黑曲霉發(fā)酵過程中菌體形態(tài)的分析方法建立及應(yīng)用

唐文俊，夏建業(yè)，儲(chǔ)炬，莊英萍，張嗣良

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黑曲霉發(fā)酵過程中菌體形態(tài)的分析方法建立及應(yīng)用

唐文俊，夏建業(yè)，儲(chǔ)炬，莊英萍，張嗣良

華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

唐文俊, 夏建業(yè), 儲(chǔ)炬, 等. 黑曲霉發(fā)酵過程中菌體形態(tài)的分析方法建立及應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(2): 291–299.Tang WJ, Xia JY, Chu J, et al. Development and application of morphological analysis method in Aspergillus niger fermentation. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 291–299.

絲狀真菌 (Filamentous fungi) 的發(fā)酵生產(chǎn)通常具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，但其菌體形態(tài)是一個(gè)區(qū)別于其他非絲狀菌的一個(gè)重要發(fā)酵指標(biāo)。針對目前形態(tài)分析的瓶頸，本研究使用瓊脂糖凝膠對黑曲霉菌形進(jìn)行固定，利用平板實(shí)現(xiàn)菌球樣本的大量制備，并結(jié)合圖形處理軟件自建自動(dòng)化處理程序，實(shí)現(xiàn)了大量準(zhǔn)確可靠的菌體形態(tài)參數(shù)的獲得，大大增加了形態(tài)數(shù)據(jù)處理通量及準(zhǔn)確度。應(yīng)用該方法于黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)糖化酶過程中不同供氧水平及剪切水平下菌體形態(tài)的研究，通過大量形態(tài)數(shù)據(jù)定量闡明了黑曲霉在不同剪切水平下的分區(qū)域形態(tài)分布特性，為進(jìn)一步工業(yè)過程的形態(tài)優(yōu)化提供了重要的研究方法。

黑曲霉，菌體形態(tài)，圖形分析，形態(tài)控制

絲狀真菌 (Filamentous fungi) 是一類被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生物過程的微生物，其中黑曲霉由于具有較高的代謝活性及產(chǎn)物分泌能力而成為一個(gè)典型，被應(yīng)用于各種內(nèi)源及外源產(chǎn)物的生產(chǎn)，例如有機(jī)酸、酶、抗體等的生產(chǎn)[1]。

然而，絲狀真菌的液體培養(yǎng)往往伴隨著高度非牛頓特性以及菌體形態(tài)的變化，其中菌體形態(tài)的變化不僅僅較難檢測及控制，并且其變化會(huì)伴隨著發(fā)酵液流變特性、傳質(zhì)特性及混合特性的變化[2]。通常來說，絲狀真菌的形態(tài)可以分為分散菌絲 (Dispersed mycelia)、聚集成簇 (Clumps)、成團(tuán)結(jié)球 (Dense pellets) 三類[3]。對于不同的黑曲霉發(fā)酵最終產(chǎn)物，往往有著不同的最佳菌體形態(tài)。例如，對于發(fā)酵生產(chǎn)糖化酶 (Glucoamylase)，通常認(rèn)為菌球是最優(yōu)的過程形態(tài)，而對于檸檬酸的發(fā)酵生產(chǎn)則更多地偏向菌絲形態(tài)[4-5]。

對于菌體形態(tài)的控制往往也是發(fā)酵過程中的一個(gè)難點(diǎn)。目前有文獻(xiàn)報(bào)道的影響菌體形態(tài)的因素包括接種量、接種方式、培養(yǎng)基組分、溶氧水平、環(huán)境pH、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、發(fā)酵罐規(guī)模、發(fā)酵罐形式、攪拌形式與功率輸入等[3,6-11]。與其他離線參數(shù)不同，形態(tài)參數(shù)由于其特殊性，需要有大量的數(shù)據(jù)支撐才能獲得較為合理可信的結(jié)果。然而，菌形數(shù)據(jù)的獲取往往需要跨學(xué)科的圖形分析技術(shù)，加之樣品制備的困難，最終導(dǎo)致了菌形數(shù)據(jù)差異性較大、相對偏差較大，難以進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析[12]。

為了解決菌形數(shù)據(jù)獲取的困難與菌形數(shù)據(jù)重要性的矛盾，本文就絲狀真菌發(fā)酵過程中的菌體形態(tài)建立了大樣本的樣品制備方法和自動(dòng)圖形分析方法，大大增加圖形分析的效率以及數(shù)據(jù)可信度。本文應(yīng)用該方法對黑曲霉在不同攪拌水平與耗氧水平下的形態(tài)分布進(jìn)行了研究，為今后菌體形態(tài)的研究提供了技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 菌株

本文使用作為研究菌株。

1.2 培養(yǎng)基組分

固體培養(yǎng)基：固體土豆培養(yǎng)基 (CM0139，Oxoid，UK)

發(fā)酵培養(yǎng)基：45.1 g/L 一水葡萄糖，10 g/L 麥芽糖糊精，0.1 g/L CaCl2·2H2O，1.0 g/L MgSO4·7H2O，2 g/L檸檬酸，3 g/L (NH4)2SO4，3 g/L KH2PO4，1.5 g/L NaH2PO4·H2O，0.04 g/L MnSO4·H2O，0.02 g/L ZnCl2，0.015 g/L CuSO4·5H2O，0.015 g/L CoCl2·6H2O，0.3 g/L FeSO4·7H2O。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：同發(fā)酵培養(yǎng)基，其中一水葡萄糖濃度增加為163.9 g/L。

1.3 主要儀器及軟件

5 L高級生物反應(yīng)器 (上海國強(qiáng)生化工程技術(shù)有限公司)，AE2000倒置顯微鏡 (Motic)，5DMarkII數(shù)碼單反相機(jī) (Canon)，Image-Pro Plus v6.0 (Media Cybernetics)。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

使用固體土豆培養(yǎng)基富集孢子。孢子使用滅菌超純水洗入無菌搖瓶，使用血球計(jì)數(shù)板技術(shù)。最終接種濃度為105個(gè)/mL。

反應(yīng)器發(fā)酵采用平行發(fā)酵，對于不同耗氧水平研究固定轉(zhuǎn)速為400 r/min，分別通入含氧氣20%、40%、60%的富氧空氣；對于不同轉(zhuǎn)速進(jìn)行考察，固定轉(zhuǎn)速分別為300 r/min、450 r/min、500 r/min和600 r/min。發(fā)酵周期均為144 h。

1.5 菌絲觀察

選取與菌球分離的菌絲樣品，稀釋后使用乳酸酚棉蘭染劑進(jìn)行染色，染色后直接觀察。

1.6 自動(dòng)菌球形態(tài)分析方法的建立

1.6.1 取樣與形態(tài)固定化

固定劑由40% (/) 甲醛與60% (/) 乙醇組成，取1 mL固定劑并與樣品1∶1體積混合后于4 ℃保存。固定劑中的甲醛及乙醇成分可以滅活菌體，停止胞內(nèi)的代謝反應(yīng)。避免由于菌體繼續(xù)生長或死亡自溶而對形態(tài)分析結(jié)果產(chǎn)生影響[13]。

1.6.2 樣品分離、洗滌與稀釋

取一定量樣品，稀釋至10 mL。靜置5 min使菌球與菌絲結(jié)構(gòu)分離。小心吸取上部菌絲樣品，重新加入去離子水多次洗滌。重復(fù)4?5次后可獲得較為純凈菌球樣品。最終定容體積5 mL。

1.6.3 菌球拍攝

將菌球與菌絲樣品分別小心倒至一次性平皿中。配置20 mL 0.5% (/) 瓊脂糖凝膠溶液，加熱至溶液呈完全透明。將瓊脂糖凝膠倒入菌球與菌絲樣品中，覆蓋全部平板并立即將其混合均勻。靜置于室溫中直至完全凝固。由于瓊脂糖凝膠凝結(jié)后呈淺白色，因此凝膠層不宜太厚，以覆蓋平板為準(zhǔn)。

對于菌球樣品，首先使用數(shù)碼相機(jī)對整個(gè)平皿進(jìn)行拍攝，用于菌球濃度計(jì)算。其后使用倒置顯微鏡對單個(gè)固定的菌球進(jìn)行拍攝，用于菌球結(jié)構(gòu)分析。

對于菌絲樣品，則使用倒置顯微鏡對菌絲團(tuán)進(jìn)行拍攝，用于菌絲結(jié)構(gòu)分析。

1.6.4 自動(dòng)化圖形分析與數(shù)據(jù)輸出

本文的圖形分析及數(shù)據(jù)輸出全部使用Image Pro Plus v6.0 (Media Cybernetics, Singapore) 軟件。

菌球濃度統(tǒng)計(jì)：利用標(biāo)尺預(yù)先確定拍攝照片的像素點(diǎn)與實(shí)際長度比例。調(diào)用“Contrast enhancement”手動(dòng)調(diào)節(jié)對比度，增加菌球與背景的差異性。隨后調(diào)用“Segmentation”，選擇“HIS”方式。通過調(diào)整合適的亮度閾值進(jìn)行二值化，使菌球與背景分別呈全白色與全黑色。最后利用“Count/Size”工具統(tǒng)計(jì)后得到菌球直徑 (Marco-D) 以及菌球個(gè)數(shù) (N)。

菌球結(jié)構(gòu)分析：利用顯微測微尺預(yù)先確定拍攝照片的像素點(diǎn)與實(shí)際長度比例。利用“Best fit equalization”對全圖進(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化。在“Segmentation”中選擇HSI設(shè)置合適的亮度閾值進(jìn)行二值化，將識(shí)別對象標(biāo)記為白色，背景標(biāo)記為黑色。最后同樣利用“Count/Size”設(shè)置所需參數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。通常的統(tǒng)計(jì)參數(shù)包括菌球直徑 (Micro-D)、菌球核心直徑 (Core-D)、菌球投影面積 (A)、圓形度 (R) 等。

Image Pro-Plus軟件可以將過程中所有的操作記錄為函數(shù)進(jìn)行調(diào)用，函數(shù)語法為Basic。在確定圖形處理過程中參數(shù)值后，可以利用函數(shù)編輯分析所用函數(shù)，形成宏代碼，并嵌套于循環(huán)中可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)連續(xù)的圖形處理及數(shù)據(jù)輸出。循環(huán)部分的代碼如下：

Dim numDocs As Integer

Dim i As Integer

ret= IpDocGet (GETNUMDOC,0,numDocs)

For i=0 To numDocs-1

......

Next i

1.6.5 形態(tài)參數(shù)定義

不同形態(tài)參數(shù)的定義包括于表1與表2內(nèi)。這里歸納的參數(shù)大都為直接參數(shù)，即可以直接由Image Pro Plus給出。其中Filamentous Length (Fl) 與Filamentous Ratio (Fr) 是衡量菌球結(jié)構(gòu)主要的參數(shù)，與菌球的比表接觸面積及產(chǎn)物產(chǎn)量直接關(guān)聯(lián)。而Growth Rate (G) 則可以用于表述菌絲的生長活性，表征了絲狀真菌在反應(yīng)器內(nèi)的老化程度。

表1 常規(guī)菌球形態(tài)參數(shù)

表2 常規(guī)菌絲形態(tài)參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 方法比較

傳統(tǒng)的菌形觀察方式較為簡易，主要流程包括：1) 取樣后稀釋；2) 選取單個(gè)菌球于載玻片；3) 烘烤定型；4) 顯微觀察并拍攝。

其中可能包括的問題有：1) 沒有滅活步驟，樣品會(huì)因?yàn)槌掷m(xù)的代謝反應(yīng)發(fā)生形態(tài)變化；2) 針對單個(gè)菌球進(jìn)行操作，可能由于操作原因造成菌球結(jié)構(gòu)被改變或破壞；3) 較為極端的定型方式 (烘烤)，會(huì)導(dǎo)致菌絲及菌球結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；4) 單個(gè)載玻片上可以準(zhǔn)備的樣品量有限，對于單個(gè)取樣點(diǎn)需要花費(fèi)較長的時(shí)間處理。其中1)和4) 可以通過取樣后立即測定及花費(fèi)更多精力得以克服，但2) 和3) 會(huì)對整個(gè)菌形分析結(jié)果產(chǎn)生不可逆的影響。

如圖1所示，傳統(tǒng)烘烤方法制作的菌球樣品，其菌絲結(jié)構(gòu)因烘烤而收縮卷曲，失去了原有的形態(tài)特征。同時(shí)，相較于瓊脂糖固定法，烘烤法得到的菌球結(jié)構(gòu)干癟，已經(jīng)無法得到其原有的菌球半徑，只能以變形后的圓半徑作為近似值。從圖2中可以看出，對于同一條件下的菌球樣本，烘烤法獲得的菌球直徑略大于瓊脂糖固定法，這可能就是由于采用圓半徑而非球半徑而產(chǎn)生的誤差。

對于一個(gè)菌球樣本來說，由于在其發(fā)酵過程中菌球的直徑分布并不均一，因此需要有足夠的樣本點(diǎn)來獲取可信的菌球結(jié)構(gòu)信息。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)僅以5或10個(gè)菌球?yàn)閰⒖紩r(shí)，其半徑分布范圍較大 (在圖中表現(xiàn)為較大的誤差線)，而在獲取50及更多菌球樣本后可以發(fā)現(xiàn)其統(tǒng)計(jì)值已經(jīng)逐漸穩(wěn)定。因此，對于一個(gè)取樣點(diǎn)，需要至少50個(gè)菌球樣本以獲取該點(diǎn)的平均菌球結(jié)構(gòu)信息。

本文建立的瓊脂糖凝膠固定法，相比傳統(tǒng)的烘烤法不僅通過對整個(gè)樣品進(jìn)行統(tǒng)一操作，固定立體菌球結(jié)構(gòu)，解決了傳統(tǒng)烘烤法中存在的問題，同時(shí)可以一次性制備200甚至更多的菌球樣本，大大地降低了在樣品制備及預(yù)處理過程中所花費(fèi)的時(shí)間及人力。加之自動(dòng)化圖形分析的應(yīng)用，使得整個(gè)圖形分析的通量大大增加，從而使得菌球形態(tài)的分析更為高效、準(zhǔn)確。

圖1 不同預(yù)處理方法下微觀菌球結(jié)構(gòu)對比

圖2 不同預(yù)處理方法及菌球測定次數(shù)對于菌形定量數(shù)據(jù)的影響(實(shí)心：烘烤法，空心：瓊脂糖固定法)

2.2 菌形分析實(shí)例1：不同耗氧條件下黑曲霉形態(tài)變化

在5 L攪拌式生物反應(yīng)器中，控制攪拌速率恒定，調(diào)節(jié)進(jìn)氣中不同氧氣比例[14-16]可以嚴(yán)格地考察供氧對于菌球形態(tài)的影響。不同的菌體形態(tài)會(huì)顯著地影響發(fā)酵液流變特性，影響罐體的混合及傳氧特性[17-19]。

每個(gè)供氧水平選取100個(gè)以上菌球進(jìn)行定量圖形分析，獲取菌球核心半徑與菌球外菌絲長度，結(jié)果如圖3所示，其中的誤差線代表菌球半徑及外圍菌絲長度的分布范圍。可以看出，菌球在不同供氧條件下其核心平均半徑均為90 μm左右，其外圍的菌絲長度也較為一致，為125 μm左右。這是由于在較大的菌球中，處于核心部分的菌體會(huì)由于缺乏足夠的氧氣及底物而發(fā)生菌體自溶，使菌球分散為數(shù)個(gè)較小的菌球。有文獻(xiàn)報(bào)道氧氣在菌球中傳遞的臨界長度為50?75 μm[20]，這與我們觀測到的平均半徑相一致。

測定不同供氧水平下的糖化酶酶活，發(fā)現(xiàn)最終的效價(jià)隨供氧的增加而增加，說明糖化酶的合成在此階段受到供氧的限制。作為一種典型的分泌型酶，糖化酶的合成需要大量的ATP用于合成氨基酸、肽鍵及蛋白折疊。這可能是不同供氧條件下糖化酶產(chǎn)量差異的主要原因。但是通過計(jì)算糖化酶相對底物及氧氣的得率，發(fā)現(xiàn)其并沒有明顯區(qū)別。

最終結(jié)果表明，不同供氧水平下黑曲霉形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化，其產(chǎn)酶效率并沒有明顯提高。

圖3 不同供氧水平下菌球半徑與菌球外菌絲長度分布

2.3 菌形分析實(shí)例2：不同轉(zhuǎn)速條件下黑曲霉形態(tài)變化

從不同供氧條件下黑曲霉形態(tài)變化的結(jié)果中我們可以知道，供氧水平對于菌體形態(tài)的影響非常有限。因此，忽略攪拌過程中的不同供氧水平，設(shè)計(jì)不同的攪拌強(qiáng)度來模擬不同的剪切環(huán)境下菌球形態(tài)的分布情況。

圖4表現(xiàn)了在相同接種條件但攪拌水平不同的情況下黑曲霉菌球形態(tài)的分布。通過對大量菌球樣本進(jìn)行定量分析，可以看到其分布與攪拌轉(zhuǎn)速相關(guān)的明顯區(qū)域性分布，菌球核心半徑與菌球外菌絲比例均隨剪切水平的增加而明顯降低。在最低的剪切強(qiáng)度下，菌球半徑的分布較為分散 (表現(xiàn)為較大的誤差線)，最大的菌球核心半徑達(dá)到300 μm，并且其菌球外菌絲長度在150?250 μm之間。在逐步增加轉(zhuǎn)速的過程中，可以發(fā)現(xiàn)菌球的半徑及外圍菌絲長度分布趨于集中。在600 r/min時(shí)，其平均外圍菌絲長度僅為75 μm，菌球半徑普遍小于100 μm。造成這一形態(tài)分布特征的主要原因是絲狀真菌的菌球直徑與流場中形成的小渦在長度尺度上相一致[21]，因此小渦的剪切作用在絲狀真菌上體現(xiàn)得更為明顯。而更小的細(xì)菌或者酵母則不易受到小渦的影響。

將產(chǎn)酶期不同時(shí)間點(diǎn)黑曲霉的菌體形態(tài)相比較 (圖5)，可以發(fā)現(xiàn)其菌球半徑有一個(gè)明顯的生長過程，但外圍的菌絲長度卻沒有發(fā)生變化。由于其核心半徑的增加，外圍菌絲的比表接觸面積也相應(yīng)增加，理論上有利于糖化酶的合成與分泌。然而，發(fā)酵中后期的菌絲出現(xiàn)明顯的老化，表現(xiàn)為組成菌球的菌絲結(jié)構(gòu)變細(xì)、不易染色 (圖6)，此時(shí)單位菌體的酶合成能力明顯降低。因此，對于菌形的分析不能僅僅局限于對于圖形數(shù)據(jù)的理解，同時(shí)還需要考慮菌體作為細(xì)胞的生長特性，才能實(shí)現(xiàn)真正的發(fā)酵優(yōu)化及放大[22-23]。最終最佳控制轉(zhuǎn)速為450 r/min，總產(chǎn)量比最低的300 r/min批次提高了65.66%。在最優(yōu)的菌球形態(tài)下底物得率提高了37.53%，在96 h達(dá)到最高比產(chǎn)物形成速率。

圖4 不同剪切水平下黑曲霉菌球半徑與菌球外菌絲長度分布

圖5 450 r/min轉(zhuǎn)速下不同階段菌球半徑與菌球外菌絲長度分布

圖6 不同發(fā)酵周期菌絲形態(tài)對比

3 討論

菌球形態(tài)數(shù)據(jù)的收集及處理是目前形態(tài)學(xué)研究的一個(gè)重點(diǎn)，在發(fā)酵過程中獲取大量且準(zhǔn)確的絲狀真菌的菌體形態(tài)數(shù)據(jù)是實(shí)現(xiàn)形態(tài)控制及發(fā)酵液流變特性控制的一個(gè)前提條件[6-7,24-25]。本文建立的瓊脂糖凝膠固定法實(shí)現(xiàn)了對于立體菌球結(jié)構(gòu)的固定，相較于原始的載玻片法不僅僅減小了樣品處理過程中所引入的誤差，大大增加了樣品處理的通量，結(jié)合自建的圖形分析程序，使得短時(shí)間內(nèi)獲取真實(shí)可靠的形態(tài)分布數(shù)據(jù)成為可能。

通過大量形態(tài)數(shù)據(jù)的分析，我們發(fā)現(xiàn)在黑曲霉產(chǎn)糖化酶的發(fā)酵過程中，其形態(tài)主要受到攪拌帶來的剪切輸入的影響。過低的剪切會(huì)使得菌球的直徑分布過于分散、形態(tài)不一，增加了生物過程的不均一性。剪切的逐步增加一方面縮小了菌球直徑的分布范圍，另一方面也減小了菌球外菌絲的長度。通過控制其剪切水平在一個(gè)合理的范圍內(nèi)可以確保絲狀真菌形成大小及比表接觸面積都較為合適的菌球結(jié)構(gòu)。今后的研究將以此為基礎(chǔ)，探明在工業(yè)規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)過程中不均一的剪切分布流場對于黑曲霉發(fā)酵形態(tài)的影響，結(jié)合CFD模型優(yōu)化工業(yè)規(guī)模發(fā)酵過程。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

Development and application of morphological analysis method infermentation

Wenjun Tang, Jianye Xia, Ju Chu, Yingping Zhuang, and Siliang Zhang

State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

Filamentous fungi are widely used in industrial fermentation. Particular fungal morphology acts as a critical index for a successful fermentation. To break the bottleneck of morphological analysis, we have developed a reliable method for fungal morphological analysis. By this method, we can prepare hundreds of pellet samples simultaneously and obtain quantitative morphological information at large scale quickly. This method can largely increase the accuracy and reliability of morphological analysis result. Based on that, the studies ofmorphology under different oxygen supply conditions and shear rate conditions were carried out. As a result, the morphological responding patterns ofmorphology to these conditions were quantitatively demonstrated, which laid a solid foundation for the further scale-up.

, fungal morphology, image analysis, process control

April 22, 2014; Accepted:July 4, 2014

Ju Chu. Tel: +86-21-62453021; E-mail: juchu@ecust.edu.cn

Supported by:Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education (No. 20110074110015).

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(No. 20110074110015) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-08-20

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140240.html