絮凝基因FLO1及FLO1c高表達(dá)提高工業(yè)釀酒酵母乙酸耐受性及發(fā)酵性能

杜昭勵(lì)，程艷飛，朱卉，何秀萍，張博潤(rùn)

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絮凝基因及高表達(dá)提高工業(yè)釀酒酵母乙酸耐受性及發(fā)酵性能

杜昭勵(lì)1,2，程艷飛1，朱卉1,2，何秀萍1，張博潤(rùn)1

1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)科學(xué)院微生物生理與代謝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

杜昭勵(lì), 程艷飛, 朱卉, 等. 絮凝基因FLO1及FLO1c高表達(dá)提高工業(yè)釀酒酵母乙酸耐受性及發(fā)酵性能. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(2): 231–241.Du ZL, ChengYF, Zhu H, et al. Improvement of acetic acid tolerance and fermentation performance of industrial Saccharomyces cerevisiae by overexpression of flocculent gene FLO1 and FLO1c. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 23 1–241.

乙酸是生物質(zhì)乙醇發(fā)酵過(guò)程中酵母細(xì)胞面臨的重要抑制劑之一，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及發(fā)酵性能有強(qiáng)烈的抑制作用。增強(qiáng)酵母菌對(duì)乙酸脅迫的耐受性對(duì)提高乙醇產(chǎn)率具有重要意義。用分別帶有完整絮凝基因及其重復(fù)序列單元C發(fā)生缺失的衍生基因的重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化非絮凝型工業(yè)釀酒酵母CE6，獲得絮凝型重組酵母菌株6-AF1和6-AF1c。同時(shí)以空載體pYCPGA1轉(zhuǎn)化CE6的菌株CE6-V為對(duì)照菌株。與CE6-V相比，絮凝酵母明顯提高了對(duì)乙酸脅迫的耐受性。在0.6% (/) 乙酸脅迫下，6-AF1和6-AF1c的乙醇產(chǎn)率分別為對(duì)照菌株CE6-V的1.56倍和1.62倍；在1.0% (/) 乙酸脅迫下，6-AF1和6-AF1c的乙醇產(chǎn)率分別為對(duì)照菌株CE6-V的1.21倍和1.78倍?？梢?jiàn)絮凝能力改造能明顯提高工業(yè)釀酒酵母的乙酸脅迫耐受性及發(fā)酵性能，而且內(nèi)重復(fù)序列單元C缺失具有更加明顯的效果。

工業(yè)釀酒酵母，絮凝基因乙酸脅迫耐受性，發(fā)酵性能

隨著資源、能源和環(huán)境問(wèn)題的日益呈現(xiàn)，以生物質(zhì)為原料通過(guò)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)能源產(chǎn)品及高值化學(xué)品受到高度關(guān)注[1]。作為生物技術(shù)領(lǐng)域非常重要的微生物之一，酵母菌在生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用一直是相關(guān)領(lǐng)域關(guān)注的熱 點(diǎn)[2-3]。在生物質(zhì)原料預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的弱酸類、醛類和酚類等抑制物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝具有抑制作用。其中弱酸類化合物中的乙酸含量最高。乙酸由木質(zhì)纖維素預(yù)處理過(guò)程中半纖維素脫乙酰作用生成，終濃度大約在1–10 g/L[4-5]。當(dāng)培養(yǎng)基的pH值低于乙酸的解離常數(shù)(pKa 4.76) 時(shí)，分子態(tài)的乙酸可通過(guò)自由擴(kuò)散或水甘油通道蛋白Fps1p以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ady2p和Jen1p轉(zhuǎn)運(yùn)入酵母細(xì)胞內(nèi)[6-7]，從而導(dǎo)致胞內(nèi)環(huán)境酸化及乙酸根陰離子的積累，嚴(yán)重抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。因此增強(qiáng)酵母菌的乙酸脅迫耐受性對(duì)提高底物利用率和產(chǎn)物產(chǎn)率具有重要意義[8-9]。

酵母菌絮凝是指酵母細(xì)胞之間相互聚集形成絮狀或顆粒狀細(xì)胞團(tuán)，并迅速沉降到發(fā)酵液底部的一種生理特性,絮凝的發(fā)生是一種無(wú)性的、鈣依賴的、可逆的過(guò)程。良好的絮凝特性有利于工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中酵母細(xì)胞和發(fā)酵液的有效分離，因此對(duì)簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品品質(zhì)具有重要意義[10-13]。絮凝的發(fā)生依賴于絮凝蛋白與鄰近細(xì)胞表面寡聚甘露糖鏈間的結(jié)合，是釀酒酵母中典型的絮凝蛋白編碼基因，含有大量銜接重復(fù)序列，根據(jù)其編碼氨基酸序列的一致性，這些重復(fù)序列可以劃分為A、B、C和D 4個(gè)重復(fù)單元[14]。重復(fù)序列是基因內(nèi)高度活躍的成分，通過(guò)驅(qū)動(dòng)基因內(nèi)或基因間的滑移和重組，改變基因內(nèi)重復(fù)序列的數(shù)量或排列方式，從而影響絮凝蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[14-15]。分別缺失內(nèi)部重復(fù)序列單元B、C、D提高了絮凝蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定性，使酵母細(xì)胞絮凝特性表現(xiàn)出對(duì)環(huán)境酸堿變化的廣泛適應(yīng)性[16-17]。經(jīng)乙醇脅迫、兩性霉素B或過(guò)氧化氫處理后，絮凝酵母的細(xì)胞存活率是非絮凝酵母的2–100倍[18]，表明絮凝也可能是細(xì)胞抵抗有害環(huán)境的一種保護(hù)機(jī)制。絮凝是否能賦予酵母菌對(duì)其他環(huán)境脅迫的耐受性，以及重復(fù)序列變化引發(fā)的絮凝特性變化是否影響酵母菌應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的能力目前還不清楚。本研究將完整基因與內(nèi)重復(fù)單元C缺失的衍生基因在工業(yè)釀酒酵母中進(jìn)行表達(dá)，分析比較其對(duì)工業(yè)釀酒酵母脅迫耐受性及發(fā)酵性能的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

本研究所用菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。

表1 本研究所用菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌保存和培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基[19]，篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子用含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基；酵母菌常規(guī)培養(yǎng)用YPD培養(yǎng)基[20]，篩選釀酒酵母轉(zhuǎn)化子用含500 μg/mL G418的YPD培養(yǎng)基，比較不同乙酸濃度下細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，將YPD培養(yǎng)基pH調(diào)到4.5；發(fā)酵培養(yǎng)基為EFM培養(yǎng)基(100 g/L葡萄糖，6 g/L酵母粉，10 g/L蛋白胨，5 g/L尿素，1 g/L磷酸二氫鉀，15 g/L硫酸鎂，0.55 g/L無(wú)水氯化鈣)。

1.2 主要試劑和工具酶

高保真DNA聚合酶KOD及三磷酸脫氧核苷酸混合物(dNTPs) 購(gòu)自TOYOBO公司，T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，DNA marker購(gòu)自全式金公司，DNA膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司，酵母菌質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Bio-tek公司，氨芐青霉素購(gòu)自華北制藥股份有限公司，G418購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 DNA操作和序列分析

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備、轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒DNA的提取參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行。酵母菌基因組 DNA提取及完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行。使用OMEGA酵母質(zhì)粒提取試劑盒(Bio-tek, 美國(guó)) 提取酵母菌質(zhì)粒。絮凝基因表達(dá)水平分析參照文獻(xiàn)[21]進(jìn)行。引物合成、序列測(cè)定由Invitrogen公司完成。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

本研究所用引物序列見(jiàn)表2，以質(zhì)粒pFA6a- KanMX6 為模板，利用引物Kan-F和Kan-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約1.5 kb的，經(jīng)Ⅰ和Ⅰ酶切后的插入到載體YCp50上，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pYCPG。以釀酒酵母YS59的基因組為模板，利用引物ADH-F和ADH-R克隆啟動(dòng)子序列，經(jīng)RⅠ和HⅠ酶切后，插入到質(zhì)粒pYCPG獲得重組質(zhì)粒pYCPGA1。分別以質(zhì)粒pYCF1和pYCF1c為模板，利用引物FLO1-F和FLO1-R分別克隆到完整及其衍生基因的編碼序列和終止子序列，將其連接到載體pYCPGA1的HⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)之間，分別獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pYGAF1和pYGAF1c。

表2 本文所用引物

aRestriction sites are underlined.

1.5 酵母菌絮凝能力測(cè)定

絮凝能力的常規(guī)測(cè)定參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行，所用非絮凝緩沖液為50 mmol/L乙酸鈉 (pH 4.5)，絮凝緩沖液為含6.8 mmol/L氯化鈣的 50 mmol/L乙酸鈉(pH 4.5)。測(cè)定乙酸對(duì)酵母菌絮凝影響時(shí)，在菌懸液中分別添加不同濃度乙酸。

1.6 酵母菌脅迫耐受性分析

活化后的酵母菌接種于2 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h，離心收集細(xì)胞，經(jīng)無(wú)菌水洗滌兩次后，細(xì)胞重懸于2 mL無(wú)菌水中，并進(jìn)行梯度稀釋，室溫下靜置2 h。將5 μL稀釋度分別為10–2–10–5的菌懸液接種于含不同濃度乙酸、乙醇或糠醛的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)2 d，記錄各菌株生長(zhǎng)情況。

參照文獻(xiàn)[22]分析比較各菌株在液體培養(yǎng)基中的乙酸脅迫耐受性。將活化后的酵母菌接種于50 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h，以初始接種600為0.15的接種量分別轉(zhuǎn)接到50 mL含有不同濃度乙酸的YPD培養(yǎng)基(pH 4.5) 中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定細(xì)胞干重，繪制生長(zhǎng)曲線。分別取對(duì)數(shù)早期、中期和后期的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以(AM/AW)/(BM/BW) 的比值表示不同菌株的乙酸脅迫耐受性，其中AM是重組菌株在乙酸脅迫條件下的細(xì)胞干重，AW是對(duì)照菌株在乙酸脅迫條件下的細(xì)胞干重，BM是重組菌株在無(wú)乙酸脅迫時(shí)的細(xì)胞干重，而B(niǎo)W是對(duì)照菌株在無(wú)乙酸脅迫時(shí)的細(xì)胞干重。

1.7 酵母菌發(fā)酵性能分析

將活化后的酵母菌接種于50 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h，以初始接種600為1.0的接種量分別轉(zhuǎn)接到100 mL含有0，0.6%，0.8%或1.0% (/) 乙酸的EFM培養(yǎng)基(pH 4.5) 中。添加乙酸后，培養(yǎng)基pH明顯降低，具體為3.70 (0.6%乙酸)、3.61 (0.8%乙酸) 和3.56 (1.0%乙酸)。30 ℃、150 r/min培養(yǎng)6 h后，進(jìn)行厭氧發(fā)酵，定時(shí)取樣檢測(cè)各項(xiàng)發(fā)酵性能指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次每個(gè)條件設(shè)3個(gè)重復(fù)。細(xì)胞生物量、發(fā)酵液中葡萄糖和乙醇含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 絮凝基因在工業(yè)釀酒酵母中的表達(dá)

分別用空載體pYCPG、帶有完整絮凝基因及重復(fù)序列單元C缺失衍生基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pYGAF1和pYGAF1c轉(zhuǎn)化工業(yè)釀酒酵母CE6，在含500 μg/mL G418的YPD培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行G418抗性比較、絮凝能力目測(cè)、酵母菌質(zhì)粒提取和PCR分析，以及絮凝基因表達(dá)水平分析，獲得具有相同G418抗性和絮凝基因、表達(dá)水平的重組菌株6-AF1和6-AF1c各6株，以及3株帶有空載體的對(duì)照菌株CE6-V。

絮凝能力分析結(jié)果表明，宿主菌CE6及空載體轉(zhuǎn)化菌株CE6-V均沒(méi)有表現(xiàn)出絮凝特性，而重組菌株6-AF1和6-AF1c均表現(xiàn)出明顯的絮凝特性，絮凝能力約為酵母菌株YS59的1.5倍(圖1)。檢測(cè)的6株6-AF1之間絮凝能力沒(méi)有明顯差異，6株6-AF1c之間絮凝能力也沒(méi)有明顯差異。其中表達(dá)內(nèi)重復(fù)序列單元C完全缺失的衍生基因的工業(yè)釀酒酵母6-AF1c的絮凝能力是表達(dá)完整絮凝基因的工業(yè)釀酒酵母6-AF1絮凝能力的96.4%。與和在實(shí)驗(yàn)室單倍體酵母菌株中表達(dá)的結(jié)果基本一致[17]。

圖1 不同酵母菌株絮凝能力比較

2.2 絮凝基因表達(dá)對(duì)酵母菌脅迫耐受性影響

在含不同濃度乙醇、糠醛及乙酸的YPD固體培養(yǎng)基上比較不同酵母菌株的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)在乙醇和糠醛脅迫條件下，對(duì)照菌株CE6-V與重組菌株6-AF1和6-AF1c之間沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)差異，但表達(dá)絮凝基因的工業(yè)釀酒酵母在乙酸脅迫條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)明顯優(yōu)于對(duì)照菌株(圖2)。檢測(cè)的所有6-AF1和6-AF1c菌株均表現(xiàn)出對(duì)乙酸脅迫的耐受性。表明絮凝基因的表達(dá)對(duì)工業(yè)釀酒酵母CE6的乙醇和糠醛脅迫耐受性沒(méi)有明顯影響，但提高了酵母菌應(yīng)對(duì)乙酸脅迫的耐受性。

進(jìn)一步在含不同濃度乙酸的YPD液體培養(yǎng)基中比較不同酵母菌株的生長(zhǎng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.6%–1.0% (/) 乙酸脅迫下，重組菌株6-AF1和6-AF1c的乙酸脅迫耐受性分別是對(duì)照菌株的1.3–2.5倍和1.5–2.9倍(圖3)，說(shuō)明通過(guò)表達(dá)絮凝基因賦予工業(yè)釀酒酵母絮凝特性可以明顯提高酵母菌應(yīng)對(duì)乙酸脅迫的耐受性，而且絮凝基因內(nèi)重復(fù)序列單元C缺失使工業(yè)釀酒酵母表現(xiàn)出更高的乙酸脅迫耐受性。

2.3 乙酸脅迫下的發(fā)酵性能比較

乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在無(wú)乙酸脅迫條件下，對(duì)照菌株CE6-V與重組菌株6-AF1和6-AF1c表現(xiàn)出非常相似的發(fā)酵性能，發(fā)酵12 h 后葡萄糖消耗完，乙醇濃度在15 h達(dá)到最高(圖4A)。在乙酸脅迫條件下，對(duì)照菌株和重組菌株的細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)酵速率均受到明顯抑制，但絮凝型的重組菌株表現(xiàn)出了更高的乙醇產(chǎn)率。在0.6% (/) 乙酸脅迫條件下(pH 3.70)，酵母菌株CE6-V、6-AF1和6-AF1c的乙醇產(chǎn)率分別為1.6，2.5和2.6 g/(L·h) (圖4B)；當(dāng)乙酸濃度為0.8% (/) 時(shí)(pH 3.61)，酵母菌株CE6-V、6-AF1和6-AF1c乙醇產(chǎn)率分別為0.9，1.2 和2.5 g/(L·h) (圖4C)；乙酸濃度增加到1.0% (/) 時(shí)(pH 3.56)，對(duì)照菌株CE6-V、重組菌株6-AF1和6-AF1c的乙醇產(chǎn)量分別在100 h、70 h和60 h時(shí)達(dá)最高值，其中6-AF1和6-AF1c的乙醇產(chǎn)率分別是對(duì)照菌株CE6-V的1.21倍和1.78倍 (圖4D)。在所有實(shí)驗(yàn)條件下，帶有空載體的對(duì)照菌株CE6-V表現(xiàn)出與宿主菌CE6相同的發(fā)酵性能。檢測(cè)的所有6-AF1 菌株之間或6-AF1c菌株之間發(fā)酵性能沒(méi)有明顯差異。添加乙酸使發(fā)酵培養(yǎng)基的pH有所降低，增強(qiáng)了乙酸的細(xì)胞毒性。在乙酸毒性增加的條件下，絮凝型重組菌株6-AF1和6-AF1c表現(xiàn)出明顯優(yōu)于對(duì)照菌株的發(fā)酵性能?？梢?jiàn)絮凝基因的表達(dá)可以明顯提高工業(yè)釀酒酵母的乙酸脅迫耐受性，縮短乙酸脅迫條件下的發(fā)酵周期；特別是內(nèi)重復(fù)序列單元C缺失后使這種效果更加明顯，使酵母菌株在乙酸脅迫條件下表現(xiàn)出更高的乙醇生產(chǎn)速率。

圖2 空載體轉(zhuǎn)化菌株CE6-V及絮凝型重組酵母菌6-AF1和6-AF1c在不同脅迫條件下的生長(zhǎng)情況

發(fā)酵結(jié)束后收集酵母細(xì)胞，檢測(cè)各酵母菌株的絮凝能力(圖5)。宿主菌CE6及空載體轉(zhuǎn)化菌株CE6-V沒(méi)有表現(xiàn)出絮凝特性，6-AF1和6-AF1c均表現(xiàn)出明顯的絮凝特性。在無(wú)乙酸脅迫條件下發(fā)酵結(jié)束后，6-AF1和6-AF1c的絮凝能力是在常規(guī)YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞絮凝能力的1.4倍。一方面發(fā)酵液中較高濃度乙醇可能增強(qiáng)以p為啟動(dòng)子的絮凝基因的表達(dá)，另一方面發(fā)酵后期酵母細(xì)胞表面特性 (細(xì)胞壁構(gòu)象、細(xì)胞表面電荷及疏水性等)發(fā)生不同于常規(guī)YPD培養(yǎng)的變化，從而影響細(xì)胞之間相互作用的強(qiáng)度[24]。在乙酸脅迫條件下發(fā)酵結(jié)束后，酵母細(xì)胞的絮凝能力明顯降低；而且與菌株6-AF1c相比，乙酸對(duì)菌株6-AF1的絮凝表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用。一方面乙酸可能影響絮凝基因的表達(dá)，另一方面乙酸影響絮凝蛋白的構(gòu)象。將無(wú)乙酸脅迫條件下發(fā)酵結(jié)束收集到的6-AF1和6-AF1c細(xì)胞重新懸浮于含不同濃度乙酸的絮凝緩沖液中，測(cè)定絮凝能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度乙酸對(duì)絮凝能力的影響與相應(yīng)乙酸濃度下發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌株的絮凝能力變化趨勢(shì)基本一致。說(shuō)明不同乙酸脅迫下絮凝能力的變化可能主要來(lái)源于乙酸對(duì)絮凝蛋白功能的影響。而且與完整的絮凝蛋白Flo1相比，F(xiàn)lo1c在乙酸脅迫壓力下的空間構(gòu)象更穩(wěn)定。這使得在高濃度乙酸脅迫條件下，6-AF1c表現(xiàn)出了比6-AF1更高的絮凝能力，這可能是菌株6-AF1c在乙酸脅迫條件下具有更高乙醇生產(chǎn)速率的重要原因。

圖5 不同酵母菌株乙酸脅迫發(fā)酵結(jié)束時(shí)絮凝能力比較

3 討論

酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中常常面臨多種環(huán)境脅迫，嚴(yán)重地制約著發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)效率。增強(qiáng)發(fā)酵菌種的工業(yè)環(huán)境適應(yīng)性和魯棒性對(duì)提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本具有重要意義。絮凝，作為細(xì)胞之間粘附的一種方式，不僅是工業(yè)發(fā)酵過(guò)程提供細(xì)胞分離及產(chǎn)品澄清的有效方法，同時(shí)也是細(xì)胞應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的一種保護(hù)機(jī)制。一方面通過(guò)絮凝形成細(xì)胞團(tuán)，外層細(xì)胞可以為內(nèi)層細(xì)胞提供保護(hù)屏障，另一方面絮凝過(guò)程的發(fā)生可能激發(fā)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的重構(gòu)，從而產(chǎn)生對(duì)外環(huán)境的適應(yīng)性。Smukalla等的研究發(fā)現(xiàn)絮凝可以使酵母細(xì)胞在乙醇?jí)毫ο碌募?xì)胞存活率提高2倍[18]。在本研究中，絮凝型重組菌株及其非絮凝原始菌株在乙醇脅迫下的細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的差異，這種與Smukalla等的研究結(jié)果的不一致性可能與宿主菌的遺傳背景有關(guān)[18]。然而，本研究首次發(fā)現(xiàn)在工業(yè)釀酒酵母中表達(dá)絮凝基因可以明顯提高酵母菌應(yīng)對(duì)乙酸脅迫的耐受性，從而縮短乙酸脅迫條件下的發(fā)酵周期，提高產(chǎn)物生成速率。而且，絮凝基因中重復(fù)序列單元C發(fā)生缺失使酵母菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的乙酸脅迫耐受性和脅迫條件下更高的乙醇產(chǎn)率，這與重復(fù)序列單元C缺失的絮凝蛋白Flo1cp比絮凝蛋白Flo1p具有更高的構(gòu)象穩(wěn)定性有 關(guān)[17]。乙酸脅迫條件下發(fā)酵結(jié)束后，菌株6-AF1c表現(xiàn)出比6-AF1高的絮凝能力也說(shuō)明了這一點(diǎn)。表達(dá)重復(fù)序列單元C缺失衍生基因在提高工業(yè)釀酒酵母乙酸脅迫耐受性上的有效性，不但為提高生物質(zhì)乙醇發(fā)酵效率提供了技術(shù)途徑，也將為提升酵母菌所參與的其他發(fā)酵工業(yè)過(guò)程效率提供重要思路。在對(duì)釀酒酵母遺傳修飾中，宿主菌遺傳背景有時(shí)對(duì)遺傳修飾效果產(chǎn)生一定影響[25-26]。通過(guò)對(duì)酵母菌絮凝能力的遺傳改造增強(qiáng)酵母細(xì)胞對(duì)乙酸脅迫的耐受性是否受宿主菌遺傳背景影響還需進(jìn)一步研究，以便更好地指導(dǎo)絮凝特性在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Improvement of acetic acid tolerance and fermentation performance of industrialby overexpression of flocculent geneand

Zhaoli Du1,2, Yanfei Cheng1, Hui Zhu1,2, Xiuping He1, and Borun Zhang1

1,,,100101,2,100049,

Flocculent geneand its truncated formwith complete deletion of repeat unit C were expressed in a non-flocculent industrial strainCE6 to generate recombinant flocculent strains 6-AF1 and 6-AF1c respectively. Both strains of 6-AF1 and 6-AF1c displayed strong flocculation and better cell growth than the control strain CE6-V carrying the empty vector under acetic acid stress. Moreover, the flocculent strains converted glucose to ethanol at much higher rates than the control strain CE6-V under acetic acid stress. In the presence of 0.6% (/) acetic acid, the average ethanol production rates of 6-AF1 and 6-AF1c were 1.56 and 1.62 times of that of strain CE6-V, while the ethanol production rates of 6-AF1 and 6-AF1c were 1.21 and 1.78 times of that of strain CE6-V under 1.0% acetic acid stress. Results in this study indicate that acetic acid tolerance and fermentation performance of industrialunder acetic acid stress can be improved largely by flocculation endowed by expression of flocculent genes, especially.

industrial,flocculen gene, acetic acid tolerance, fermentationperformance

May 9, 2014; Accepted: May 23, 2014

Xiuping He. Tel: +86-10-64807356; E-mail: hexp@im.ac.cn

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2012AA022106).

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2012AA022106) 資助。