哺乳動(dòng)物細(xì)胞多不飽和脂肪酸合成酶系的重建將亞油酸代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槎剂┧?/h1>
2015-07-19 13:06:30朱貴明AbdulmomenAliMohammedSalehSaidAhmedBahwal邱立紅孫潔商宇江旭東葛堂棟張濤
生物工程學(xué)報(bào) 2015年2期
朱貴明，Abdulmomen Ali Mohammed Saleh，Said Ahmed Bahwal，邱立紅，孫潔，商宇，江旭東，葛堂棟，張濤
?
哺乳動(dòng)物細(xì)胞多不飽和脂肪酸合成酶系的重建將亞油酸代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槎剂┧?/p>
朱貴明，Abdulmomen Ali Mohammed Saleh，Said Ahmed Bahwal，邱立紅，孫潔，商宇，江旭東，葛堂棟，張濤
佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007
朱貴明, Abdulmomen Ali Mohammed Saleh, Said Ahmed Bahwal, 等. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞多不飽和脂肪酸合成酶系的重建將亞油酸代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槎剂┧? 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(2): 281–290.Zhu GM, Saleh AAM, Bahwal SA, et al. Reconstitution of polyunsaturated fatty acid synthesis enzymes in mammalian cells to convert LA to DHA. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 281–290.
二十二碳六烯酸(DHA, 22:6n-3)是一種長度為22個(gè)碳原子且含有6個(gè)雙鍵的ω-3系多不飽和脂肪酸，在人體中具有重要生物學(xué)功能。人體及其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)只能合成少量的DHA，更多的需求必須從食物中獲取。然而，DHA的天然資源 (主要是深海魚類等海洋產(chǎn)品) 日趨枯竭，開發(fā)新型資源以滿足不斷擴(kuò)大的市場(chǎng)需求勢(shì)在必行。本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶超表達(dá)，同時(shí)表達(dá)來源于秀麗隱桿線蟲的Δ15去飽和酶和小眼蟲的Δ4去飽和酶，結(jié)果表明，這6種酶的表達(dá)或超表達(dá)能將ω-6系的亞油酸 (LA,18:2n-6) 有效地轉(zhuǎn)化為DHA (22:6n-3)，后者的含量從對(duì)照組的16.74%提高到實(shí)驗(yàn)組的25.3%。本研究的策略及技術(shù)路線為將來利用遺傳改造的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)珍稀的DHA (22:6n-3) 等長鏈多不飽和脂肪酸產(chǎn)品提供了重要的啟示。
多不飽和脂肪酸，脂肪酸去飽和酶，脂肪酸延長酶，多基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因
DHA (Docosahexaenoic acid, 22:6n-3) 是一種碳鏈長為22C且含有6個(gè)雙鍵的ω-3系的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFA)，俗稱“腦黃金”，通常來源于深海魚油以及一些藻類等生物[1]。DHA在人體內(nèi)的生物學(xué)功能例如促進(jìn)大腦及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、提高嬰幼兒認(rèn)知能力、抗炎癥反應(yīng)及抗腫瘤作用等已經(jīng)有了比較深入的研究和揭示[1-6]。目前，DHA制品已經(jīng)被廣泛加入嬰幼兒食品等食物及其他保健品中，并被用于抗炎癥及抗腫瘤等相關(guān)疾病治療的輔助藥物[7-10]。然而，隨著深海魚類等資源的枯竭以及污染等問題，DHA的自然來源卻越來越受到限制。因此，開發(fā)DHA等多不飽和脂肪酸新型產(chǎn)品以滿足人類的需求成了必經(jīng)之路。
相對(duì)于深海魚類等海洋食物資源，陸地型的動(dòng)植物食物資源才是世界范圍內(nèi)更多人群的主要選擇，陸地型的肉類食品更是占有重要的地位。這些動(dòng)物脂肪以飽和脂肪酸為主，不飽和脂肪酸含量很低，DHA等多不飽和脂肪酸則更低，例如100 g豬肉僅含2 mg DHA, 100 g牛肉僅含1 mg DHA[11]。這種不平衡的動(dòng)物脂肪酸已經(jīng)成為了現(xiàn)今危害人們健康的重大因素。事實(shí)上，哺乳動(dòng)物中存在比較完整的多不飽和脂肪酸去飽和酶和延長酶，它們交替作用，可以將來源于植物油脂的α-亞麻酸(ALA,18:3n-3) 轉(zhuǎn)化成為DPA (22:5n-3)。接下來，DPA (22:5n-3)進(jìn)入“Sprecher”途徑，進(jìn)一步延長為24:5n-3，再由Δ6-脂肪酸去飽和酶轉(zhuǎn)變?yōu)?4:6n-3，最后經(jīng)β-氧化后生成DHA (22:6n-3)[12-13]。然而，上述過程的效率很低 (小于1%)[14-16]，說明哺乳動(dòng)物具有某種抑制DHA (22:6n-3) 等長鏈多不飽和脂肪酸高水平合成的機(jī)制。
我們的前期研究應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將哺乳動(dòng)物來源的Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶4種酶的編碼基因構(gòu)建成為一個(gè)多基因表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293T，實(shí)現(xiàn)了4個(gè)目的基因的超表達(dá)。氣質(zhì)聯(lián)用 (GC-MS) 分析證實(shí)了添加在細(xì)胞培養(yǎng)基中的底物ALA (18:3n-3) 被細(xì)胞攝取后能有效地轉(zhuǎn)化成為DHA (22:6n-3)，其含量較對(duì)照組細(xì)胞提高了2.5倍[17]。在另一項(xiàng)研究中，我們將來源于線蟲的Δ15去飽和酶基因和小眼蟲的Δ4去飽和酶基因構(gòu)建成一個(gè)雙基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胞HEK293T，結(jié)果證明Δ4去飽和酶可與Δ15去飽和酶協(xié)同作用，即Δ15去飽和酶不僅將添加的亞油酸(LA,18:2n-6)和花生四烯酸(ARA, 20:4n-6) 轉(zhuǎn)化為ALA (18:3n-3) 和EPA (20:5n-3)，而且也能將22:4n-6 (為20:4n-6經(jīng)過延長作用的產(chǎn)物) 轉(zhuǎn)化為DPA (22:5n-3)；Δ4去飽和酶活性則正好將細(xì)胞中積累的DPA (22:5n-3) 直接轉(zhuǎn)化為DHA (22:6n-3)，而不必經(jīng)過復(fù)雜而低效的“Sprecher”途徑[18]。盡管這兩項(xiàng)研究均能夠有效提高了DHA的水平，但在實(shí)踐中可能會(huì)受到一些限制，例如第一項(xiàng)研究需要添加ALA，而自然界ALA的資源分布遠(yuǎn)少于LA，且遠(yuǎn)不如LA經(jīng)濟(jì)；第二項(xiàng)研究在添加LA的同時(shí)也要添加ARA才能夠有效獲得DHA，而ARA價(jià)格也昂貴。最佳的思路是找到一種策略可將LA有效轉(zhuǎn)化為DHA。
本研究將上述兩項(xiàng)研究結(jié)合起來，將含Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶編碼基因的多基因表達(dá)載體，與含Δ15去飽和酶和Δ4去飽和酶編碼基因的雙基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使上述6種酶聯(lián)合表達(dá) (或表達(dá))，實(shí)現(xiàn)了將唯一添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中的LA (18:2n-6)逐步代謝轉(zhuǎn)化為DHA (22:6n-3)，為動(dòng)物個(gè)體的遺傳改造提供可行性依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pcDNA3.1(-)以及下文中各種基因表達(dá)質(zhì)粒載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存。HEK293T細(xì)胞購于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、總RNA提取試劑RNAiso plus、RT-PCR試劑盒等購于寶生物工程 (大連) 有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒等購于天根生化科技 (北京) 有限公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基、血清、培養(yǎng)皿等為Hyclone產(chǎn)品。
1.2 方法
1.2.1 基因表達(dá)載體的構(gòu)建
多基因表達(dá)載體pcDNA3.1-F2F1-E5E2的構(gòu)建：來源于人的Δ6-脂肪酸去飽和酶基因 (, 編碼445個(gè)氨基酸) 和Δ5-脂肪酸去飽和酶基因(, 編碼448個(gè)氨基酸) 以及來源于小鼠的Δ6-脂肪酸延長酶基因 (, 編碼300個(gè)氨基酸) 和Δ5-脂肪酸延長酶基因 (, 編碼297個(gè)氨基酸) 4個(gè)基因構(gòu)建為一個(gè)多基因表達(dá)載體pcDNA3.1-F2F1-E5E2。在該載體中，每個(gè)目的基因各自有獨(dú)立的啟動(dòng)子和終止信號(hào)polyA，故能獨(dú)立表達(dá)不相互影響。此多基因表達(dá)載體總大小為12 760 bp。具體的載體構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)[19]。
雙基因表達(dá)載體pcDNA3.1-sD15-sEgD4的構(gòu)建：將線蟲的Δ15去飽和酶基因sD15 (GenBank Accession No. NM_001028389) cDNA序列 (編碼框全長為1 200 bp) 和小眼蟲的Δ4去飽和酶基因sEgD4 (GenBank Accession No. AY278558) 的cDNA序列 (編碼框全長為1 626 bp) 分別進(jìn)行密碼子優(yōu)化并克隆到表達(dá)載體pcDNA3.1，然后再構(gòu)建兩者的雙基因表達(dá)載體pcDNA3.1-sD15-sEgD4。具體的載體構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)[18]。
1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
HEK293T細(xì)胞生長培養(yǎng)基為高糖DMEM中添加1%雙抗 (青霉素100 U/mL＋鏈霉素 100 μg/mL)、1%丙酮酸鈉 (11.0 mg/mL)、1%非必需氨基酸、10%胎牛血清。轉(zhuǎn)染前一天將培養(yǎng)的細(xì)胞分散至60 mm平皿，加無雙抗培養(yǎng)基 5 mL培養(yǎng)，同時(shí)添加10 μmol/L亞油酸 (LA, 18:2n-6)。待其生長至90%左右匯合時(shí)用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染操作按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染時(shí)實(shí)驗(yàn)組為質(zhì)粒pcDNA3.1-F2F1- E5E2+pcDNA3.1-sD15-sEgD4 (兩個(gè)質(zhì)粒等比例混合)，對(duì)照組為質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP，兩組各為8 μg。轉(zhuǎn)染后48 h，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集備用。
1.2.3 RT-PCR鑒定目的基因的超表達(dá)
取上述收集的細(xì)胞1/3用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。總RNA提取和RT-PCR實(shí)驗(yàn)均按照寶生物工程 (大連) 有限公司相關(guān)試劑說明書進(jìn)行。簡言之，總RNA提取之后先進(jìn)行定量測(cè)定各樣品含量，然后將總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，每個(gè)樣品取2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PCR檢測(cè)，每個(gè)PCR反應(yīng)體系為25 μL。PCR中使用的目的基因表達(dá)檢測(cè)引物見表1 (其中引物ActD-s和ActD-a用于檢測(cè)內(nèi)參基因β-actin)。
PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL進(jìn)行電泳檢測(cè)，觀察基因表達(dá)情況。
表1 PCR實(shí)驗(yàn)中使用的引物
1.2.4 脂肪酸的提取與GC-MS分析
取上述收集的細(xì)胞余下的2/3用于脂肪酸提取：用去離子水漂洗3次，1 000 r/min離心 5 min，加入1 mL 2.5% H2SO4/甲醇溶液，輕輕混勻，80 ℃水浴90 min，待冷卻至室溫，加入1.5 mL 0.9% NaCl溶液和1 mL正己烷，劇烈振蕩混勻，3 000 r/min離心5 min，將脂肪酸萃取到有機(jī)相中，吸取上清經(jīng)氮?dú)獯蹈蓾饪s后–80 ℃保存?zhèn)溆?。GC-MS檢測(cè)時(shí)可添加適量的正己烷稀釋，使用儀器為安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀HP-5890/ HP-5971。檢測(cè)使用參數(shù)參考Kang等的報(bào)道[20]。
1.3 統(tǒng)計(jì)分析
2 結(jié)果與分析
2.1 6個(gè)外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)或超表達(dá)
將多基因表達(dá)載體pcDNA3.1-F2F1-E5E2和雙基因表達(dá)載體pcDNA3.1-sD15-sEgD4共同用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞NHK293，轉(zhuǎn)染時(shí)利用pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒作為對(duì)照，其綠色熒光可以比較準(zhǔn)確地反映轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后第二天觀察細(xì)胞，可以看到對(duì)照組的綠色熒光，在轉(zhuǎn)染后48 h綠色熒光基本達(dá)到最強(qiáng)的狀態(tài)，約90%以上細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染。此時(shí)收集細(xì)胞提取總RNA進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-F2F1-E5E2和pcDNA3.1-sD15-sEgD4的細(xì)胞中，,,和均成功表達(dá) (或超表達(dá)) (圖1)。
圖１ RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中目的基因的轉(zhuǎn)錄水平
2.2 外源基因的超表達(dá)提高細(xì)胞中LA (18:2n-6) 向DHA (22:6n-3) 轉(zhuǎn)化的能力
通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)確認(rèn)6個(gè)目的基因均獲得超表達(dá)后，提取細(xì)胞中的脂肪酸，并利用GC-MS進(jìn)行分析，結(jié)果如圖２所示。色譜圖中橫坐標(biāo)為各種脂肪酸出現(xiàn)的保留時(shí)間，不同的脂肪酸出現(xiàn)的時(shí)間不一樣，由此可以將各種脂肪酸在色譜圖中分別開來，再通過質(zhì)譜分析和搜庫對(duì)比就可以準(zhǔn)確判定各個(gè)色譜峰所代表的不同脂肪酸的具體種類。各個(gè)色譜峰的高低則表明此脂肪酸的含量，按照其峰面積計(jì)算出它的含量，進(jìn)而可計(jì)算出每一種脂肪酸的百分含量 (表2)。這些數(shù)據(jù)表明，與轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1- EGFP的細(xì)胞相比，同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-F2F1- E5E2和pcDNA3.1-sD15-sEgD4質(zhì)粒的細(xì)胞中，,,和這6個(gè)目的基因的表達(dá) (或超表達(dá)) 顯著地促使LA (18:2n-6)向長鏈多不飽和脂肪酸的生物合成方向轉(zhuǎn)化。對(duì)圖1和表2分析可知，一部分LA (18:2n-6)被Δ15去飽和酶轉(zhuǎn)化為ALA (18:3n-3)，然后在Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶的交替作用下，按照ω-3代謝途徑合成其下游長鏈的ω-3多不飽和脂肪酸如EPA (20:5n-3) 和DPA (22:5n-3) 接著被Δ4脂肪酸去飽和酶直接轉(zhuǎn)化為DHA (22:6n-3)；另一部分LA (18:2n-6) 可以在Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶的交替作用下，按照ω-6代謝途徑合成20:3n-6和20:4n-6，同時(shí)，這些產(chǎn)物還可以被Δ15去飽和酶轉(zhuǎn)化為20:4n-3 (未檢測(cè)到) 和20:5n-3，繼而進(jìn)入ω-3代謝途徑，直至合成DHA?？傮w看來，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組相比較，添加的LA顯著下降，而ω-3系的多不飽和脂肪酸如ALA (18:3n-3)、EPA (20:5n-3)、DPA (22:5n-3) 和DHA (22:6n-3) 的含量均顯著升高，其中DHA (22:6n-3) 的含量從16.74%提高到25.3%。此外，本研究結(jié)果還表明，6個(gè)目的基因的表達(dá)或超表達(dá)顯著降低了ω-6與ω-3多不飽和脂肪酸之間的比率，即從對(duì)照組的1.85降至實(shí)驗(yàn)組的0.84。
圖2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP (A) 或pcDNA3.1-F2F1-E5E2+pcDNA3.1-sD15-sEgD4 (B) 質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中多不飽和脂肪酸的色譜圖 (局部)
表2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP或pcDNA3.1-F2F1-E5E2+ pcDNA3.1-sD15-sEgD4質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中多不飽和脂肪酸的組成及含量變化
Notes: values are means of three measurements; values for each fatty acid with different superscript differ significantly (﹤0.05) between control (EGFP) and F2F1-E5E2+sD15-sEgD4.
3 討論
如何獲取豐富的DHA等長鏈多不飽和脂肪酸資源是當(dāng)今世界范圍內(nèi)人們所關(guān)心的一個(gè)問題。相關(guān)的研究顯示，通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)在哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)這些長鏈多不飽和脂肪酸是有可能的。1997年，Spychalla等從線蟲中篩選克隆了第一個(gè)動(dòng)物Δ15去飽和酶 (通常也稱為ω-3去飽和酶) 基因，命名為[21]，在后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)基因可以將16–20碳ω-6 PUFAs去飽和變成ω-3 PUFAs。Kang等將基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，ω-6/ω-3PUFAs比從15:1下降到1:1，使哺乳動(dòng)物中的ω-3 PUFAs含量顯著提高[20]。之后又于2004年將基因轉(zhuǎn)入小鼠，使得ALA、EPA、DPA 等ω-3 PUFAs均顯著提高[22]。2006年，Lai等制備的的轉(zhuǎn)基因豬，也表現(xiàn)出了與轉(zhuǎn)基因小鼠類似的情況[23]。然而，這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)所合成的ω-3 PUFAs中以18C和20C的ω-3 PUFAs為主，而更為重要的22C的DHA總量仍然很少。事實(shí)上，后續(xù)的一些研究表明的Δ15去飽和酶活性并不能增加這些動(dòng)物體內(nèi)的DHA含量。因此，基因在用于提高哺乳動(dòng)物長鏈多不飽和脂肪酸含量的實(shí)踐中，關(guān)鍵性的缺憾就是不能增加DHA的含量。
在哺乳動(dòng)物中，阻礙DHA高效生物合成的原因大概有3個(gè)：一是Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶的活性可能受到某種機(jī)制的抑制，尤其是Δ6脂肪酸去飽和酶的活性。Δ6脂肪酸去飽和酶基本上是被公認(rèn)的在哺乳動(dòng)物長鏈多不飽和脂肪酸的生物合成過程中的第一個(gè)限速酶[24]。針對(duì)這一原因，我們前期研究將上述4種酶在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行超表達(dá)研究，結(jié)果證實(shí)了哺乳動(dòng)物自身形成了某種平衡機(jī)制，抑制長鏈多不飽和脂肪酸如DHA、ARA等的大量的高水平合成，但是通過對(duì)Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶的超表達(dá)，能夠打破哺乳動(dòng)物這種平衡機(jī)制，從而顯著提高DHA、ARA等的合成水平。二是哺乳動(dòng)物缺失Δ15脂肪酸去飽和酶活性，不能將體內(nèi)攝入的ω-6多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為合成DHA的前體脂肪酸如EPA和DPA等。人類食品以及動(dòng)物飼料脂肪酸中通常含有大量的亞油酸 (LA,18:2n-6)，并由此合成花生四烯酸 (AA, 20:4n-6) 等ω-6系多不飽和脂肪酸，而ω-3系多不飽和脂肪酸含量很低，例如在西方人體ω-6與ω-3系多不飽和脂肪酸的比率通常高達(dá)10?20，這種比率的失衡不利于身體健康[25]。上文中所提及的線蟲的Δ15去飽和酶活性被引入動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞后就能夠?qū)ⅵ?6系多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為ω-3系多不飽和脂肪酸，從而改變兩者之比率。三是哺乳動(dòng)物在ω-3長鏈多不飽和脂肪酸生物合成途徑中從DPA轉(zhuǎn)化為DHA這一環(huán)節(jié)的低效性，即“Sprecher”通路對(duì)高效轉(zhuǎn)化DPA為DHA的具有某種制約性。但是在自然界中，一些生物，例如一種原生動(dòng)物小眼蟲、海洋真菌破囊壺菌和巴夫藻，在合成DHA時(shí)并不需要經(jīng)過“Sprecher 通路”，而是直接利用Δ4去飽和酶活性將DPA轉(zhuǎn)化成為DHA，因此這類生物中DHA含量一般比較 高[26-28]。前面提及基因在哺乳動(dòng)物中表達(dá)后能夠生成很高水平的DPA，但不能進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成為DHA。我們前期研究已經(jīng)證實(shí)，源自于小眼蟲Δ4去飽和酶活性正好可以與基因 (我們研究中所用的sD15與之同源，但進(jìn)行了密碼子優(yōu)化) 配合，將累積的DPA直接轉(zhuǎn)化成為DHA。
本研究正是致力于解決上述阻礙DHA高效生物合成的3個(gè)因素或環(huán)節(jié)，目標(biāo)是使哺乳動(dòng)物細(xì)胞甚至是哺乳動(dòng)物個(gè)體通過遺傳改造后能夠高效地利用自然界大量存在的亞油酸 (LA, 18:2n-6)，將其轉(zhuǎn)化為DHA (22:6n-3)，使動(dòng)物脂肪變成對(duì)人體健康有益成為可能。此項(xiàng)研究明確證實(shí)，Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶、Δ6和Δ5脂肪酸延長酶以及Δ15和Δ4脂肪酸去飽和酶這6種酶活性在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)或超表達(dá)顯著地提高了這種轉(zhuǎn)化能力，既能夠?qū)ⅵ?6系多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為ω-3系多不飽和脂肪酸，又能夠?qū)⒍替湹腖A或ALA轉(zhuǎn)化為長鏈的ARA、EPA、DPA等，最后還能將細(xì)胞中積累的DPA直接轉(zhuǎn)化為DHA?？梢哉f，這種思路是在哺乳動(dòng)物及其細(xì)胞中將LA (18:2n-6)代謝轉(zhuǎn)化為DHA (22:6n-3) 的最佳轉(zhuǎn)基因組合。當(dāng)然，多個(gè)目的基因用于制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將變得更加困難，還需要解決一些技術(shù)問題。
我們的研究以及技術(shù)路線除了為將來改造陸地型動(dòng)物以提供DHA等長鏈多不飽和脂肪酸提供理論和數(shù)據(jù)支持外，還可以將其應(yīng)用于DHA等長鏈多不飽和脂肪酸生物學(xué)功能的相關(guān)基礎(chǔ)研究中，因?yàn)檫@種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本身就是一個(gè)很好的動(dòng)物模型。因此，本研究不僅具有潛在的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值，也為相關(guān)理論研究奠定了基礎(chǔ)。
REFERENCES
[1] VaughanVC, Hassing MR, Lewandowski PA. Marine polyunsaturated fatty acids and cancer therapy. Br J Cancer, 2013, 108(3): 486–492.
[2] Rogers LK, Valentine CJ, Keim SA. DHA supplementation: current implications in pregnancy and childhood.Pharmacol Res, 2013, 70(1): 13–19.
[3] Catalan J, Moriguchi T, Slotnick B, et al. Cognitive deficits in docosahexaenoic aciddeficient rats. Behav Neurosci, 2002, 116(6): 1022–1031.
[4] Innis SM. The role of dietary n-6 and n-3 fatty acids in the developing brain. Dev Neurosci, 2000, 22(5/6): 474–480.
[5] Birch EE, Garfield S, Castaneda Y, et al. Visual acuity and cognitive outcomes at 4 years of age in a double-blind, randomized trial of long-chain polyunsaturated fatty acid-supplemented infant formula. Early Hum Dev, 2007, 83(5): 279–284.
[6] Moriguchi T, Greiner RS, Salem NJr. Behavioral deficits associated with dietary induction of decreased brain docosahexaenoic acid concentration. J Neurochem, 2000, 75(6): 2563–2573.
[7] Lim GP, Calon F, Morihara T, et al. A diet enriched with the omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid reduces amyloid burden in an aged Alzheimer mouse model. J Neurosci, 2005, 25(12): 3032–3040.
[8] Rose DP, Connolly JM, Raybum J, et al. Infuence of diets containing eicosapentaenoic acid on growth and metastasis of breast cancer cells in nude mice. J Nat Cancer Inst, 1995, 87(8): 587–592.
[9] Gonzalez MJ, Schemmel RA, Dugan L Jr, et al. Dietary fish oil inhibits human breast carcinoma growth: a function of increased lipid peroxidation. Lipids, 1993, 28(9): 827–832.
[10] Ruxton CH, Reed SC, Simpson MJ, et al. The health benefits of omega-3 polyunsaturated fatty acids: a review of the evidence. J Hum Nutr Diet, 2004, 17(5): 449–459.
[11] Mozaffarian D, Wu JH. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease: effects on risk factors, molecular pathways, and clinical events. J Am Coll Cardiol, 2011, 58(20): 2047–2067.
[12] Vance DE, Vance JE. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins, and Membranes. 4th ed. Amsterdam: Elsevier, 2004: 181–204.
[13] Sprecher H. Metabolism of highly unsaturated n-3 and n-6 fatty acids. Biochim Biophys Acta, 2000, 1486(2/3): 219–231.
[14] Emken EA, Adlof RO, Gulley RM. Dietary linoleic acid influences desaturation and acylation of deuterium-labeled linoleic and linolenic acids in young adult males. Biochim Biophys Acta, 1994, 1213(3): 277–288.
[15] Pawlosky RJ, Hibbeln JR, Novotny JA, et al. Physiological compartmental analysis of alpha-linolenic acid metabolism in adult humans. J Lipid Res, 2001, 42(8): 1257–1265.
[16] Hussein N, Ah-Sing E, Wilkinson P, et al. Long-chain conversion of [13C]linoleic acid and alpha-linolenic acid in response to marked changes in their dietary intake in men. J Lipid Res, 2005, 46(2): 269–280.
[17] Zhu GM, Saleh AAM, Bahwal SA, et al.Overexpression of four fatty acid synthase genes elevated the efficiency of long-chain polyunsaturated fatty acids biosynthesis in mammalian cells. Chin J Biotech, 2014, 30(9): 1464–1472(in Chinese).朱貴明, Saleh AAM, Bahwal SA, 等. 四個(gè)脂肪酸合成酶基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的超表達(dá)提高長鏈多不飽和脂肪酸生物合成效率. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(9): 1464–1472.
[18] Zhu GM, Ou Q, Zhang T, et al. A more desirable balanced polyunsaturated fatty acid composition achieved by heterologous expression of Δ15/Δ4 desaturases in mammaliancells, PLoS ONE, 2013 8(12): e84871.
[19] Wang KF, Zhu GM, Zhang L, et al. Construction of fatty acid synthesis enzymes multigene expression vector. Chin J Gerontol, 2013, 33(17): 4178–4180 (in Chinese).汪坤福, 朱貴明, 張莉, 等. 脂肪酸合成酶系多基因表達(dá)載體的構(gòu)建. 中國老年學(xué)雜志, 2013, 33(17): 4178–4180.
[20] Kang ZB, Ge Y, Chen Z, et al. Adenoviral gene transfer ofn-3 fatty acid desaturase optimizes fatty acid composition in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 98(7): 4050–4054.
[21] Spychalla JP, Kinney AJ, Browse J. Identfication of an animal n-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(4): 1142–1147.
[22] Kang JX, Wang J, Wu L, et al. Transgenic mice Fat-1 mice convert n-6 to n-3 fatty acids. Nature, 2004, 427(6974): 504.
[23] Lai L, Kang JX, Li R, et al.Generation of cloned transgenic pigs rich in omega-3 fatty acids. Nat Biotechnol,2006, 24(4): 435–436.
[24] Tocher DR, Leaver MJ, Hodgson PA. Recent advances in the biochemistry and molecular biology of fatty acyl desaturase. Prog Lipid Res, 1998, 37(2/3): 73–117.
[25] Simopoulos AP. Evolutionary aspects of diet: the omega-6/omega-3 ratio and the brain. Mol Neurobiol, 2011, 44(2): 203–215.
[26] Meyer A, Cirpus P, Ott C, et al. Biosynthesis of docosahexaenoic acid in: biochemical and molecular evidence for the involvement of a Δ4-fatty acyl group desaturase. Biochemistry, 2003, 42(32): 9779–9788.
[27] Tonon T, Harvey D, Larson TR, et al. Identification of a very long chain polyunsaturated fatty acid Δ4-desaturase from the microalga. FEBS Lett, 2003, 553(3): 440–444.
[28] Qiu X, Hong H, MacKenzie SL. Identification of a Δ4 fatty acid desaturase fromsp. involved in the biosynthesis of docosahexanoic acid by heterologous expression inand. J Biol Chem, 2001, 276(34): 31561–31566.
(本文責(zé)編 陳宏宇)
Reconstitution of polyunsaturated fatty acid synthesis enzymes in mammalian cells to convert LA to DHA
Guiming Zhu, Abdulmomen Ali Mohammed Saleh, Said Ahmed Bahwal, Lihong Qiu, Jie Sun, Yu Shang, Xudong Jiang, Tangdong Ge, and Tao Zhang
,,154007,,
DHA (22:6n-3) is a ω-3 polyunsaturated fatty acid with22 carbon atoms and 6 double bonds, which has important biological functions in human body. Human and other mammals synthesize only limited amounts of DHA, more requirements must be satisfied from food resources. However, the natural resources of DHA (Mainly deep-sea fish and other marine products) are prone to depletion. New resources development is still insufficient to satisfy the growing market demand. Previous studies have revealed that the mammals can increase the synthesis of DHA and other long-chain polyunsaturated fatty acids after transgenic procedures. In this study, mammalian cells were transfected with Δ6, Δ5 desaturase, Δ6, Δ5 elongase, Δ15 desaturase (Isolated from nematode) and Δ4 desaturase (Isolated from), simultaneously. Results show that the expression or overexpression of these 6 enzymes is capable of conversion of the ω-6 linoleic acid (LA, 18:2n-6) in DHA (22:6n-3). DHA content has increased from 16.74% in the control group to 25.3% in the experimental group. The strategy and related technology in our research provided important data for future production the valuable DHA (22:6n-3) by using genetically modified animals.
polyunsaturated fatty acid, fatty acid desaturase, fatty acid elongase, multiple-gene expression vector, transgene
April 19, 2014; Accepted: July 11, 2014
Guiming Zhu. Tel: +86-454-8618331; E-mail: xi78926@sina.com
Supported by:Science and Technology Research Project of Heilongjiang Provincal Education Department (No. 12511563).
黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目 (No. 12511563) 資助。
網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-08-01
http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140235.html
猜你喜歡
為什么鴨嘴獸被歸為哺乳動(dòng)物？科學(xué)大眾·小諾貝爾(低幼)(2024年10期)2024-01-01 00:00:00 長鏈非編碼RNA APTR、HEIH、FAS-ASA1、FAM83H-AS1、DICER1-AS1、PR-lncRNA在肺癌中的表達(dá)昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(2021年4期)2021-07-23 01:21:44 n-3多不飽和脂肪酸改善糖脂代謝的研究進(jìn)展天然產(chǎn)物研究與開發(fā)(2018年9期)2018-10-08 03:26:00 2 從最早的哺乳動(dòng)物到人類小學(xué)科學(xué)(學(xué)生版)(2018年5期)2018-06-15 08:48:00 哺乳動(dòng)物大時(shí)代奇妙博物館(2018年12期)2018-04-25 02:16:04 哺乳動(dòng)物家族會(huì)奇妙博物館(2018年12期)2018-04-25 02:16:02 超聲波促進(jìn)合成新型吡咯α,β-不飽和酮合成化學(xué)(2015年10期)2016-01-17 08:56:06 兩個(gè)alpha,beta-不飽和酮藥物的合成及抗腫瘤活性研究分析測(cè)試學(xué)報(bào)(2015年8期)2016-01-13 06:19:29 長鏈磷腈衍生物的制備及其在聚丙烯中的阻燃應(yīng)用中國塑料(2015年10期)2015-10-14 01:13:16 長鏈非編碼RNA與腫瘤的相關(guān)研究進(jìn)展醫(yī)學(xué)研究雜志(2015年4期)2015-06-10 06:42:43
朱貴明，Abdulmomen Ali Mohammed Saleh，Said Ahmed Bahwal，邱立紅，孫潔，商宇，江旭東，葛堂棟，張濤
?
哺乳動(dòng)物細(xì)胞多不飽和脂肪酸合成酶系的重建將亞油酸代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槎剂┧?/p>
朱貴明，Abdulmomen Ali Mohammed Saleh，Said Ahmed Bahwal，邱立紅，孫潔，商宇，江旭東，葛堂棟，張濤
佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007
朱貴明, Abdulmomen Ali Mohammed Saleh, Said Ahmed Bahwal, 等. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞多不飽和脂肪酸合成酶系的重建將亞油酸代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槎剂┧? 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(2): 281–290.Zhu GM, Saleh AAM, Bahwal SA, et al. Reconstitution of polyunsaturated fatty acid synthesis enzymes in mammalian cells to convert LA to DHA. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 281–290.
二十二碳六烯酸(DHA, 22:6n-3)是一種長度為22個(gè)碳原子且含有6個(gè)雙鍵的ω-3系多不飽和脂肪酸，在人體中具有重要生物學(xué)功能。人體及其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)只能合成少量的DHA，更多的需求必須從食物中獲取。然而，DHA的天然資源 (主要是深海魚類等海洋產(chǎn)品) 日趨枯竭，開發(fā)新型資源以滿足不斷擴(kuò)大的市場(chǎng)需求勢(shì)在必行。本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶超表達(dá)，同時(shí)表達(dá)來源于秀麗隱桿線蟲的Δ15去飽和酶和小眼蟲的Δ4去飽和酶，結(jié)果表明，這6種酶的表達(dá)或超表達(dá)能將ω-6系的亞油酸 (LA,18:2n-6) 有效地轉(zhuǎn)化為DHA (22:6n-3)，后者的含量從對(duì)照組的16.74%提高到實(shí)驗(yàn)組的25.3%。本研究的策略及技術(shù)路線為將來利用遺傳改造的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)珍稀的DHA (22:6n-3) 等長鏈多不飽和脂肪酸產(chǎn)品提供了重要的啟示。
多不飽和脂肪酸，脂肪酸去飽和酶，脂肪酸延長酶，多基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因
DHA (Docosahexaenoic acid, 22:6n-3) 是一種碳鏈長為22C且含有6個(gè)雙鍵的ω-3系的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFA)，俗稱“腦黃金”，通常來源于深海魚油以及一些藻類等生物[1]。DHA在人體內(nèi)的生物學(xué)功能例如促進(jìn)大腦及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、提高嬰幼兒認(rèn)知能力、抗炎癥反應(yīng)及抗腫瘤作用等已經(jīng)有了比較深入的研究和揭示[1-6]。目前，DHA制品已經(jīng)被廣泛加入嬰幼兒食品等食物及其他保健品中，并被用于抗炎癥及抗腫瘤等相關(guān)疾病治療的輔助藥物[7-10]。然而，隨著深海魚類等資源的枯竭以及污染等問題，DHA的自然來源卻越來越受到限制。因此，開發(fā)DHA等多不飽和脂肪酸新型產(chǎn)品以滿足人類的需求成了必經(jīng)之路。
相對(duì)于深海魚類等海洋食物資源，陸地型的動(dòng)植物食物資源才是世界范圍內(nèi)更多人群的主要選擇，陸地型的肉類食品更是占有重要的地位。這些動(dòng)物脂肪以飽和脂肪酸為主，不飽和脂肪酸含量很低，DHA等多不飽和脂肪酸則更低，例如100 g豬肉僅含2 mg DHA, 100 g牛肉僅含1 mg DHA[11]。這種不平衡的動(dòng)物脂肪酸已經(jīng)成為了現(xiàn)今危害人們健康的重大因素。事實(shí)上，哺乳動(dòng)物中存在比較完整的多不飽和脂肪酸去飽和酶和延長酶，它們交替作用，可以將來源于植物油脂的α-亞麻酸(ALA,18:3n-3) 轉(zhuǎn)化成為DPA (22:5n-3)。接下來，DPA (22:5n-3)進(jìn)入“Sprecher”途徑，進(jìn)一步延長為24:5n-3，再由Δ6-脂肪酸去飽和酶轉(zhuǎn)變?yōu)?4:6n-3，最后經(jīng)β-氧化后生成DHA (22:6n-3)[12-13]。然而，上述過程的效率很低 (小于1%)[14-16]，說明哺乳動(dòng)物具有某種抑制DHA (22:6n-3) 等長鏈多不飽和脂肪酸高水平合成的機(jī)制。
我們的前期研究應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將哺乳動(dòng)物來源的Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶4種酶的編碼基因構(gòu)建成為一個(gè)多基因表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293T，實(shí)現(xiàn)了4個(gè)目的基因的超表達(dá)。氣質(zhì)聯(lián)用 (GC-MS) 分析證實(shí)了添加在細(xì)胞培養(yǎng)基中的底物ALA (18:3n-3) 被細(xì)胞攝取后能有效地轉(zhuǎn)化成為DHA (22:6n-3)，其含量較對(duì)照組細(xì)胞提高了2.5倍[17]。在另一項(xiàng)研究中，我們將來源于線蟲的Δ15去飽和酶基因和小眼蟲的Δ4去飽和酶基因構(gòu)建成一個(gè)雙基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胞HEK293T，結(jié)果證明Δ4去飽和酶可與Δ15去飽和酶協(xié)同作用，即Δ15去飽和酶不僅將添加的亞油酸(LA,18:2n-6)和花生四烯酸(ARA, 20:4n-6) 轉(zhuǎn)化為ALA (18:3n-3) 和EPA (20:5n-3)，而且也能將22:4n-6 (為20:4n-6經(jīng)過延長作用的產(chǎn)物) 轉(zhuǎn)化為DPA (22:5n-3)；Δ4去飽和酶活性則正好將細(xì)胞中積累的DPA (22:5n-3) 直接轉(zhuǎn)化為DHA (22:6n-3)，而不必經(jīng)過復(fù)雜而低效的“Sprecher”途徑[18]。盡管這兩項(xiàng)研究均能夠有效提高了DHA的水平，但在實(shí)踐中可能會(huì)受到一些限制，例如第一項(xiàng)研究需要添加ALA，而自然界ALA的資源分布遠(yuǎn)少于LA，且遠(yuǎn)不如LA經(jīng)濟(jì)；第二項(xiàng)研究在添加LA的同時(shí)也要添加ARA才能夠有效獲得DHA，而ARA價(jià)格也昂貴。最佳的思路是找到一種策略可將LA有效轉(zhuǎn)化為DHA。
本研究將上述兩項(xiàng)研究結(jié)合起來，將含Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶編碼基因的多基因表達(dá)載體，與含Δ15去飽和酶和Δ4去飽和酶編碼基因的雙基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使上述6種酶聯(lián)合表達(dá) (或表達(dá))，實(shí)現(xiàn)了將唯一添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中的LA (18:2n-6)逐步代謝轉(zhuǎn)化為DHA (22:6n-3)，為動(dòng)物個(gè)體的遺傳改造提供可行性依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pcDNA3.1(-)以及下文中各種基因表達(dá)質(zhì)粒載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存。HEK293T細(xì)胞購于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、總RNA提取試劑RNAiso plus、RT-PCR試劑盒等購于寶生物工程 (大連) 有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒等購于天根生化科技 (北京) 有限公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基、血清、培養(yǎng)皿等為Hyclone產(chǎn)品。
1.2 方法
1.2.1 基因表達(dá)載體的構(gòu)建
多基因表達(dá)載體pcDNA3.1-F2F1-E5E2的構(gòu)建：來源于人的Δ6-脂肪酸去飽和酶基因 (, 編碼445個(gè)氨基酸) 和Δ5-脂肪酸去飽和酶基因(, 編碼448個(gè)氨基酸) 以及來源于小鼠的Δ6-脂肪酸延長酶基因 (, 編碼300個(gè)氨基酸) 和Δ5-脂肪酸延長酶基因 (, 編碼297個(gè)氨基酸) 4個(gè)基因構(gòu)建為一個(gè)多基因表達(dá)載體pcDNA3.1-F2F1-E5E2。在該載體中，每個(gè)目的基因各自有獨(dú)立的啟動(dòng)子和終止信號(hào)polyA，故能獨(dú)立表達(dá)不相互影響。此多基因表達(dá)載體總大小為12 760 bp。具體的載體構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)[19]。
雙基因表達(dá)載體pcDNA3.1-sD15-sEgD4的構(gòu)建：將線蟲的Δ15去飽和酶基因sD15 (GenBank Accession No. NM_001028389) cDNA序列 (編碼框全長為1 200 bp) 和小眼蟲的Δ4去飽和酶基因sEgD4 (GenBank Accession No. AY278558) 的cDNA序列 (編碼框全長為1 626 bp) 分別進(jìn)行密碼子優(yōu)化并克隆到表達(dá)載體pcDNA3.1，然后再構(gòu)建兩者的雙基因表達(dá)載體pcDNA3.1-sD15-sEgD4。具體的載體構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)[18]。
1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
HEK293T細(xì)胞生長培養(yǎng)基為高糖DMEM中添加1%雙抗 (青霉素100 U/mL＋鏈霉素 100 μg/mL)、1%丙酮酸鈉 (11.0 mg/mL)、1%非必需氨基酸、10%胎牛血清。轉(zhuǎn)染前一天將培養(yǎng)的細(xì)胞分散至60 mm平皿，加無雙抗培養(yǎng)基 5 mL培養(yǎng)，同時(shí)添加10 μmol/L亞油酸 (LA, 18:2n-6)。待其生長至90%左右匯合時(shí)用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染操作按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染時(shí)實(shí)驗(yàn)組為質(zhì)粒pcDNA3.1-F2F1- E5E2+pcDNA3.1-sD15-sEgD4 (兩個(gè)質(zhì)粒等比例混合)，對(duì)照組為質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP，兩組各為8 μg。轉(zhuǎn)染后48 h，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集備用。
1.2.3 RT-PCR鑒定目的基因的超表達(dá)
取上述收集的細(xì)胞1/3用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。總RNA提取和RT-PCR實(shí)驗(yàn)均按照寶生物工程 (大連) 有限公司相關(guān)試劑說明書進(jìn)行。簡言之，總RNA提取之后先進(jìn)行定量測(cè)定各樣品含量，然后將總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，每個(gè)樣品取2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PCR檢測(cè)，每個(gè)PCR反應(yīng)體系為25 μL。PCR中使用的目的基因表達(dá)檢測(cè)引物見表1 (其中引物ActD-s和ActD-a用于檢測(cè)內(nèi)參基因β-actin)。
PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL進(jìn)行電泳檢測(cè)，觀察基因表達(dá)情況。
表1 PCR實(shí)驗(yàn)中使用的引物
1.2.4 脂肪酸的提取與GC-MS分析
取上述收集的細(xì)胞余下的2/3用于脂肪酸提取：用去離子水漂洗3次，1 000 r/min離心 5 min，加入1 mL 2.5% H2SO4/甲醇溶液，輕輕混勻，80 ℃水浴90 min，待冷卻至室溫，加入1.5 mL 0.9% NaCl溶液和1 mL正己烷，劇烈振蕩混勻，3 000 r/min離心5 min，將脂肪酸萃取到有機(jī)相中，吸取上清經(jīng)氮?dú)獯蹈蓾饪s后–80 ℃保存?zhèn)溆?。GC-MS檢測(cè)時(shí)可添加適量的正己烷稀釋，使用儀器為安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀HP-5890/ HP-5971。檢測(cè)使用參數(shù)參考Kang等的報(bào)道[20]。
1.3 統(tǒng)計(jì)分析
2 結(jié)果與分析
2.1 6個(gè)外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)或超表達(dá)
將多基因表達(dá)載體pcDNA3.1-F2F1-E5E2和雙基因表達(dá)載體pcDNA3.1-sD15-sEgD4共同用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞NHK293，轉(zhuǎn)染時(shí)利用pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒作為對(duì)照，其綠色熒光可以比較準(zhǔn)確地反映轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后第二天觀察細(xì)胞，可以看到對(duì)照組的綠色熒光，在轉(zhuǎn)染后48 h綠色熒光基本達(dá)到最強(qiáng)的狀態(tài)，約90%以上細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染。此時(shí)收集細(xì)胞提取總RNA進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-F2F1-E5E2和pcDNA3.1-sD15-sEgD4的細(xì)胞中，,,和均成功表達(dá) (或超表達(dá)) (圖1)。
圖１ RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中目的基因的轉(zhuǎn)錄水平
2.2 外源基因的超表達(dá)提高細(xì)胞中LA (18:2n-6) 向DHA (22:6n-3) 轉(zhuǎn)化的能力
通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)確認(rèn)6個(gè)目的基因均獲得超表達(dá)后，提取細(xì)胞中的脂肪酸，并利用GC-MS進(jìn)行分析，結(jié)果如圖２所示。色譜圖中橫坐標(biāo)為各種脂肪酸出現(xiàn)的保留時(shí)間，不同的脂肪酸出現(xiàn)的時(shí)間不一樣，由此可以將各種脂肪酸在色譜圖中分別開來，再通過質(zhì)譜分析和搜庫對(duì)比就可以準(zhǔn)確判定各個(gè)色譜峰所代表的不同脂肪酸的具體種類。各個(gè)色譜峰的高低則表明此脂肪酸的含量，按照其峰面積計(jì)算出它的含量，進(jìn)而可計(jì)算出每一種脂肪酸的百分含量 (表2)。這些數(shù)據(jù)表明，與轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1- EGFP的細(xì)胞相比，同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-F2F1- E5E2和pcDNA3.1-sD15-sEgD4質(zhì)粒的細(xì)胞中，,,和這6個(gè)目的基因的表達(dá) (或超表達(dá)) 顯著地促使LA (18:2n-6)向長鏈多不飽和脂肪酸的生物合成方向轉(zhuǎn)化。對(duì)圖1和表2分析可知，一部分LA (18:2n-6)被Δ15去飽和酶轉(zhuǎn)化為ALA (18:3n-3)，然后在Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶的交替作用下，按照ω-3代謝途徑合成其下游長鏈的ω-3多不飽和脂肪酸如EPA (20:5n-3) 和DPA (22:5n-3) 接著被Δ4脂肪酸去飽和酶直接轉(zhuǎn)化為DHA (22:6n-3)；另一部分LA (18:2n-6) 可以在Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶的交替作用下，按照ω-6代謝途徑合成20:3n-6和20:4n-6，同時(shí)，這些產(chǎn)物還可以被Δ15去飽和酶轉(zhuǎn)化為20:4n-3 (未檢測(cè)到) 和20:5n-3，繼而進(jìn)入ω-3代謝途徑，直至合成DHA?？傮w看來，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組相比較，添加的LA顯著下降，而ω-3系的多不飽和脂肪酸如ALA (18:3n-3)、EPA (20:5n-3)、DPA (22:5n-3) 和DHA (22:6n-3) 的含量均顯著升高，其中DHA (22:6n-3) 的含量從16.74%提高到25.3%。此外，本研究結(jié)果還表明，6個(gè)目的基因的表達(dá)或超表達(dá)顯著降低了ω-6與ω-3多不飽和脂肪酸之間的比率，即從對(duì)照組的1.85降至實(shí)驗(yàn)組的0.84。
圖2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP (A) 或pcDNA3.1-F2F1-E5E2+pcDNA3.1-sD15-sEgD4 (B) 質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中多不飽和脂肪酸的色譜圖 (局部)
表2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP或pcDNA3.1-F2F1-E5E2+ pcDNA3.1-sD15-sEgD4質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中多不飽和脂肪酸的組成及含量變化
Notes: values are means of three measurements; values for each fatty acid with different superscript differ significantly (﹤0.05) between control (EGFP) and F2F1-E5E2+sD15-sEgD4.
3 討論
如何獲取豐富的DHA等長鏈多不飽和脂肪酸資源是當(dāng)今世界范圍內(nèi)人們所關(guān)心的一個(gè)問題。相關(guān)的研究顯示，通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)在哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)這些長鏈多不飽和脂肪酸是有可能的。1997年，Spychalla等從線蟲中篩選克隆了第一個(gè)動(dòng)物Δ15去飽和酶 (通常也稱為ω-3去飽和酶) 基因，命名為[21]，在后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)基因可以將16–20碳ω-6 PUFAs去飽和變成ω-3 PUFAs。Kang等將基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，ω-6/ω-3PUFAs比從15:1下降到1:1，使哺乳動(dòng)物中的ω-3 PUFAs含量顯著提高[20]。之后又于2004年將基因轉(zhuǎn)入小鼠，使得ALA、EPA、DPA 等ω-3 PUFAs均顯著提高[22]。2006年，Lai等制備的的轉(zhuǎn)基因豬，也表現(xiàn)出了與轉(zhuǎn)基因小鼠類似的情況[23]。然而，這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)所合成的ω-3 PUFAs中以18C和20C的ω-3 PUFAs為主，而更為重要的22C的DHA總量仍然很少。事實(shí)上，后續(xù)的一些研究表明的Δ15去飽和酶活性并不能增加這些動(dòng)物體內(nèi)的DHA含量。因此，基因在用于提高哺乳動(dòng)物長鏈多不飽和脂肪酸含量的實(shí)踐中，關(guān)鍵性的缺憾就是不能增加DHA的含量。
在哺乳動(dòng)物中，阻礙DHA高效生物合成的原因大概有3個(gè)：一是Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶的活性可能受到某種機(jī)制的抑制，尤其是Δ6脂肪酸去飽和酶的活性。Δ6脂肪酸去飽和酶基本上是被公認(rèn)的在哺乳動(dòng)物長鏈多不飽和脂肪酸的生物合成過程中的第一個(gè)限速酶[24]。針對(duì)這一原因，我們前期研究將上述4種酶在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行超表達(dá)研究，結(jié)果證實(shí)了哺乳動(dòng)物自身形成了某種平衡機(jī)制，抑制長鏈多不飽和脂肪酸如DHA、ARA等的大量的高水平合成，但是通過對(duì)Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶的超表達(dá)，能夠打破哺乳動(dòng)物這種平衡機(jī)制，從而顯著提高DHA、ARA等的合成水平。二是哺乳動(dòng)物缺失Δ15脂肪酸去飽和酶活性，不能將體內(nèi)攝入的ω-6多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為合成DHA的前體脂肪酸如EPA和DPA等。人類食品以及動(dòng)物飼料脂肪酸中通常含有大量的亞油酸 (LA,18:2n-6)，并由此合成花生四烯酸 (AA, 20:4n-6) 等ω-6系多不飽和脂肪酸，而ω-3系多不飽和脂肪酸含量很低，例如在西方人體ω-6與ω-3系多不飽和脂肪酸的比率通常高達(dá)10?20，這種比率的失衡不利于身體健康[25]。上文中所提及的線蟲的Δ15去飽和酶活性被引入動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞后就能夠?qū)ⅵ?6系多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為ω-3系多不飽和脂肪酸，從而改變兩者之比率。三是哺乳動(dòng)物在ω-3長鏈多不飽和脂肪酸生物合成途徑中從DPA轉(zhuǎn)化為DHA這一環(huán)節(jié)的低效性，即“Sprecher”通路對(duì)高效轉(zhuǎn)化DPA為DHA的具有某種制約性。但是在自然界中，一些生物，例如一種原生動(dòng)物小眼蟲、海洋真菌破囊壺菌和巴夫藻，在合成DHA時(shí)并不需要經(jīng)過“Sprecher 通路”，而是直接利用Δ4去飽和酶活性將DPA轉(zhuǎn)化成為DHA，因此這類生物中DHA含量一般比較 高[26-28]。前面提及基因在哺乳動(dòng)物中表達(dá)后能夠生成很高水平的DPA，但不能進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成為DHA。我們前期研究已經(jīng)證實(shí)，源自于小眼蟲Δ4去飽和酶活性正好可以與基因 (我們研究中所用的sD15與之同源，但進(jìn)行了密碼子優(yōu)化) 配合，將累積的DPA直接轉(zhuǎn)化成為DHA。
本研究正是致力于解決上述阻礙DHA高效生物合成的3個(gè)因素或環(huán)節(jié)，目標(biāo)是使哺乳動(dòng)物細(xì)胞甚至是哺乳動(dòng)物個(gè)體通過遺傳改造后能夠高效地利用自然界大量存在的亞油酸 (LA, 18:2n-6)，將其轉(zhuǎn)化為DHA (22:6n-3)，使動(dòng)物脂肪變成對(duì)人體健康有益成為可能。此項(xiàng)研究明確證實(shí)，Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶、Δ6和Δ5脂肪酸延長酶以及Δ15和Δ4脂肪酸去飽和酶這6種酶活性在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)或超表達(dá)顯著地提高了這種轉(zhuǎn)化能力，既能夠?qū)ⅵ?6系多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為ω-3系多不飽和脂肪酸，又能夠?qū)⒍替湹腖A或ALA轉(zhuǎn)化為長鏈的ARA、EPA、DPA等，最后還能將細(xì)胞中積累的DPA直接轉(zhuǎn)化為DHA?？梢哉f，這種思路是在哺乳動(dòng)物及其細(xì)胞中將LA (18:2n-6)代謝轉(zhuǎn)化為DHA (22:6n-3) 的最佳轉(zhuǎn)基因組合。當(dāng)然，多個(gè)目的基因用于制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將變得更加困難，還需要解決一些技術(shù)問題。
我們的研究以及技術(shù)路線除了為將來改造陸地型動(dòng)物以提供DHA等長鏈多不飽和脂肪酸提供理論和數(shù)據(jù)支持外，還可以將其應(yīng)用于DHA等長鏈多不飽和脂肪酸生物學(xué)功能的相關(guān)基礎(chǔ)研究中，因?yàn)檫@種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本身就是一個(gè)很好的動(dòng)物模型。因此，本研究不僅具有潛在的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值，也為相關(guān)理論研究奠定了基礎(chǔ)。
REFERENCES
[1] VaughanVC, Hassing MR, Lewandowski PA. Marine polyunsaturated fatty acids and cancer therapy. Br J Cancer, 2013, 108(3): 486–492.
[2] Rogers LK, Valentine CJ, Keim SA. DHA supplementation: current implications in pregnancy and childhood.Pharmacol Res, 2013, 70(1): 13–19.
[3] Catalan J, Moriguchi T, Slotnick B, et al. Cognitive deficits in docosahexaenoic aciddeficient rats. Behav Neurosci, 2002, 116(6): 1022–1031.
[4] Innis SM. The role of dietary n-6 and n-3 fatty acids in the developing brain. Dev Neurosci, 2000, 22(5/6): 474–480.
[5] Birch EE, Garfield S, Castaneda Y, et al. Visual acuity and cognitive outcomes at 4 years of age in a double-blind, randomized trial of long-chain polyunsaturated fatty acid-supplemented infant formula. Early Hum Dev, 2007, 83(5): 279–284.
[6] Moriguchi T, Greiner RS, Salem NJr. Behavioral deficits associated with dietary induction of decreased brain docosahexaenoic acid concentration. J Neurochem, 2000, 75(6): 2563–2573.
[7] Lim GP, Calon F, Morihara T, et al. A diet enriched with the omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid reduces amyloid burden in an aged Alzheimer mouse model. J Neurosci, 2005, 25(12): 3032–3040.
[8] Rose DP, Connolly JM, Raybum J, et al. Infuence of diets containing eicosapentaenoic acid on growth and metastasis of breast cancer cells in nude mice. J Nat Cancer Inst, 1995, 87(8): 587–592.
[9] Gonzalez MJ, Schemmel RA, Dugan L Jr, et al. Dietary fish oil inhibits human breast carcinoma growth: a function of increased lipid peroxidation. Lipids, 1993, 28(9): 827–832.
[10] Ruxton CH, Reed SC, Simpson MJ, et al. The health benefits of omega-3 polyunsaturated fatty acids: a review of the evidence. J Hum Nutr Diet, 2004, 17(5): 449–459.
[11] Mozaffarian D, Wu JH. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease: effects on risk factors, molecular pathways, and clinical events. J Am Coll Cardiol, 2011, 58(20): 2047–2067.
[12] Vance DE, Vance JE. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins, and Membranes. 4th ed. Amsterdam: Elsevier, 2004: 181–204.
[13] Sprecher H. Metabolism of highly unsaturated n-3 and n-6 fatty acids. Biochim Biophys Acta, 2000, 1486(2/3): 219–231.
[14] Emken EA, Adlof RO, Gulley RM. Dietary linoleic acid influences desaturation and acylation of deuterium-labeled linoleic and linolenic acids in young adult males. Biochim Biophys Acta, 1994, 1213(3): 277–288.
[15] Pawlosky RJ, Hibbeln JR, Novotny JA, et al. Physiological compartmental analysis of alpha-linolenic acid metabolism in adult humans. J Lipid Res, 2001, 42(8): 1257–1265.
[16] Hussein N, Ah-Sing E, Wilkinson P, et al. Long-chain conversion of [13C]linoleic acid and alpha-linolenic acid in response to marked changes in their dietary intake in men. J Lipid Res, 2005, 46(2): 269–280.
[17] Zhu GM, Saleh AAM, Bahwal SA, et al.Overexpression of four fatty acid synthase genes elevated the efficiency of long-chain polyunsaturated fatty acids biosynthesis in mammalian cells. Chin J Biotech, 2014, 30(9): 1464–1472(in Chinese).朱貴明, Saleh AAM, Bahwal SA, 等. 四個(gè)脂肪酸合成酶基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的超表達(dá)提高長鏈多不飽和脂肪酸生物合成效率. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(9): 1464–1472.
[18] Zhu GM, Ou Q, Zhang T, et al. A more desirable balanced polyunsaturated fatty acid composition achieved by heterologous expression of Δ15/Δ4 desaturases in mammaliancells, PLoS ONE, 2013 8(12): e84871.
[19] Wang KF, Zhu GM, Zhang L, et al. Construction of fatty acid synthesis enzymes multigene expression vector. Chin J Gerontol, 2013, 33(17): 4178–4180 (in Chinese).汪坤福, 朱貴明, 張莉, 等. 脂肪酸合成酶系多基因表達(dá)載體的構(gòu)建. 中國老年學(xué)雜志, 2013, 33(17): 4178–4180.
[20] Kang ZB, Ge Y, Chen Z, et al. Adenoviral gene transfer ofn-3 fatty acid desaturase optimizes fatty acid composition in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 98(7): 4050–4054.
[21] Spychalla JP, Kinney AJ, Browse J. Identfication of an animal n-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(4): 1142–1147.
[22] Kang JX, Wang J, Wu L, et al. Transgenic mice Fat-1 mice convert n-6 to n-3 fatty acids. Nature, 2004, 427(6974): 504.
[23] Lai L, Kang JX, Li R, et al.Generation of cloned transgenic pigs rich in omega-3 fatty acids. Nat Biotechnol,2006, 24(4): 435–436.
[24] Tocher DR, Leaver MJ, Hodgson PA. Recent advances in the biochemistry and molecular biology of fatty acyl desaturase. Prog Lipid Res, 1998, 37(2/3): 73–117.
[25] Simopoulos AP. Evolutionary aspects of diet: the omega-6/omega-3 ratio and the brain. Mol Neurobiol, 2011, 44(2): 203–215.
[26] Meyer A, Cirpus P, Ott C, et al. Biosynthesis of docosahexaenoic acid in: biochemical and molecular evidence for the involvement of a Δ4-fatty acyl group desaturase. Biochemistry, 2003, 42(32): 9779–9788.
[27] Tonon T, Harvey D, Larson TR, et al. Identification of a very long chain polyunsaturated fatty acid Δ4-desaturase from the microalga. FEBS Lett, 2003, 553(3): 440–444.
[28] Qiu X, Hong H, MacKenzie SL. Identification of a Δ4 fatty acid desaturase fromsp. involved in the biosynthesis of docosahexanoic acid by heterologous expression inand. J Biol Chem, 2001, 276(34): 31561–31566.
(本文責(zé)編 陳宏宇)
Reconstitution of polyunsaturated fatty acid synthesis enzymes in mammalian cells to convert LA to DHA
Guiming Zhu, Abdulmomen Ali Mohammed Saleh, Said Ahmed Bahwal, Lihong Qiu, Jie Sun, Yu Shang, Xudong Jiang, Tangdong Ge, and Tao Zhang
,,154007,,
DHA (22:6n-3) is a ω-3 polyunsaturated fatty acid with22 carbon atoms and 6 double bonds, which has important biological functions in human body. Human and other mammals synthesize only limited amounts of DHA, more requirements must be satisfied from food resources. However, the natural resources of DHA (Mainly deep-sea fish and other marine products) are prone to depletion. New resources development is still insufficient to satisfy the growing market demand. Previous studies have revealed that the mammals can increase the synthesis of DHA and other long-chain polyunsaturated fatty acids after transgenic procedures. In this study, mammalian cells were transfected with Δ6, Δ5 desaturase, Δ6, Δ5 elongase, Δ15 desaturase (Isolated from nematode) and Δ4 desaturase (Isolated from), simultaneously. Results show that the expression or overexpression of these 6 enzymes is capable of conversion of the ω-6 linoleic acid (LA, 18:2n-6) in DHA (22:6n-3). DHA content has increased from 16.74% in the control group to 25.3% in the experimental group. The strategy and related technology in our research provided important data for future production the valuable DHA (22:6n-3) by using genetically modified animals.
polyunsaturated fatty acid, fatty acid desaturase, fatty acid elongase, multiple-gene expression vector, transgene
April 19, 2014; Accepted: July 11, 2014
Guiming Zhu. Tel: +86-454-8618331; E-mail: xi78926@sina.com
Supported by:Science and Technology Research Project of Heilongjiang Provincal Education Department (No. 12511563).
黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目 (No. 12511563) 資助。
網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-08-01
http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140235.html
猜你喜歡
科學(xué)大眾·小諾貝爾(低幼)(2024年10期)2024-01-01 00:00:00
昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(2021年4期)2021-07-23 01:21:44
天然產(chǎn)物研究與開發(fā)(2018年9期)2018-10-08 03:26:00
小學(xué)科學(xué)(學(xué)生版)(2018年5期)2018-06-15 08:48:00
奇妙博物館(2018年12期)2018-04-25 02:16:04
奇妙博物館(2018年12期)2018-04-25 02:16:02
合成化學(xué)(2015年10期)2016-01-17 08:56:06
分析測(cè)試學(xué)報(bào)(2015年8期)2016-01-13 06:19:29
中國塑料(2015年10期)2015-10-14 01:13:16
醫(yī)學(xué)研究雜志(2015年4期)2015-06-10 06:42:43
