PPENK-MIDGE-NLS基因載體的構(gòu)建及其在活體大鼠的表達(dá)

陳曦，徐學(xué)敏，彭細(xì)娟，蔣瑋，姚立農(nóng)

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-MIDGE-NLS基因載體的構(gòu)建及其在活體大鼠的表達(dá)

陳曦，徐學(xué)敏，彭細(xì)娟，蔣瑋，姚立農(nóng)

第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院麻醉科，陜西西安 710038

陳曦, 徐學(xué)敏, 彭細(xì)娟, 等. PPENK-MIDGE-NLS基因載體的構(gòu)建及其在活體大鼠的表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(2): 258–268Chen X, Xu XM, Pu XJ. Construction of PPENK-MIDGE-NLS gene vector and the expression in rat. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 258–268.

增加體內(nèi)免疫細(xì)胞合成分泌內(nèi)源性阿片肽，可對(duì)心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用?；蛑委熓窃黾觾?nèi)源性腦啡肽(Enkephalin, ENK) 的一種有前景的研究方向，但是以往的病毒、質(zhì)粒等載體受到其自身免疫原性的限制并存在基因重組、原癌基因激活、抗細(xì)菌蛋白抗體產(chǎn)生以及基因表達(dá)改變等諸多問題。本研究采用非病毒、非質(zhì)粒的微量免疫原定義的基因表達(dá) (Minimalistic immunological defined gene expression, MIDGE) 方法構(gòu)建前腦啡肽原 (Preproenkephalin, PPENK)-MIDGE-NLS基因載體能克服病毒和質(zhì)粒載體的上述缺點(diǎn)。用PCR技術(shù)擴(kuò)增大鼠前腦啡肽原 (Preproenkephalin, PPENK) 外顯基因，產(chǎn)物插入pEGFP-N1質(zhì)粒，雙酶切質(zhì)粒獲得包含啟動(dòng)子、目的基因、RNA穩(wěn)定序列的線性載體，兩端以不受外切酶作用的發(fā)夾樣脫氧寡核苷酸序列 (Oligodesoxynucleotides, ODNs) 封閉。為保證載體的入核和表達(dá)效率，載體的一端連接了核定位序列 (Nuclear localization sequence, NLS)。流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率，Western blotting檢測(cè)組織內(nèi)前腦啡肽蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，-MIDGE-NLS能夠轉(zhuǎn)染大鼠活體細(xì)胞并表達(dá)前腦啡肽蛋白，增加載體的量能夠在一定范圍內(nèi)提高轉(zhuǎn)染效率。研究結(jié)果表明該載體可能成為預(yù)防和治療心肌缺血再灌注損傷的新方法。

心肌缺血再灌注損傷，腦啡肽，基因載體，白細(xì)胞

心肌缺血再灌注損傷是臨床常見的棘手難題。缺血預(yù)處理 (Ischemic preconditioning, IPC) 和缺血后處理(Ischemic postconditioning, IPTC) 均是心肌缺血再灌注損傷最有效的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制[1-3]。但是，不論IPC還是IPTC，在臨床應(yīng)用中都受到倫理和方法的制約，而且有增加心肌損害的可能。大量研究證實(shí)阿片受體 (Opioid receptor, OR) 參與介導(dǎo)了IPC和IPTC效應(yīng)，而且外源性阿片類藥物能完全模擬IPC和IPTC的心肌保護(hù)作用，減輕心肌壞死程度、減少心律失常、改善再灌注期心肌功能[4-7]。但是，產(chǎn)生IPC效應(yīng)的阿片類藥物劑量明顯大于臨床常規(guī)用 量[8]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的諸多副作用隨即難以避免，該臨床難題嚴(yán)重困擾了阿片類藥物心肌保護(hù)作用的臨床轉(zhuǎn)化，所以有必要探索一種能在體內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生阿片類物質(zhì)而且靶向釋放于心肌缺血局部的方法，以充分利用IPC和IPTC效應(yīng)減輕心肌缺血再灌注損傷，發(fā)揮其心肌保護(hù)作用?；蜣D(zhuǎn)染則有可能成為增加內(nèi)源性阿片類物質(zhì)的有效方法。

心肌缺血再灌注損傷的局部重要特征之一是粒細(xì)胞活化、心肌浸潤(rùn)及脫顆粒，而粒細(xì)胞系是體內(nèi)除神經(jīng)系統(tǒng)外最大的內(nèi)源性阿片肽 (Endogenous opioid peptide, EOP) 來源[9]，此外，各種免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等都可合成分泌腦啡肽 (Enkephalin, ENK)，內(nèi)源性EOP無任何中樞神經(jīng)系統(tǒng)的副作用[10]。因此免疫細(xì)胞是攜帶內(nèi)源性阿片肽而且能靶向聚集到缺血區(qū)域的存儲(chǔ)庫和天然載體。

為促使免疫細(xì)胞持續(xù)、大量產(chǎn)生內(nèi)源性腦啡肽，基因重組是最有力的手段。最常用的基因載體是重組病毒載體，但病毒載體具有免疫原性，而且存在與野生型病毒重組的可能性，致癌基因的激活、相對(duì)小的DNA容量也是明顯不足。非病毒載體不會(huì)整合入宿主細(xì)胞內(nèi)，安全性優(yōu)于病毒載體，同時(shí)它不具有傳染性，載體容量大。但是存在抗細(xì)菌蛋白抗體的產(chǎn)生、抗生素耐藥性標(biāo)志物引起基因表達(dá)改變、對(duì)CpG二核苷酸的免疫反應(yīng)等具體問題。

非病毒、非質(zhì)粒的微量免疫原定義的基因表達(dá) (Minimalistic immunologically defined gene expression, MIDGE) 可克服上述兩種基因載體的缺點(diǎn)[11]。MIDGE載體是包含啟動(dòng)子、目的基因和RNA穩(wěn)定序列的線性分子，兩側(cè)是短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列。MIDGE載體比質(zhì)粒的明顯優(yōu)勢(shì)是體積小、缺乏抗菌素耐藥基因和相對(duì)低的CpG序列。為確保載體基因有效轉(zhuǎn)染到細(xì)胞核，本研究中在MIDGE上附加了一個(gè)核定位序列 (Nuclear localization sequence, NLS)[12]。

本課題設(shè)想利用PPENK-MIDGE-NLS基因載體轉(zhuǎn)染白細(xì)胞，增加心肌缺血局部腦啡肽及其活性產(chǎn)物的含量，探討轉(zhuǎn)染白細(xì)胞合成的內(nèi)源性腦啡肽的心肌保護(hù)作用，是心肌缺血再灌注損傷研究領(lǐng)域的有力突破，將有力促進(jìn)阿片肽心肌保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究成果的臨床轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 材料

pEGFP-N1質(zhì)粒由第四軍醫(yī)大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室提供。SD大鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。寡核苷酸序列ODNs，目的基因前腦啡肽基因，PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，二價(jià)交聯(lián)劑Sulf-MBS購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶Ⅰ、Ⅱ，外切酶Ⅲ購自New England Biolabs公司。T4 DNA連接酶、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn) (20 bp Ladder, DL10 000 marker)、PCR產(chǎn)物清潔試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司。蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) (6 500?66 000Da)，β-actin，抗PENK抗體購自Sigma公司。質(zhì)粒中提試劑盒購自QIAGEN公司。瓊脂糖粉為Biowest agarose。Western及IP細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF (Phenylmethanesulfonyl fluoride)、二抗購自碧云天生物技術(shù)研究所，藻紅蛋白 (PE) -cy5-標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD45、小鼠抗大鼠CD3-PE、PE-標(biāo)記的小鼠抗大鼠RP-1、二抗大鼠抗小鼠IgG2a+b PE購自BD Biosciences，熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD68購自abd serotec，3E7購自Gramsch Laboratories。動(dòng)物組織、外周血白細(xì)胞分離液試劑盒購自灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純以上。

1.2 載體兩端發(fā)夾樣保護(hù)結(jié)構(gòu)ODNs的合成

已知組成tRNA中存在著一些能局部互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域，這些局部雙鏈呈莖狀，中間不能配對(duì)的部分則膨出形成環(huán)或袢狀結(jié)構(gòu)，稱為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。模擬真核生物細(xì)胞內(nèi)tRNA相對(duì)穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，構(gòu)建載體兩端穩(wěn)定的ODN序列，分別在其兩端加上與目的基因表達(dá)框兩端的酶切位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)，能夠封閉目的基因表達(dá)框兩端的線性缺口，從而有效地防止體內(nèi)核酸外切酶的降解，增強(qiáng)基因載體在體內(nèi)的穩(wěn)定性[13]。ODN1序列為：TAGCGCTCAGTTGGGAGAGCGCTAAT, ODN2序列為: TTAAGGCGCTCAGTTGGGAGA GCGCC。單鏈寡核苷酸序列通過退火形成二維發(fā)夾樣結(jié)構(gòu) (圖1)。

圖1 ODNs序列二維結(jié)構(gòu)

1.3 核定位序列的連接

核定位序列NLS (PKKKRKVEDYPC) 為一短的氨基酸序列，能與入核載體相互作用，保證了入核的效率和外源基因的表達(dá)。為了將其連接在載體上，需先以二價(jià)交聯(lián)劑Sulf-MBS將其與保護(hù)結(jié)構(gòu)ODN1連接，再將連接產(chǎn)物與目的基因表達(dá)框連接。二價(jià)交聯(lián)劑通過與ODN上的氨基形成酰胺鍵，同時(shí)和NLS的硫形成硫醚鍵，從而實(shí)現(xiàn)了ODN1與NLS的連接，因此，需對(duì)ODN1的第十二位T進(jìn)行氨基修飾。

1.4 目的基因表達(dá)框的獲得

限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅱ雙酶切pEGFP-N1質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收約1.6 kb左右的片段，即為含啟動(dòng)子、基因、RNA穩(wěn)定序列的基因表達(dá)框。雙酶切重組質(zhì)粒pEGFP-N1-PPENK，1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收約2.4 kb左右的片段，即為含啟動(dòng)子、-基因、RNA穩(wěn)定序列的基因表達(dá)框。

1.5-MIDGE-NLS基因載體的構(gòu)建

加入目的基因表達(dá)框及3倍摩爾質(zhì)量的ODNs保護(hù)序列，在T4 DNA連接酶的作用下16 ℃過夜反應(yīng)，進(jìn)行連接。用Ⅲ外切酶處理消化未連接片段。PCR產(chǎn)物清潔試劑盒純化MIDGE-NLS載體。

為保證載體攜帶基因，利用PCR擴(kuò)增基因。PCR產(chǎn)物用31Ⅰ酶切，Ⅰ和Ⅰ消化后結(jié)扎、克隆入pEGFP-N1質(zhì)粒。重復(fù)以上步驟，以獲得多拷貝- MIDGE-NLS基因載體。-MIDGE-NLS基因載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。

圖2 PPENK-MIDGE-NLS基因載體結(jié)構(gòu)示意圖

1.6-MIDGE-NLS基因載體轉(zhuǎn)染效果的檢測(cè)

1.6.1 載體局部注射時(shí)對(duì)免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

12只SD大鼠，隨機(jī)分為兩組，每組6只。在每只大鼠右后足底部注射100 μL完全弗氏佐劑誘導(dǎo)局部炎癥，4 d后實(shí)驗(yàn)組大鼠注射50 μg-MIDGE-NLS基因載體，對(duì)照組注射 50 μL 0.9%生理鹽水。24 h后用過量戊巴比妥鈉處死大鼠，兩組大鼠各取3只右后足底部皮膚及皮下組織做冰凍切片，DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白有無表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組另外3只大鼠分別取右后足炎性組織做細(xì)胞懸液[14]，藻紅蛋白 (PE) -cy5-標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD45標(biāo)記所有血細(xì)胞，小鼠抗大鼠CD3-PE標(biāo)記T細(xì)胞。按標(biāo)準(zhǔn)制備細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)染色[15]。PE-標(biāo)記的小鼠抗大鼠RP-1孵育，熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD68 (識(shí)別單核/巨噬細(xì)胞) 或3E7 (單克隆抗體識(shí)別阿片肽固有序列Tyr-Gly-Gly-Phe)。二抗為大鼠抗小鼠IgG2a+b PE抗體。同種非免疫血清對(duì)照。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)每種白細(xì)胞表達(dá)綠色熒光的百分比。

Western blotting檢測(cè)PENK 蛋白表達(dá)：分別采集正常大鼠、對(duì)照組大鼠、實(shí)驗(yàn)組大鼠和炎癥部位注射PENK抗體的實(shí)驗(yàn)組大鼠的炎癥及相應(yīng)部位的皮膚及皮下組織，DPBS中切碎、勻漿、離心，–80 ℃保存。測(cè)定時(shí)取樣50 μg，變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，電泳后4 ℃封閉過夜。加入1∶1 000抗-PENK多克隆抗體，雜交。封閉液漂洗后加入1∶2 000二抗。漂洗后加顯色劑氯化硝基四氮唑藍(lán) (NBT)。圖像掃描儀掃描顯影條帶。

1.6.2 載體靜脈注射時(shí)對(duì)白細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及心肌浸潤(rùn)

12只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組3只。其中3組實(shí)驗(yàn)組均給予尾靜脈注射100 μg (500 ng/μL)-MIDGE-NLS基因載體，對(duì)照組尾靜脈注射2 mL 0.9%生理鹽水。注射-MIDGE-NLS后24、48、72 h采集血液標(biāo)本，制備細(xì)胞懸液。按上述方法標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)-MIDGE-NLS對(duì)各種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。

另將15只SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組3只。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別給予靜脈注射- MIDGE-NLS基因載體50、100、200、400 μg，注射容積2 mL，對(duì)照組注射2 mL 0.9%生理鹽水。24 h后采集血液標(biāo)本，制備細(xì)胞懸液，按照上述方法進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)載體注射劑量與轉(zhuǎn)染效果的關(guān)系。

將6只SD大鼠隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組大鼠靜脈注射基因載體200 μg (1 000 ng/μL)，對(duì)照組注射2 mL 0.9%生理鹽水，24 h后用1%戊巴比妥鈉麻醉 (40 mg/kg)，用4%多聚甲醛灌注，取心肌組織在多聚甲醛中固定4 h，30%蔗糖溶液脫水。做冰凍切片 (10 μm) 后用PE-cy5-標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD45標(biāo)記白細(xì)胞，DAPI染色細(xì)胞核，在激光共聚焦下觀察白細(xì)胞在心肌的浸潤(rùn)及腦啡肽的表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1-MIDGE-NLS基因載體

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了-MIDGE-NLS基因載體，圖3為載體瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，其中泳道1為DL10 000 DNA marker，泳道2為MIDGE-NLS基因載體，泳道3為連接ODNs之前目的基因表達(dá)框。MIDGE的分子量約為 1 600 bp，連接NLS后在瓊脂糖中的電泳速度會(huì)變慢，因此MIDGE-NLS的電泳結(jié)果顯示的分子量大于1 600 bp，構(gòu)建成功的載體與基因表達(dá)框相差大概50 bp。

圖3 MIDGE-NLS基因載體電泳檢測(cè)

2.2 局部注射-MIDGE-NLS基因載體的轉(zhuǎn)染效果

為了探討局部注射-MIDGE-NLS基因載體能否轉(zhuǎn)染活體細(xì)胞，我們通過誘導(dǎo)局部炎癥增加炎癥局部的白細(xì)胞的數(shù)量，炎癥部位注射基因載體24 h后，激光共聚焦顯微鏡下我們觀察到的結(jié)果如圖4所示，圖4C為觀察到的綠色熒光蛋白表達(dá) (綠色信號(hào)所示) 的圖像，圖4B為DAPI染色進(jìn)行的細(xì)胞核定位，4A為后兩圖的融合圖像。而注射生理鹽水組大鼠未觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá) (圖4F)，證實(shí)了載體對(duì)活體細(xì)胞的成功轉(zhuǎn)染和表達(dá)。圖片右下角的比例尺大小為50 μm。

圖4 載體在炎癥組織的表達(dá)

流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了炎癥局部單核/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、粒細(xì)胞的聚集，由各種白細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞所占的比例可知其轉(zhuǎn)染效率。由表1可知載體對(duì)各種白細(xì)胞均有轉(zhuǎn)染，其中對(duì)粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率最高，而T細(xì)胞只有少量被轉(zhuǎn)染。對(duì)照組阿片肽陽性細(xì)胞3組平均值為2.57%，說明白細(xì)胞本身就有一定量的阿片肽表達(dá)，由實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的阿片肽陽性細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率的對(duì)比可知，-MIDGE-NLS基因載體增加了局部阿片肽的表達(dá)。

圖5為Western blotting檢測(cè)PENK蛋白表達(dá)的結(jié)果，圖中0、1、2、3分別為正常皮膚組織、對(duì)照組炎癥組織、實(shí)驗(yàn)組炎癥組織、注射載體前先注射抗PENK抗體的實(shí)驗(yàn)組炎癥組織中的PENK蛋白表達(dá)量。由圖5可清楚地看出注射基因載體后 (2) 組織中PENK蛋白的表達(dá)量明顯大于正常組織 (0) 和對(duì)照組 (1)。

表1 載體對(duì)白細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率

圖5 皮膚及皮下組織中PENK蛋白表達(dá)的檢測(cè)

2.3 靜脈注射-MIDGE-NLS基因載體對(duì)白細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果及心肌浸潤(rùn)

本研究的最終目的是要探討- MIDGE-NLS基因載體是否能通過轉(zhuǎn)染白細(xì)胞從而在心肌靶向產(chǎn)生腦啡肽，因此，靜脈注射載體后能否成功轉(zhuǎn)染白細(xì)胞并且在心肌組織浸潤(rùn)非常關(guān)鍵。靜脈注射基因載體200 μg后24 h，心肌組織的冰凍切片中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)染成功的白細(xì)胞。圖6為心肌組織冰凍切片在激光共聚焦下拍攝的圖像。圖6D為心肌組織中綠色熒光蛋白表達(dá)的圖像，圖6C為心肌組織中的白細(xì)胞，圖6B顯示細(xì)胞核DAPI染色，圖6A為B、C、D的融合圖像。證明轉(zhuǎn)染成功的白細(xì)胞在心肌組織的存在。而對(duì)照組大鼠的心肌組織切片中的白細(xì)胞未見綠色熒光蛋白的表達(dá)。圖中右下角比例尺為10 μm。

表2為由流式細(xì)胞術(shù)得到的-MIDGE-NLS基因載體對(duì)各種白細(xì)胞轉(zhuǎn)染的百分率的檢測(cè)結(jié)果的平均值，由圖7可直觀看出注射載體24 h后粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞中綠色熒光蛋白和阿片肽的表達(dá)率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，而T細(xì)胞對(duì)綠色熒光蛋白的表達(dá)卻升高。但是，粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞仍為基因載體轉(zhuǎn)染的主要細(xì)胞。表3為不同劑量載體注射后 24 h轉(zhuǎn)染細(xì)胞的百分比數(shù)據(jù)表，以其平均值作圖即為圖8，可知在載體的注射量為50?200 μg時(shí)，載體的轉(zhuǎn)染率隨注射量的增加而提高，當(dāng)載體注射量為400 μg時(shí)，轉(zhuǎn)染率不再隨劑量的增加而提高。

圖6 載體在心肌組織中的表達(dá)

表2 載體對(duì)白細(xì)胞轉(zhuǎn)染率隨時(shí)間的變化

圖7 載體對(duì)白細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的觀察

表3 載體對(duì)白細(xì)胞轉(zhuǎn)染率的量效關(guān)系

圖8 載體對(duì)白細(xì)胞轉(zhuǎn)染的量效關(guān)系

3 討論

腦啡肽、強(qiáng)啡肽、孤啡肽對(duì)缺血性心肌和腦損傷的保護(hù)作用已得到充分證實(shí)[16-19]，為促使免疫細(xì)胞持續(xù)、大量產(chǎn)生內(nèi)源性腦啡肽，基因重組是最有力的手段。最常用的基因載體是重組病毒載體，病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但病毒載體具有免疫原性，而且存在與野生型病毒重組的可能性，致癌基因的激活、相對(duì)小的DNA容量也是明顯不足。質(zhì)粒編碼的也已用于動(dòng)物的疼痛治療，它雖然克服了載體基因容量的限制，但是質(zhì)粒載體存在抗細(xì)菌蛋白抗體的產(chǎn)生、抗生素耐藥性標(biāo)志物引起基因表達(dá)改變、對(duì)CpG二核苷酸的免疫反應(yīng)等具體問題。而這些問題的存在都阻礙了病毒與質(zhì)粒載體的臨床應(yīng)用。因此，構(gòu)建一種安全可靠、轉(zhuǎn)染效率高的基因載體是基因治療技術(shù)的關(guān)鍵。

非病毒、非質(zhì)粒的微量免疫原定義的基因表達(dá) (Minimalistic immunologically defined gene expression, MIDGE) 可克服上述兩種基因載體的缺點(diǎn)[20]。MIDGE載體是包含啟動(dòng)子、目的基因和RNA穩(wěn)定序列的線性分子，其安全性優(yōu)于病毒載體，比質(zhì)粒的明顯優(yōu)勢(shì)是體積小、缺乏抗菌素耐藥基因和相對(duì)低的CpG序列。由于載體為兩端封閉的啞鈴狀線性載體，分子量較小，因此易穿過細(xì)胞核膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，提高了表達(dá)效率，而核定位序列NLS的連接更是確保了載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞核[21]。封閉載體兩端的ODNs是模擬真核細(xì)胞內(nèi)tRNA穩(wěn)定C環(huán)結(jié)構(gòu)合成，封閉了線性核酸的開放性末端，使其具有抗真核細(xì)胞內(nèi)核酸外切酶的作用，增加了基因載體的穩(wěn)定性。因此，-MIDGE-NLS基因載體為基因治療運(yùn)用于臨床提供了更多的可能性。

由圖4可知-MIDGE-NLS基因載體局部注射時(shí)能夠成功地轉(zhuǎn)染活體細(xì)胞并表達(dá)目的基因。圖5的Western blotting結(jié)果也證明該基因載體能夠增加局部PENK蛋白的表達(dá)量。圖4A為綠色熒光蛋白表達(dá)圖像與細(xì)胞核染色的融合圖像，證明載體注射24 h后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)目的基因。載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型主要為粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞 (表1)。圖6證明載體靜脈注射可以轉(zhuǎn)染白細(xì)胞，并存在心肌組織中。但是與圖4相比較，綠色熒光蛋白在24 h時(shí)不表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，而是存在胞質(zhì)中，由此我們可以推測(cè)，靜脈注射-MIDGE-NLS基因載體后在24 h之內(nèi)成功轉(zhuǎn)染白細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞核，表達(dá)目的基因。載體注射24 h時(shí)，綠色熒光蛋白已經(jīng)分泌入胞質(zhì)。

流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果證明，靜脈注射-MIDGE-NLS基因載體對(duì)各種類型的白細(xì)胞均有轉(zhuǎn)染，但是粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞為主要靶細(xì)胞 (表2)。圖7為載體對(duì)各種白細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)限的變化趨勢(shì)，我們可以看出隨著時(shí)間的延長(zhǎng) (24?72 h)，粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染比例及阿片肽陽性細(xì)胞所占比例逐漸下降，而T細(xì)胞轉(zhuǎn)染比例卻呈現(xiàn)出輕微的上升趨勢(shì)，但是基因載體對(duì)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染作用很微弱。心肌缺血再灌注損傷時(shí)損傷部位浸潤(rùn)的白細(xì)胞主要為粒細(xì)胞，而-MIDGE-NLS基因載體增加粒細(xì)胞腦啡肽釋放的時(shí)限約為3 d，相較于病毒和質(zhì)粒載體長(zhǎng)達(dá)2周以上的表達(dá)時(shí)間來說是比較短暫的[22]。但是，使用外源性阿片類藥物時(shí)，作用僅僅維持5?10 min[23]，由此來看，-MIDGE-NLS基因載體的作用時(shí)間長(zhǎng)于外源性阿片類物質(zhì)，并且能避免其呼吸系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用，有臨床應(yīng)用價(jià)值。

表3為載體注射24 h時(shí)不同劑量下各種白細(xì)胞的轉(zhuǎn)染比例。圖8清楚地表明，在載體劑量小于200 μg時(shí)，載體對(duì)各種白細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均隨劑量的增加而提高，而當(dāng)劑量大于200 μg時(shí)，增加載體的劑量卻不能再相應(yīng)地提高轉(zhuǎn)染效率。這或許跟載體入核時(shí)是通過NLS與核孔的相互作用而實(shí)現(xiàn)有關(guān)[24]。當(dāng)載體劑量達(dá)到一定數(shù)值以后，核孔與NLS的作用處于飽和狀態(tài)，從而限制了載體進(jìn)入細(xì)胞核的量進(jìn)一步增加。

載體用綠色熒光蛋白基因標(biāo)記，轉(zhuǎn)染成功后能夠表達(dá)綠色熒光蛋白，能夠通過熒光顯微鏡、激光共聚焦以及流式細(xì)胞術(shù)快速的檢測(cè)轉(zhuǎn)染結(jié)果，使結(jié)果的檢測(cè)簡(jiǎn)便、快捷，同時(shí)具備較高的重復(fù)性。

在進(jìn)行載體靜脈注射時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)注射的藥物體積直接影響大鼠的生存率，而當(dāng)采用2 mL的注射體積并在10 s內(nèi)注射完畢時(shí)，生存率為99.99%。已有研究證明水流動(dòng)力學(xué)靜脈注射非病毒載體能夠增加小鼠各器官組織的載體表達(dá)，但是會(huì)引起小鼠肝臟出血性壞死，這是否是本研究中導(dǎo)致大鼠死亡的原因之一有待進(jìn)一步探討。本研究中我們并未做最佳注射體積和注射速度的相關(guān)探索，不排除載體的注射體積和注射速度對(duì)其轉(zhuǎn)染效率存在影響。

此外，載體靜脈注射時(shí)，在心肌只發(fā)現(xiàn)了少量的轉(zhuǎn)染成功的白細(xì)胞，這是因?yàn)樵谡Ｐ募≈兄挥猩倭康陌准?xì)胞存在，而當(dāng)心肌發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，會(huì)有大量的白細(xì)胞向心肌損傷區(qū)游動(dòng)、浸潤(rùn)，從而也會(huì)有更多的轉(zhuǎn)染成功的白細(xì)胞存在于損傷區(qū)靶向釋放腦啡肽，這也是我們構(gòu)建-MIDGE-NLS基因載體的初衷。

基因治療的安全性、效率問題使得開發(fā)出安全有效的基因載體成為基因治療的關(guān)鍵。-MIDGE-NLS基因載體攜帶外源性基因少，安全性優(yōu)于傳統(tǒng)的病毒及非病毒載體。其分子量小，易于入核，從而提高了轉(zhuǎn)染效率。它相對(duì)較低的CpG序列避免了免疫激活效應(yīng)。通過對(duì)ODNs序列的修飾，使載體具有靶向效應(yīng)，特定的轉(zhuǎn)染白細(xì)胞，增加其阿片肽的表達(dá)。利用心肌缺血再灌注損傷時(shí)白細(xì)胞向缺血區(qū)游動(dòng)、浸潤(rùn)的特點(diǎn)，在損傷區(qū)靶向釋放內(nèi)源性腦啡肽，從而保護(hù)心肌組織。本研究為心肌缺血再灌注損傷的預(yù)防和治療探索了新的方法，同時(shí)，在以后的研究中我們可以探討將MIDGE-NLS載體作為通用載體，通過插入不同的目的基因片段以及更改核定位序列實(shí)現(xiàn)對(duì)不同類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)染以期將其用于各種可能的臨床治療方向，是基因治療一個(gè)有潛力的發(fā)展方向。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Construction of-MIDGE-NLS gene vector and the expression in rat

Xi Chen, Xuemin Xu, Xijuan Peng, Wei Jiang, and Linong Yao

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Increasing the production and secretion of endogenous opioid peptide by immune cell can significantly induce myocardial protective effects against ischemia-reperfusion injury. Gene therapy is promising to increase endogenous enkephalin (ENK). However, classical viral and plasmid vectors for gene delivery are hampered by immunogenicity, gene recombination, oncogene activation, the production of antibacterial antibody and changes in physiological gene expression. Minimalistic immunologically defined gene expression (MIDGE) can overcome all the deficients of viral and plasmid vectors. The exon of rat’s preproenkephalin (PPENK) gene was amplified by PCR and the fragments were cloned into pEGFP-N1 plasmids. The recombined plasmids were digested with enzymes to obtain a linear vector contained promoter, preproenkephalin gene, RNA stable sequences and oligodesoxy nucleotides (ODNs) added to both ends of the gene vector to protect gene vector from exonuclease degradation. A nuclear localization sequence (NLS) was attached to an ODN to ensure the effective transport to the nucleus and transgene expression. Flow cytometry, laser confocal microscopy and Western blotting demonstrated that PPENK-MIDGE-NLS can transfect leukocyte of rat, increase the expression of proenkephalin (PENK) in tissue, and the transfection efficiency depends on gene vector’s dosage. These results indicate that PPENK-MIDGE-NLS could be an innovative method to protect and treatment of myocardial ischemia-reperfusion injury.

ischemia-reperfusion injury, enkephalin, gene vector, leukocyte

May 29, 2014; Accepted: August 27, 2014

Linong Yao. Tel/Fax: +86-29-84717327; E-mail: yaolin@fmmu.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 81270264).

國家自然科學(xué)基金 (No. 81270264) 資助。