼猴桃科植物，富含多酚、多糖、氨基酸、維生素C等活性成分，具有很高的營養(yǎng)價值[1]。獼猴桃多酚能夠清除大量的活性氧自由基，預防組織器官老化，是一種高效的自由基清除劑，具有很好的抗氧化、抗癌、抑制動脈粥樣硬化、預防衰老、提高機體的免疫力等多種功能[2-4]。通過對狗棗獼猴桃、軟棗獼猴桃和中華獼猴桃成分分析發(fā)現(xiàn)狗棗獼猴桃中多酚含量最高，且具有最高的抗氧化活性[5]，因此開發(fā)獼猴桃多酚具有廣闊的應用前景。但是大量生產(chǎn)高純度的獼猴桃多酚成為制約其市場化的瓶頸。

大孔吸附樹脂是一種高分子聚合物，由于其特殊的空間結(jié)構(gòu)以及穩(wěn)定的理化性質(zhì)，使其對多酚等活性物質(zhì)表現(xiàn)出非常好的吸附特性，廣泛應用于植物活性物質(zhì)的分離和純化[6-7]。但是，傳統(tǒng)的分離技術(shù)具有分離效率低、速度慢、周期時間長等缺點。以狗棗獼猴桃多酚為研究對象，以大孔吸附樹脂為固相介質(zhì)，采用實驗室自主研發(fā)的多通道二維色譜分離設備[8]對其進行純化，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應面法優(yōu)化狗棗獼猴桃多酚純化工藝，為狗棗獼猴桃多酚的開發(fā)提供試驗參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

狗棗獼猴桃野生品種：采自大興安嶺地區(qū)。

1.1.2主要試劑

95%乙醇、沒食子酸標準品、碳酸鈉、福林酚試劑，濃鹽酸、AB-8大孔吸附樹脂。

1.1.3試驗儀器

KQ5200DB型超聲波：昆山市超聲儀器有限公司；H2050R型離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限工公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；721紫外可見分光光度計：天津市普瑞斯儀器有限公司；多通道二維色譜分離設備（哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院生物化工實驗室自制，1個上樣柱，5個色譜柱）。

1.2試驗方法

1.2.1狗棗獼猴桃多酚的提取及含量測定

準確稱取大小均一、成熟度一致的狗棗獼猴桃5 kg，使用60%的乙醇按照參考文獻[9]的方法提取狗棗獼猴桃粗多酚，將提取液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮至一定的體積，分裝后于-20℃保存，并采用Folinciocalteu方法[10]測定其中的多酚含量。

1.2.2AB-8大孔吸附樹脂的預處理

新購買的AB-8大孔吸附樹脂首先使用95%乙醇浸泡24 h，然后使用無水乙醇充分洗滌至加水無白色渾濁出現(xiàn)，之后用蒸餾水反復沖洗直至沒有醇味。用2倍～3倍柱體積的2%～5%的HCl溶液浸泡樹脂4 h～6 h，再次使用蒸餾水反復沖洗直至pH為中性，最后用2倍～3倍柱體積的2%～5%的NaOH溶液浸泡樹脂4 h～6 h，使用蒸餾水反復沖洗直至pH變?yōu)橹行院髠溆肹11]。

1.2.3單因素試驗

根據(jù)預試驗，以上樣量、洗脫液濃度、洗脫柱體積為單因素，進行最佳的單因素范圍選擇。

1.2.4狗棗獼猴桃多酚純化工藝響應面試驗

通過單因素試驗結(jié)果，確定純化狗棗獼猴桃粗多酚最適宜的上樣量、洗脫液濃度和洗脫柱體積的范圍。根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，選取上樣量、洗脫液濃度、洗脫柱體積三個因素三個水平設計響應面[12-13]，獲得多通道二維色譜純化狗棗獼猴桃多酚最佳的洗脫條件。

2　結(jié)果與分析

2.1狗棗獼猴桃多酚含量

以沒食子酸為標準品，繪制標準曲線測定狗棗獼猴桃果實中多酚含量為430.03 mgGAE/100 g鮮果。2.2狗棗獼猴桃多酚純化單因素試驗

2.2.1上樣量對狗棗獼猴桃多酚得率的影響

分別量取濃度為4.3 mg/mL的狗棗獼猴桃粗多酚提取液30、40、50、60 mL進行上樣，吸附2 h后用蒸餾水沖洗上樣柱，以除去其中的雜質(zhì)，再用一定體積的60%乙醇將獼猴桃粗多酚進行分配，直到串聯(lián)的最后一根色譜柱流出液出現(xiàn)顏色變化時立即停止分配。然后啟動并聯(lián)模式，使用60%的乙醇進行洗脫，每個色譜分別收集兩個柱體積的洗脫液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮到一定體積，使用Folin-ciocalteu方法測定其中的多酚含量，計算多酚得率來篩選最佳上樣量。

上樣量與洗脫液中相對多酚含量的相關(guān)性如圖1所示。

圖1　上樣量與洗脫液中相對多酚含量的相關(guān)性Fig.1　Effect of loading volume on polyphenol content in eluant

不同體積的上樣量所獲得的洗脫液中多酚得率隨著上樣體積的增加而逐漸增加，尤其是A、B、C柱洗脫液中多酚含量相對較高，而D、E柱分配的多酚含量較少，因而洗脫液中也顯著的低于A、B、C三柱。上樣量在30 mL～40 mL的范圍內(nèi)隨著體積的增加洗脫液中多酚得率增加較快，繼續(xù)增加上樣量獲得的洗脫液中多酚得率增加相對緩慢，當上樣體積達到50 mL后上樣柱中大孔吸附樹脂對狗棗獼猴桃多酚的吸附能力幾乎達到最大值，表明吸附已經(jīng)達到飽和，此時，A、B、C、D、E柱的洗脫液中多酚得率也達到最大值，繼續(xù)增加上樣量對5個色譜柱洗脫液中多酚得率影響不大，因此選擇50 mL的提取液作為最佳上樣量用于后續(xù)響應面試驗。

2.2.2洗脫液濃度對狗棗獼猴桃多酚得率的影響

在預試驗上樣量對多酚得率影響的基礎(chǔ)上，選定50 mL的狗棗獼猴桃粗多酚提取液進行上樣，通過多通道二維色譜設備進行分離，使用不同濃度的乙醇（20%、40%、60%、80%）進行梯度洗脫，每個色譜柱收集兩個柱體積，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分別濃縮到一定體積，使用Folin-ciocalteu方法測定洗脫液中多酚含量，篩選最佳的洗脫液濃度。

洗脫液乙醇濃度與洗脫液中相對多酚含量的相關(guān)性如圖2所示。

圖2　乙醇濃度與洗脫液中相對多酚含量的相關(guān)性Fig.2　Effect of concentration of ethanol on polyphenol content in eluant

隨著乙醇濃度的不斷增加每個柱子洗脫液中的相對多酚含量也逐漸增加，當洗脫液乙醇濃度在20%～60%范圍時，A、B柱獲得的多酚含量呈線性增加，而C、D、E柱中吸附的多酚含量較少，且得率增加不顯著，當洗脫液乙醇濃度達到60%時5個洗脫柱獲得的多酚含量達到最大值，繼續(xù)提高洗脫液的乙醇濃度對每個洗脫柱的多酚得率沒有顯著增加，可見最佳的洗脫液濃度為60%，用于后續(xù)響應面試驗。

2.2.3洗脫柱體積對狗棗獼猴桃多酚得率的影響

在預試驗上樣量和洗脫液濃度對多酚得率影響的基礎(chǔ)上，選定50 mL的上樣量進行上樣，通過多通道二維色譜進行分離，使用60%的乙醇濃度進行洗脫，每個色譜柱分別收集1、2、3、4個柱體積的洗脫液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮到一定體積，使用Folinciocalteu方法測定多酚含量，獲得最佳的洗脫柱體積。

圖3　洗脫柱體積與洗脫液中多酚含量的相關(guān)性Fig.3　Effect of eluant volume on polyphenol content in eluant

如圖3所示，隨著洗脫柱體積的增加，收集的洗脫液中多酚得率也逐漸增加，當洗脫一個柱體積時A中獲得最高的總酚含量，顯著高于其他B、C、D、E四個柱體積獲得的多酚，且B、C、D、E的多酚得率差異不顯著。隨著洗脫體積的增加B柱的多酚得率顯著增加，而其他四個柱的多酚得率也有所提高，但提高不顯著。當洗脫3倍柱體積時每個柱子中的多酚得率達到最大值，洗脫4倍柱體積時5個洗脫柱的洗脫液中多酚含量不再增加，因此，選擇洗脫3倍的柱體積用于后續(xù)響應面試驗。

2.3響應面法（RSM）優(yōu)化洗脫條件

以上述單因素獲得的最佳洗脫條件為基礎(chǔ)，選擇上樣量、洗脫液濃度、洗脫柱體積三個因素，各取三個水平，通過試驗發(fā)現(xiàn)色譜柱A中多酚吸附率較高，因此以色譜柱A的洗脫液中獲得的多酚含量為評價指標進行響應面優(yōu)化試驗。

2.3.1自變量水平的建立

采用BBD響應面試驗為模型，分別采用上樣量（X1/mL）、洗脫液濃度（X2/%）、洗脫柱體積（X3/個）三因素進行響應面實驗，表1顯示了試驗因素及編碼值。

表1　BBD試驗設計中試驗因素水平及編碼值Table 1　Experimental range and coded level of variables tested with BBD

2.3.2響應面分析試驗方案及結(jié)果

利用試驗設計統(tǒng)計分析軟件Design-Expert進行試驗設計與數(shù)據(jù)分析，通過此軟件設計了17組試驗，然后分別進行試驗，結(jié)果如表2所示，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)求得方程的各項系數(shù)。

表2　BBD響應面優(yōu)化洗脫多酚含量的試驗值試驗設計與結(jié)果Table 2　Box-Behnken design matrix for the experimental values for polyphenol content

將試驗結(jié)果使用Design-Expert 7.0數(shù)理統(tǒng)計軟件進行回歸擬合，可得到響應值Y和各個因子（X1，X2，X3）之間的二次多元回歸方程模型為：

對此回歸模型進行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3　回歸模型方差分析表Table 3　Analysis of variance（ANOVA）for regression equation

由表3方差分析可以看出，F(xiàn)model=15.14，它的值遠遠大于F0.05（9，3）=8.81，而響應面模型的P<0.001，這表明試驗設計模型設計合理，不同因素對洗脫液總酚含量的影響差異顯著；本試驗中失擬項P值0.115 3> 0.05，表明模型的失擬項不顯著，即模型建立成功。

由表3中回歸方程系數(shù)的顯著性結(jié)果表明：RSM模型的一次項X1（P=0.000 1）、X2（P=0.000 1）、X3（P= 0.000 1）和二次項X12（P=0.000 1）、X22（P=0.000 1）、X32（P=0.000 3）以及交互項X1X2（P=0.000 9）系數(shù)達到了極顯著的水平，交互項X1X3（P=0.016 8）的系數(shù)顯著，而交互項X2X3（P=0.138 5）的系數(shù)不顯著。

2.3.3響應面法分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸分析結(jié)果做出相應的曲面圖，觀察上樣量、洗脫液濃度和洗脫柱體積對獲得多酚含量的影響，結(jié)果如圖4（a，b，c）所示。

由圖4可以看出，X1和X2之間交互作用顯著，X2和X3之間交互作用不顯著，X1和X3交互作用顯著。

優(yōu)化后最佳純化狗棗獼猴桃多酚的工藝條件為上樣量57.27 mL，洗脫液濃度71.71%，洗脫柱體積2.85個，在此條件下，響應面預測結(jié)果獲得的總酚含量為11.99 mg/mL。

圖4　RSM模型自變量X1，X2，X3的響應面圖Fig.4　Response surface of X1，X2，X3in RSM model

3　結(jié)論

采用多通道二維色譜技術(shù)，在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應面法研究了上樣量、洗脫液濃度、洗脫柱體積對純化后狗棗獼猴桃多酚濃度的影響。結(jié)果表明：各因素對純化后狗棗獼猴桃多酚濃度的影響大小順序為：洗脫柱體積>上樣量>洗脫液濃度。多通道二維色譜純化狗棗獼猴桃多酚的最佳工藝條件為上樣量57.27 mL，洗脫液濃度71.71%，洗脫柱體積2.85個，在此條件下，響應面預測結(jié)果獲得的總酚含量為11.99 mg/mL，在響應面分析方法優(yōu)化的最佳條件下進行3次平行試驗，得到色譜柱A的洗脫液中總酚含量

為11.84 mg/mL，響應面模型的理論預測值與實際測定值非常接近，相對誤差在1.22%左右，這表明響應面的實際值與回歸方程預測值吻合性良好。與常規(guī)大孔吸附樹脂柱層析相比較，此分離設備具有分離效果好、速度快、操作簡單、處理量大等優(yōu)點[14]，對于純化多酚等活性物質(zhì)的工業(yè)化以及大批量生產(chǎn)具有重要的價值。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.019

收稿日期：2014-09-05

作者簡介：左麗麗（1982—），女（漢），講師，博士，研究方向：天然產(chǎn)物提取與功能分析，食品質(zhì)量與安全。

*通信作者：王舒然（1968—），男（漢），教授，博士生導師。

Optimization of Purification Techniques of the Polyphenol from Actinidia Kolomikta

ZUO Li-li1，WANG Zhen-yu2，F(xiàn)U Xiao-yi1，WANG Shu-ran1，*，SUN Mao-cheng1，GAO Yong-xin1
（1.School of Public Health，Jilin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China；2.School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，Heilongjiang，China）

Abstract：Purification the Actinidia kolomikta crude polyphenol as raw materials by the two-dimensional multichannel chromatographic separation equipment，with the response surface analytical method（RSM），the regressive model through the optimization of main technical parameters of purification Actinidia kolomikta polyphenol by ethanol solution was obtained.The best conditions were as follow：loading quantity of sample 57.27 mL，eluent concentration 71.71%，volume of elution column 2.85.The regressive analysis indicated R2= 0.987 1，the estimating purified polyphenols was 11.99 mg/mL.Through the validating test，under the best purified conditions，the polyphenol was 11.84 mg/mL.The relative error between the estimating data of regressive model and actual data was less than 1.22%.

Key words：Actinidia kolomikta polyphenol；RSM；purification