黑布林皮中原花青素提取工藝的優(yōu)化

龔玉石，何錦霞，郭　娟，侯方麗（廣東藥學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510006）

工藝技術(shù)

黑布林皮中原花青素提取工藝的優(yōu)化

龔玉石，何錦霞，郭娟，侯方麗
（廣東藥學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510006）

摘要：測定了5種薔薇科李屬植物果實(shí)及其各組織中原花青素的相對含量。通過單因素試驗(yàn)分析提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取溶劑、pH與抗氧化劑等因素對原花青素提取率的影響，在此基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)選出原花青素提取的最佳工藝條件。結(jié)果表明：在這5種水果中，黑布林皮中原花青素含量最豐富，按料液比為1∶11（g/mL）的比例加入pH8的60%乙醇溶液于70℃提取50 min，干燥后的黑布林皮中原花青素的提取效率可達(dá)到8.95%。添加0.2%的抗氧化劑亞硫酸氫鈉、抗壞血酸，新鮮黑布林皮中原花青素提取率分別提高了44.58%、15.52%。

關(guān)鍵詞：黑布林皮；原花青素；提取

黑布林，黑李子被列為“五果”之首，含有大量的糖、維生素、礦物質(zhì)、果酸、氨基酸、胡蘿卜素等營養(yǎng)成分。醫(yī)學(xué)界認(rèn)為，黑李子具有去解郁毒，活血生津、消渴引飲，祛痰利尿、潤腸等作用，能治好些疾病[1]。原花青素，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑之一，具有抗腫瘤、保護(hù)心血管、抗炎、抗輻射、預(yù)防高血壓、美容等功能[2-3]，在食品、保健品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

目前，國內(nèi)外研究較多的是從葡萄籽[4-5]、松樹皮[6-7]、藍(lán)莓[8-9]、蘋果[10-11]、蓮科植物[12-15]等原料中提取原花青素，而有關(guān)黑布林原花青素的提取工藝的研究鮮見報(bào)道。在食品加工中，利用黑布林的果肉加工飲料、果酒、蜜餞等時(shí)，必定會(huì)有不少的皮渣廢料產(chǎn)生，若能合理利用，必能減少企業(yè)的成本，而從皮渣中提取原花青素是一種較好的綜合利用途徑。本文比較了5種薔薇科李屬植物果實(shí)及其各組織中原花青素的相對含量，選擇含量最高的黑布林皮作為實(shí)驗(yàn)原料，利用正交分析法優(yōu)化出黑布林皮中原花青素的最佳提取條件，為黑布林皮原花青素的研究和應(yīng)用提供參考，開拓了黑布林皮資源綜合利用的有效途徑。

1　材料與方法

1.1材料和試劑

黑布林：國產(chǎn)，購于廣東省中山市五桂山長命水市場；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品：上海金穗生物科技有限公司；香草醛：天津市福晨化學(xué)試劑廠；硫代硫酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸氫鈉、甲醇、硫酸、乙醇、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2儀器設(shè)備

AEY-220電子分析天平：長沙高新開發(fā)區(qū)湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；V-1200型紫外-可見分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；雷磁PHS-3C型PH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；烘干箱DGX-9053B-2：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-2K8二列八孔智能水浴箱；鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3方法

1.3.1樣品的選擇及確定

樣品制備：將李子、黑布林、紅布林、黃金李和蘋果5種薔薇科李屬植物果實(shí)的果皮、果肉、果核分離，分別取0.2 g，并以料液比1∶10（g/mL）加入甲醇溶液，在55℃條件下提取60 min，過濾，定容至25 mL為樣液，備用。

樣品中原花青素含量的測定（硫酸-香草醛法[16-17]）：采用0.5 mL水代替0.5 mL樣品，加入2.5 mL 30 g/L香草醛甲醇，2.5 mL 30%硫酸甲醇，在30℃下避光反應(yīng)20分鐘，作為空白調(diào)零。取0.5 mL樣液于10 mL刻度試管中，加入2.5 mL 30g/L香草醛甲醇和2.5 mL 30%硫酸甲醇，30℃，避光反應(yīng)20 min后，在500 nm處測定吸光值A(chǔ)1。由于提取液中存在的色素在500 nm處有吸收，因此，0.5 mL樣品水溶液，加入2.5 mL香草醛甲醇，2.5 mL 30%甲醇，同樣條件反應(yīng)后，500 nm測定吸光值A(chǔ)0，以消除樣品本底與顏色帶來的誤差，原花青素的吸光值為A=A1-A0。根據(jù)原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

1.3.2原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

準(zhǔn)確稱取經(jīng)干燥的原花青素對照品5.2 mg（精確至0.000 1 g），用甲醇溶解，并準(zhǔn)確定容至10 mL，制得濃度為0.52 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。再用甲醇稀釋，配制成濃度為0、0.052、0.104、0.164、0.208、0.416、0.520 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列使用液。按照1.3.1中樣品測定的方法，500 nm處測定吸光值。

1.3.3黑布林皮預(yù)處理

取新鮮黑布林皮，于40℃烘箱中烘干，然后用粉碎機(jī)粉碎，裝棕色瓶避光低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4黑布林皮中原花青素的提取工藝優(yōu)化

取一定量的黑布林皮粉末，置于10 mL容量瓶中，加入一定量，一定濃度的乙醇溶液，在一定溫度的水中水浴一定的時(shí)間后，冷卻定容，過濾，濾液備用。

分別考察不同提取劑種類及濃度、提取時(shí)間、提取溫度、pH、料液比、提取次數(shù)、抗氧化劑種類對黑布林皮中原花青素提取率的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比及pH進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，采用極差分析，以確定原花青素的最佳提取工藝條件。

1.3.5原花青素含量的測定

按照1.3.1中樣品測定的方法，500 nm處測定吸光值，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品液中原花青素含量，再換算為原花青素提取率。原花青素提取率（%）按照公式（1）計(jì)算。

式中：X為黑布林皮中原花青素的提取率，%；m為根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品液中原花青素的量，μg；M為用于測定的樣品質(zhì)量，mg；V1為待測樣品溶液的取樣體積，mL；V2為樣品定容的體積，mL；d為樣品溶液稀釋倍數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

以吸光度為縱坐標(biāo)，原花青素含量為橫坐標(biāo)，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1　原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of the proanthocyanidins

其回歸方程：y=2.864 0x+0.002 2，相關(guān)系數(shù)R2= 0.998 0，表明在所測的含量（0.000 mg～0.260 mg）范圍內(nèi)線性相關(guān)良好。

2.2樣品的選擇及確定

李子、黑布林、紅布林、黃金李和蘋果5種薔薇科李屬植物果實(shí)的果皮、果肉、果核中原花青素的含量結(jié)果如圖2。

圖2　不同水果的果皮、果肉、果核中原花青素的含量Fig.2　Proanthocyanidins content of pericarp，pulp and kernel from different fruit

由圖2可知，各種水果其果皮中原花青素的含量較其本身的果肉及果核的原花青素含量要高。李子皮、黑布林皮中的原花青素含量相對其他果皮比較高，本試驗(yàn)選用黑布林皮作為原材料。

2.3黑布林皮中原花青素提取工藝的單因素試驗(yàn)

2.3.1不同提取溶劑種類及濃度對原花青素提取率的影響

取黑布林粉0.1g于10mL容量瓶中，分別以1∶10（g/ mL）的料液比加入不同濃度的甲醇、乙醇以及蒸餾水，在55℃條件下提取60 min，定容，過濾，取0.5 mL提取液測吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原花青素提取率，結(jié)果如圖3所示。

圖3　提取溶劑對原花青素提取率的影響Fig.3　Effect of extraction solvent on the extraction ratio of proanthocyanidins

由圖3可知，60%的乙醇作為溶劑時(shí)，原花青素提取率最高。水為提取劑，原花青素提取率最低。純甲醇的提取效果也很好，但甲醇有一定毒性，與乙醇相比也更容易揮發(fā)損失，所以選取60%的乙醇溶液作為后續(xù)的提取溶劑。

2.3.2提取溫度對原花青素提取率的影響

取0.1g黑布林皮粉于10mL容量瓶中，再按1∶10（g/ mL）的比例加入濃度為60%的乙醇溶液，溫度分別為30、40、50、60、70、80、90℃的情況下，水浴提取60 min，冷卻后定容至刻度線，過濾，取0.5 mL提取液測吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原花青素提取率，結(jié)果如圖4所示。

圖4　提取溫度對原花青素提取率的影響Fig.4　Effect of extraction temperature on the extraction ratio of proanthocyanidins

由圖4可知，隨著溫度的增加，原花青素提取率呈現(xiàn)上升后又稍下降的趨勢，其中在提取溫度為50℃時(shí)，原花青素提取率最高。溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加劇，原花青素的溶解度也加快，同時(shí)高溫可引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化，使原花青素更容易溶出，但當(dāng)溫度過高時(shí)，由于原花青素?zé)岱€(wěn)定性差，結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致提取率降低。

2.3.3料液比對原花青素提取率的影響

取0.1g黑布林皮粉于10 mL容量瓶中，再按料液比分別為1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14（g/mL）的比例加入濃度為60%的乙醇溶液，50℃水浴加熱，水浴提取60 min，冷卻后定容至刻度線，過濾，取0.5 mL提取液測吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原花青素提取率，結(jié)果如圖5所示。

圖5　料液比對原花青素提取率的影響Fig.5　Effect of material-liquid ratio on the extraction ratio of proanthocyanidins

由圖5可知，隨著料液比的增加，原花青素提取率呈現(xiàn)上升的趨勢，在料液比為1∶11（g/mL）的時(shí)候達(dá)到最高，料液比繼續(xù)增加，原花青素提取率逐漸下降。2.3.4提取時(shí)間對原花青素提取率的影響

取0.1 g黑布林皮粉于10 mL容量瓶中，再按1∶11（g/mL）的比例加入濃度為60%的乙醇溶液，50℃水浴加熱，分別提取20、30、40、50、60、70、80 min，冷卻后定容至刻度線，過濾，取0.5mL提取液測吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原花青素提取率，結(jié)果如圖6所示。

圖6　提取時(shí)間對原花青素提取率的影響Fig.6　Effect of extraction time on the extraction ratio of proanthocyanidins

由圖6可知，隨著提取時(shí)間的延長原花青素提取率先升高后降低，當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)原花青素提取率達(dá)到最高?？赡苁且?yàn)樘崛r(shí)間太長，原花青素有效結(jié)構(gòu)被破壞。

2.3.5提取次數(shù)對原花青素提取率的影響

取0.1g黑布林皮粉于10mL容量瓶中，再按1∶11（g/ mL）的比例加入濃度為60%的乙醇溶液，50℃水浴加熱提取60 min，冷卻，定容，過濾，濾液為第1次提取液。將濾渣轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用相同的條件進(jìn)行第2、3、4次提取，分別得到第2次、第3次、第4次提取液，每次提取液各取0.5 mL測吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原花青素提取率，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，對黑布林皮原花青素進(jìn)行第1次提取時(shí)，提取率略占總提取率的86%以上，第2次、第3次、第4次分別占11%、1.8%、0.7%，說明在進(jìn)行第1次和第2次提取時(shí)絕大部分的原花青素已經(jīng)從黑布林皮中溶出，而第3次及第4次僅有極少量的原花青素可被提取，所以本試驗(yàn)提取2次即可。

2.3.6pH對原花青素提取率的影響

取0.1 g黑布林皮粉于10 mL容量瓶中，按1∶11 （g/mL）的比例加入濃度為60%的乙醇溶液，60%的乙醇分別用pH為4、5、6、7、8、9、10、11緩沖溶液配制，再50℃水浴加熱提取60 min，冷卻，定容，過濾，取0.5 mL測吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原花青素提取率，結(jié)果如圖8所示。

圖7　提取次數(shù)對原花青素提取率的影響Fig.7　Effect of extraction times on the extraction ratio of proanthocyanidins

圖8　pH對原花青素提取率的影響Fig.8　Effect of pH value on the extraction ratio of proanthocyanidins

由圖8可知，pH對原花青素提取率影響不大，pH大于10時(shí)，原花青素提取率下降?？赡苁且?yàn)樵ㄇ嗨夭环€(wěn)定，易氧化分解，長時(shí)間加熱及強(qiáng)堿處理可破壞其有效結(jié)構(gòu)，造成原花青素的大量損失。

2.3.7抗氧化劑對原花青素提取的影響

取0.1 g黑布林皮粉或者磨碎的新鮮黑布林皮于10 mL容量瓶中，按1∶11（g/mL）的比例分別加入60%的乙醇溶液，再分別添加0.2%的抗氧化劑抗壞血酸、檸檬酸、硫代硫酸鈉、亞硫酸氫鈉，混勻，50℃水浴加熱提取60 min，冷卻，定容，過濾，取0.5 mL測吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原花青素提取率，結(jié)果如圖9所示。

圖9　抗氧化劑對原花青素提取率的影響Fig.9　Effect of antioxidant on the extraction ratio of proanthocyanidins

由圖9可知，對于干燥后的黑布林皮，添加抗氧化劑后原花青素的提取率均低于沒有添加抗氧化劑組，可能是因?yàn)樘砑涌寡趸瘎┖罂寡趸瘎┡c水-乙醇分子結(jié)合，使原花青素與水-乙醇的結(jié)合機(jī)會(huì)降低，因此降低了原花青素的提取率。而對于新鮮的黑布林皮，抗壞血酸與亞硫酸氫鈉的添加能提高原花青素的提取率，分別提高了15.52%與44.58%，提示，從新鮮的黑布林皮中提取原花青素時(shí)可以添加一定劑量的抗氧化劑亞硫酸氫鈉或抗壞血酸。

2.4黑布林皮中原花青素提取工藝的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比及pH進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，采用極差分析，以確定原花青素的最佳提取工藝。

1）固定條件：提取劑為60%乙醇溶液，提取1次，避光進(jìn)行顯色反應(yīng)，不添加抗氧化劑。

2）試驗(yàn)因素及水平選擇見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1　因素水平表Table 1　The factor level

表2　正交試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2　Design and results of orthogonal test

由表2可知，對60%乙醇提取效果影響最為顯著的為因子D，其次為因子A和因子B，因子C對提取效果影響較不顯著，根據(jù)K值大小，提取的最佳條件是A3B2C2D3，即提取溫度為70℃，提取時(shí)間為50 min，提取的料液比為1∶11（g/mL），pH為8。由于最優(yōu)組合不在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，需要對最佳工藝條件做驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)得到最佳工藝條件的原花青素提取效率為8.95%，結(jié)果顯示最優(yōu)組合A3B2C2D3的原花青素提取效率高于正交試驗(yàn)中的任何一個(gè)組合。

3　結(jié)論

1）李子、黑布林、紅布林、黃金李和蘋果5種薔薇科李屬植物果實(shí)的果皮、果肉、果核相比較，黑布林皮中的原花青素含量最高，所以本試驗(yàn)選擇黑布林皮為原材料。

2）優(yōu)化得出干燥后的黑布林皮中原花青素提取的最佳工藝條件為：按料液比為1∶11（g/mL）的比例加入pH為8的60%乙醇溶液，于70℃水浴提取50 min，原花青素提取率可達(dá)8.95%。

3）從新鮮的黑布林皮中提取原花青素時(shí)，添加0.2%的抗氧化劑亞硫酸氫鈉、抗壞血酸，分別使原花青素提取率提高44.58%、15.52%。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sha Li,Gui-Fang Deng,Xi Cai,et al.Ultrasound-assisted extraction of natural antioxidants from black plum stone[J].International Journal of Modern Chemistry,2013,4(3):155-166

[2]Keqin Ou,Liwei Gu.Absorption and metabolism of proanthocyanidins[J].Journal of Functional Foods,2014,7(3):43-53

[3]張妍,吳秀香.原花青素研究進(jìn)展[J].中藥藥理與臨床,2011,27 (6):112-116

[4]Esen Eyiler Yilmaz,Emin Burcin ?zvural,Halil Vural.Extraction and identification of proanthocyanidins from grape seed(Vitis Vinifera)using supercritical carbon dioxide[J].The Journal of Supercritical Fluids,2011,55(3):924-928

[5]肖麗霞,何志貴,朱勇,等.葡萄籽中原花青素提取工藝[J].食品科學(xué),2011,32(20):89-94

[6]Holly A.Weber,Aandrew E.Hodges,Jill R.Guthrie,et al.Comparison of proanthocyanidins in commercial antioxidants:grape seed and pine bark extracts[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007,55(1):148-156

[7]崔曉霞,張小麗,羅書勤,等.落葉松樹皮原花青素提取工藝的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2012,24(1):27-130

[8]Barbara M.Schmidta,John W.Erdman Jrb,Mary Ann Lila.Differential effects of blueberry proanthocyanidins on androgen sensitive and insensitive human prostate cancer cell lines[J].Cancer Letters, 2006,231(2):240-246

[9]戰(zhàn)偉偉,司振軍,王超萍,等.藍(lán)莓葉原花青素提取工藝研究[J].糧食與油脂,2010(6):39-42

[10]戚向陽,黃紅霞,巴文廣.蘋果中原花青素提取工藝的研究[J].食品工業(yè)科技,2003,24(3):63-65

[11]李昊.大孔樹脂D113吸附分離蘋果原花青素的研究[J].中國藥師,2014,17(7):1131-1134

[12]梁華正,劉成佐,唐伯辰,等.太空蓮葉原花青素的提取及分離純化[J].食品科技,2014,39(1):198-203

[13]張曉玲,周蕓,熊小鳳,等.荷葉中荷葉堿及原花青素提取工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2012,33(23):295-298

[14]Ling Z Q,Xie B J,Yang E N.Isolation,Characterization and Determination of Antioxidative Activity of Oligomeric Procyanidins from the Seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn[J].Agric Food Chem,2005, 53(7):2441-2445

[15]汪志慧,孫智達(dá),謝筆鈞.響應(yīng)曲面法優(yōu)化雙酶法提取蓮房原花青素[J].食品科學(xué),2011,32(4):64-68

[16]孫蕓等.硫酸-香草醛法測定葡萄籽原花青素含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(9):43-46

[17]樊金玲,套管均,朱文學(xué).香草醛/硫酸比色法測定兩種原花青素含量的比較[J].食品科學(xué),2007,28(9):467-472

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.014

收稿日期：2015-02-05

作者簡介：龔玉石（1980—），女（漢），講師，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)與功能性食品。

Study on Optimization of Extraction of Proanthocyanidins from Black Plum Peel

GONG Yu-shi，HE Jin-xia，GUO Juan，HOU Fang-li
（School of Food Science，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

Abstract：Concentration of proanthocyanidins in different organizations of five rosaceae plants of the genusli fruit was determined..Through single factor experiment，the influences of extraction temperature，extraction time，solid-liquid ratio，extraction solvent，pH and antioxidants on extraction ratio of proanthocyanidins from black brinpeelwerestudied.Basedonsingleextractingyield，aL9（34）orthogonalexperimentwascarriedouttodetermine the optimal extraction condition of proanthocyanidins.The results suggested that black brin peel had the most abundant proanthocyanidins among the five fruits and the optimum extraction conditions were determined as60% ethanolofpH8，solid-liquidratio1∶11（g/mL），70℃and50min.Themaximumyieldofproanthocyanidins indried blackplumpeelwas8.95%.Adding0.2%antioxidantssuchassodiumbisulfiteorascorbicacid，extractionratioof proanthocyanidinsfromfreshblackbrinpeelincreasedby44.58%and15.52%，respectively.

Key words：black plum peel；proanthocyanidins；extraction