丙戊酸鈉參與脊髓水平疼痛－瘙癢調(diào)控的研究

高　潔，魯顯福，，陳家驊，張勵才，劉　鶴

丙戊酸鈉參與脊髓水平疼痛－瘙癢調(diào)控的研究

高潔1，魯顯福1，2，陳家驊3，張勵才2，劉鶴2

摘要目的探討丙戊酸鈉（VPA）對小鼠坐骨神經(jīng)分支高選擇結(jié)扎切斷（SNI）引起的神經(jīng)病理性疼痛與氯喹誘發(fā)的急性瘙癢的影響。方法實驗一：將昆明種雄性小鼠48只隨機分為6組：神經(jīng)病理性疼痛組（SNI）、假手術(shù)組（Sham）、瘙癢組（CQ）、瘙癢溶媒組（NS）、疼痛瘙癢組（SQ）及空白對照組（CON）；CON、SNI、Sham、SQ組在術(shù)前1 d，術(shù)后1、3、5、7、9、10 d測定左后足機械痛閾值（MWT），CON、CQ、NS、SQ組分別于右后足足底注射氯喹或生理鹽水后觀察小鼠舔足時間。實驗二：昆明種雄性小鼠16只隨機分為SQ-V組和SQ-N組。SNI模型分別于術(shù)后5、6、7、8、9 d早晚8時注射VPA（SQ-V組）及VPA溶媒生理鹽水（SQ-N組）后測定疼痛行為學(xué)，于術(shù)后第10天注射氯喹后觀察瘙癢行為學(xué)。行為檢測結(jié)束后使用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）法檢測脊髓L4-L6部位組蛋白去乙?；?（HDAC2）的表達。結(jié)果SNI組及SQ組在術(shù)后1 d MWT降低（P＜0．05），第5天仍在較低水平。SQ-V組較SQ-N組鞘注后MWT顯著升高（P＜0．05）。CQ組較NS組舔足時間顯著延長，SQ組舔足時間明顯低于CQ組（P＜0．05）。SQ-V組舔足時間顯著高于SQ-N組（P＜0．05）。RT-PCR結(jié)果提示SNI引起HDAC2表達上調(diào)，CQ引起HDAC2表達下調(diào)。結(jié)論疼痛能夠抑制瘙癢神經(jīng)信號傳導(dǎo)，脊髓水平HDAC2差異性表達介導(dǎo)疼痛－瘙癢的共同調(diào)節(jié)。

關(guān)鍵詞脊髓；丙戊酸鈉；神經(jīng)病理性疼痛；瘙癢；氯喹

疼痛與瘙癢是軀體對內(nèi)源性或外源性刺激產(chǎn)生的兩種不同的軀體感覺，雖然二者之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及神經(jīng)環(huán)路仍然沒有明確的定論，但疼痛抑制瘙癢，疼痛的緩解可能引起瘙癢的觀點已被廣泛接受［1］?，F(xiàn)臨床上廣泛使用的組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑，可通過減少HDAC的表達抑制組蛋白的去乙?；l(fā)揮內(nèi)源性鎮(zhèn)痛作用［2］。本課題組的前期研究（待發(fā)表）顯示非特異性HDAC抑制劑丙戊酸鈉（sodium valproate，VPA）抑制脊髓水平HDAC2的表達，雖可顯著緩解神經(jīng)損傷引起的痛覺過敏，但同時會引起劇烈的瘙癢行為學(xué)表現(xiàn)。該研究基于疼痛與瘙癢之間的關(guān)系，探討VPA是否也通過HDAC2調(diào)控脊髓水平瘙癢感覺，進而參與脊髓水平疼痛－瘙癢的共同調(diào)節(jié)，以期為臨床合理用藥提供有價值的指導(dǎo)意見。

1　材料與方法

1．1實驗動物

成年SPF級昆明種小鼠，雄性，重20～25 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)于（24±1）℃和12 h光照／12 h黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食攝水。

1．2試劑與主要儀器

注射用VPA［賽諾菲（杭州）制藥有限公司，批號：A2270／2CA45］；水合氯醛、生理鹽水（上海制藥廠）；氯喹（美國Sigma-Aldrich公司）；反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）試劑盒（美國Invitrogen公司）；Electron Von Frey（美國IITC公司）；視頻記錄儀（日本Olympus公司）；羅氏Light Cycler 480熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）。

1．3方法

1．3．1實驗分組

實驗一：將昆明種雄性小鼠48只隨機分為6組：神經(jīng)病理性疼痛組（SNI組）、假手術(shù)組（Sham組）、瘙癢組（CQ組）、瘙癢溶媒組（NS組）、疼痛瘙癢組（SQ組）及空白對照組（CON組）；CON、SNI、Sham、SQ組在術(shù)前1 d、術(shù)后1、3、5、7、9、10 d測定左后足機械縮足閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT），CON、CQ、NS、SQ組分別注射氯喹或生理鹽水后觀察小鼠舔舐右后足的時間。實驗二：昆明種雄性小鼠16只隨機分為SQ-V組和SQ-N組。SNI模型分別于術(shù)后5、6、7、8、9 d早晚8時注射VPA（SQ-V組）及VPA溶媒生理鹽水（SQ-N組）2次后測定疼痛行為學(xué)，于術(shù)后第10天測定MWT后注射氯喹，觀察瘙癢行為學(xué)表現(xiàn)。

1．3．2建立SNI動物模型［3］

成年昆明種小鼠經(jīng)

2015－06－29接收

2江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，徐州221004

1．3．3鞘內(nèi)注射的操作方法［2］

左掌壓住鼠身，拇中二指按壓骼骨兩側(cè)固定，食指按在雙側(cè)骸骨前緣連線正中點皮膚上（可觸知L5棘突）指示進針位點，右手持10μl微量進樣器與脊柱上方約成20°角于L5-L6間隙進針，針尖進入一側(cè)棘突、橫突間組織后減10°角左右緩慢推進，以鼠尾出現(xiàn)突然側(cè)向運運為成功標(biāo)志（可能系觸及相應(yīng)運動神經(jīng)所致），按5 mg／kg［4］劑量注射容積5μl VPA或VPA溶媒生理鹽水，時間約5 s，然后緩慢拔出。注意進針深度約4 mm，針頭斜面向下，針尖觸及椎骨有抵擋感。

1．3．4MWT的測定［5］

用Electron Von Fery測定小鼠的MWT。將小鼠置于透明的有機玻璃箱中，底為0．5 cm×0．5 cm孔徑的鐵絲網(wǎng)，待小鼠在有機玻璃箱中適應(yīng)30min后，Electron Von Frey Rigid tip垂直正確安置在測定架上，空載條件下調(diào)零。刺激小鼠左側(cè)足底，即時讀數(shù)至抬腿或主動縮足，觀察最大折力數(shù)據(jù)（用g表示），以此作為機械刺激疼痛敏感指標(biāo)之一。每組動物每個時間點連續(xù)測5次取平均值。觀察并記錄各組間及組內(nèi)的MWT差異。

1．3．5舔足時間［6］的檢測

使用視頻記錄儀記錄小鼠的舔足時間，即小鼠用舌頭舔舐右后肢踝關(guān)節(jié)以下部位的總時間（用s表示）。將小鼠先放置于有機玻璃箱中適應(yīng)30 min，隨后在小鼠右側(cè)足底皮內(nèi)注射200μg／10μl氯喹或10μl氯喹溶媒，立即放回玻璃箱中，并打開視頻記錄儀記錄注射后30 min內(nèi)的舔足時間，記錄期間實驗操作人員離開實驗操作間。實驗結(jié)束后，回放視頻計算小鼠舔足時間。

1．3．6RT-PCR法檢測

取各組小鼠脊髓L4－L6部位，液氮研磨，TRIzol提取總RNA后M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。采用Light Cycler 480 SYBR Green IMaster試劑檢測小鼠脊髓L4－L6部位HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8基因的相對表達量，實驗獨立重復(fù)3次。

表1　引物序列

1．4統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graph PAD Prism 5．0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并生成統(tǒng)計圖表。計量資料以±s表示。多組比較采用One-Way ANOVA，兩兩比較采用Student′s t檢驗，機械縮足閾值采用Two-Way ANOVA（時間為組內(nèi)因素，處理為組間因素）分析，RT-PCR結(jié)果采用秩和檢驗進行比較。

2　結(jié)果

2.1SNI對疼痛行為學(xué)的影響

SNI小鼠術(shù)后1 d 起MWT較CON組小鼠MWT明顯降低（F＝109．56，P＜0．05），至第5天后仍處于較低水平，見圖1。

2.2正常及SNI小鼠對氯喹或NS的反應(yīng)

CQ組小鼠舔足時間較NS組舔足時間顯著延長，SQ組舔足時間明顯低于CQ組（F＝205．64，P＜0．05）。SQ-V組舔足時間顯著高于SQ-N組（F＝209．58，P ＜0．05），見圖2。

2.3VPA對于SNI小鼠疼痛－瘙癢行為的影響

連續(xù)5 d鞘內(nèi)注射VPA可以顯著緩解SNI引起的MWT下降（F＝110．78，P＜0．05），但會引起小鼠舔足時間的明顯延長（F＝209．78，P＜0．05），見圖3、4。

2.4HDAC2在疼痛以及瘙癢條件下的表達

RTPCR結(jié)果提示HDAC2在神經(jīng)病理性疼痛條件下表達明顯上調(diào)（Z＝4．532 7，P＜0．05），而在瘙癢條件下，HDAC2表達明顯下調(diào)（Z＝5．074 3，P＜0．05），見圖5。

3　討論

本課題組前期研究（待發(fā)表）僅偶然觀察到VPA在緩解神經(jīng)損傷引起的疼痛的同時會引起劇烈瘙癢，該研究在此基礎(chǔ)上，進一步在分子水平上證實HDAC2也同時參與脊髓水平瘙癢感覺的調(diào)節(jié)，進而可以明確HDAC2參與脊髓水平疼痛－瘙癢的共同調(diào)節(jié)。

SNI模型具有機械痛敏產(chǎn)生早、個體差異性小、持續(xù)時間長，術(shù)后可出現(xiàn)顯著的機械痛覺異常，保留腓腸神經(jīng)、不影響小鼠日?；顒拥葍?yōu)點，便于精確衡量鎮(zhèn)痛藥物引起的神經(jīng)病理性疼痛的行為學(xué)表型變化。瘙癢模型獨創(chuàng)性的建立在與疼痛模型相同的脊髓節(jié)段，減少了傳統(tǒng)的頸背部注射氯喹誘導(dǎo)瘙癢模型［1］的混雜因素，可以更好的解釋相同節(jié)段脊神經(jīng)的交互支配作用。

HDAC分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4大類，I類包括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8；Ⅱ 類包括HDAC4、HDAC5、 HDAC6、HDAC7、 HDAC9、HDAC10；Ⅲ類包括Sirt1～Sirt7；Ⅳ類包括HDAC11。Liang et al［7］已經(jīng)證實HDAC2表達的上調(diào)參與脊髓水平痛覺過敏的形成。RT-PCR實驗中，本課題組重點關(guān)注Ⅰ類HDAC，選取Ⅰ類HDAC進行RT-PCR實驗，研究顯示Ⅰ類HDAC中僅HDAC2在疼痛模型中表達顯著上調(diào)，在瘙癢模型中表達顯著下調(diào)，證實了課題組的前期推測。

Liu et al［8］最早證明瘙癢的發(fā)生與脊髓水平的μ阿片受體（μopioid receptor，MOR）有關(guān)，并同時發(fā)現(xiàn)了與瘙癢相關(guān)的特異性受體胃泌素受體釋放肽（GRPR）。深入研究后顯示MOR存在不同的受體亞型，并發(fā)現(xiàn)疼痛的調(diào)節(jié)與MOR1亞型有關(guān)，瘙癢與MOR1D亞型有關(guān)，MOR1D通過與GRPR形成異二聚體而引起強烈的瘙癢感覺。

阿片受體是與痛覺過敏相關(guān)的經(jīng)典受體，筆者推測，脊髓水平HDAC2的差異性表達可引起脊髓水平不同亞型阿片受體的差異性表達，即MOR1表達下調(diào)引起疼痛的減輕；MOR1D表達上調(diào)，使得MOR1D-GRPR異二聚體增多進而誘發(fā)瘙癢感覺的產(chǎn)生，但確切機制還有待進一步研究。

綜上所述，通過外源性使用非特異性HDAC抑制劑VPA干預(yù)SNI引起的神經(jīng)病理性疼痛，顯示VPA在緩解神經(jīng)病理性疼痛時會引起瘙癢，提示HDAC2參與脊髓水平疼痛－瘙癢的共同調(diào)節(jié)，但詳細機制有待進一步研究。

參考文獻

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［8］Liu X Y，Liu ZC，Sun YG，etal．Unidirectional cross-activation of GRPR by MOR1D uncouples itch and analgesia induced by opioids［J］．Cell，2011，147（2）：447－58．

中圖分類號R 394；R 361；R 745；R 961

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1418－05

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（編號：81100813、81300957）；江蘇省教育廳高校省級重點實驗室開放課題（編號：KJS1101）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1麻醉科、3疼痛科，合肥230022

作者簡介：高潔，男，碩士研究生；魯顯福，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lxf001＠126．com；陳家驊，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：Chenjiahua001＠sina．com10%的水合氯醛麻醉后，切開左后肢側(cè)面皮膚，鈍性分離股二頭肌，暴露坐骨神經(jīng)及其3個分支（脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)和腓腸神經(jīng)），分別雙重結(jié)扎脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，在雙重結(jié)扎中央切斷，并分別去除末端2～4 mm的神經(jīng)干，術(shù)中避免直接接觸或者牽拉腓腸神經(jīng)，保持其完整性。術(shù)后分層縫合傷口，抗生素抗炎處理。Sham組則只暴露坐骨神經(jīng)及其分支而不切斷。其余處理方式同手術(shù)組。

Sodium valproate involves in regulation of pain and itching in spinal cord

Gao Jie1，Lu Xianfu1，2，Chen Jiahua3，et al
（1Dept of Anesthesiology，3Dept of Pain，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230022；2Jiangsu Key Laboratory of Anesthesiology，Xuzhou221004）

AbstractObjectiveTo investigate the impactof VPA on pain behavior induced by SNIand itch behavior evoked by chloroquine．MethodsExperiment 1：forty-eightmale KM mice were random ly divided into SNIgroup，Sham group，CQ group，NS group，pain，SQ group and CON group．Pain threshold（MWT）of the left hindpaw was measured 1 day before and 1，3，5，7，9，10 day after operation in CON，SNI，Sham and SQ group．The licking time was observed after chloroquine or saline injection into the plantar surface of the right hindpaw in CON，CQ，NS and SQ group．Experiment two：sixteen male KM mice were random ly divided into SQ-V group and SQ-N group．Pain behaviors weremeasured after injection of VPA（SQ-V）and vehicle（SQ-N）at8 AM and 8 PM on 5，6，7，8，9 day after SNIoperation．Itching behaviorwas observed after injection of chloroquine on the 10th day after SNIoperation．The expression of histone deacetylase 2（HDAC2）in spinal L4-L6 was detected by RT-PCR after behavior testing．ResultsMWT following SNI was significantly lower（P＜0．05）1 day postoperation and reached the peak on the 5th day postoperation in SNI group and SQ group．MWT was significantly higher（P＜0．05）after intrathecal injection in SQ-V group than in SQ-N group．Licking time was significantly longer in CQ group than in NS group，and licking time was significantly shorter in SQ group than in CQ group（P＜0．05）．Licking time was significantly longer in SQ-V group than in SQ-N group（P＜0．05）．The results of RT-PCR indi-cated that the expression of HDAC2 was upregulated after SNIand downregulated after CQ injection．Conclusion Pain can suppress the transmitting of itching signal，and differential expression of HDAC2 contributes to co-regulation of pain and itching in spinal cord．

Key wordsspinal cord；sodium valproate；neuropathic pain；itch；chloroquine