牛結(jié)核γ干擾素ELISPOT檢測方法的建立

徐正中，單法，單鋒麗，孟闖，解曉莉，劉佳瑩，閔晶晶，陳祥，焦新安

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牛結(jié)核γ干擾素ELISPOT檢測方法的建立

徐正中，單法，單鋒麗，孟闖，解曉莉，劉佳瑩，閔晶晶，陳祥，焦新安

揚州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009

徐正中, 單法, 單鋒麗, 等. 牛結(jié)核γ干擾素ELISPOT檢測方法的建立. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(2): 183–194.Xu ZZ, Shan F, Shan FL,et al. Development of an interferon-gamma ELISPOT for bovine tuberculosis. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 183–194.

本研究旨在建立一種牛結(jié)核γ干擾素ELISPOT檢測方法，并評價該方法用于牛結(jié)核病檢測的價值。通過篩選與天然牛γ干擾素特異性結(jié)合的單克隆抗體分別作為包被抗體和檢測抗體，并探索不同的實驗條件確定最佳包被抗體濃度、最佳細(xì)胞數(shù)量和最佳檢測抗體濃度等，建立牛γ干擾素ELISPOT檢測方法。采集30頭奶牛尾靜脈血并分離外周血單個核細(xì)胞，以結(jié)核菌素作為刺激原，使用建立的ELISPOT檢測方法進(jìn)行牛結(jié)核病檢測，并與BOVIGAMTMELISA試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行比較。篩選到兩株與天然牛γ干擾素特異性結(jié)合的單抗2G5和5E11，確定ELISPOT檢測方法的最佳實驗條件為：包被抗體2G5濃度2.5 μg/mL，每孔細(xì)胞數(shù)量2.5×105個，檢測抗體Bio-5E11濃度1 μg/mL。使用建立的ELISPOT檢測方法與BOVIGAMTMELISA試劑盒對30頭奶牛進(jìn)行同步檢測，結(jié)果顯示，以BOVIGAMTMELISA試劑盒檢測結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn)，14頭BOVIGAMTMELISA試劑盒檢測陽性牛中，ELISPOT方法檢出的陽性牛為11頭，敏感性為78.6% (11/14)；16頭BOVIGAMTMELISA試劑盒檢測陰性牛中，ELISPOT方法檢出的陰性牛為12頭，特異性為75% (12/16)。應(yīng)用結(jié)核菌素作為刺激原的牛結(jié)核γ干擾素ELISPOT檢測方法可用于牛結(jié)核病輔助檢測，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

牛γ干擾素，ELISPOT，結(jié)核菌素，牛結(jié)核病

γ干擾素 (IFN-γ) 主要是由被有絲分裂原或特異性抗原刺激而活化的CD4+Th1細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞等產(chǎn)生的一種重要的細(xì)胞因子，具有抗病毒、抗腫瘤活性以及免疫調(diào)節(jié)功能，是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分[1]。內(nèi)源性IFN-γ水平的高低在一定程度上可以反映機體的細(xì)胞免疫狀態(tài)，而抗原特異性的IFN-γ反應(yīng)則可以作為機體針對某種特定外來抗原的細(xì)胞免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)。動物γ干擾素及其單克隆抗體 (mAb) 在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[2]，因此將基因重組牛IFN-γ (rBoIFN-γ) 及其mAb用于牛病的研究，建立抗原特異性BoIFN-γ ELISPOT試驗用于多種牛疫病的檢測，尤以在牛結(jié)核病診斷中的應(yīng)用具有十分重要的意義。目前，IFN-γ釋放試驗已經(jīng)在牛結(jié)核病檢測中得到廣泛應(yīng)用，包括免疫膠體金技術(shù)[3]、酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA)[4-7]。ELISPOT技術(shù)是上世紀(jì)80年代出現(xiàn)，并逐漸發(fā)展和完善起來的可以從單細(xì)胞水平檢測特異性抗體分泌細(xì)胞及特異性細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的一種免疫學(xué)研究技術(shù)，具有穩(wěn)定性好、敏感性高、特異性好等一系列優(yōu)點[8]。目前國內(nèi)外有許多學(xué)者致力于以結(jié)核分枝桿菌特異性抗原為刺激原的ELISPOT方法的建立及其在人結(jié)核病診斷中的應(yīng)用[9-13]，用于人結(jié)核病診斷的ELISPOT商品化試劑盒也已問世并得到廣泛應(yīng)用，由英國Oxford Immunotec公司生產(chǎn)的T-SPOT TB試劑盒是通過結(jié)核分枝桿菌特異的6 kDa早期分泌性抗原靶和培養(yǎng)濾液蛋白10多肽進(jìn)行刺激結(jié)核致敏T淋巴細(xì)胞分泌干擾素，并應(yīng)用ELISPOT方法檢測分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞用于人類結(jié)核病的檢測。到目前為止，關(guān)于建立牛γ干擾素ELISPOT方法應(yīng)用于牛結(jié)核病檢測的相關(guān)研究，國內(nèi)尚未見報道。因此本研究篩選出兩株與天然牛γ干擾素反應(yīng)的特異性單抗2G5和5E11，并以結(jié)核菌素為刺激原，建立了牛結(jié)核γ干擾素ELISPOT檢測方法，并對該方法在牛結(jié)核病檢測過程中的效果進(jìn)行了初步評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

進(jìn)行牛外周血單個核細(xì)胞分離制備的健康奶牛選擇于揚州大學(xué)實驗農(nóng)牧場。

進(jìn)行牛結(jié)核病檢測的30頭實驗用黑白花奶牛 (皮試變態(tài)反應(yīng)結(jié)果初步顯示其中9頭為牛結(jié)核陽性，4頭為牛結(jié)核疑似陽性，17頭為牛結(jié)核陰性) 選擇于江蘇地區(qū)某奶牛場。

牛外周血單個核細(xì)胞分離液購自天津灝洋生物有限公司；96孔濾膜板購自Millipore公司；1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司；美洲商陸 (PWM) 購自Sigma公司；親和素-堿性磷酸酶結(jié)合物購自BD公司；底物液5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和四唑硝基藍(lán) (BCIP/NBT) 購自eBioscience公司；BOVIGAMTMGamma Interferon Test Kit for cattle以及禽型PPD和牛型PPD均購自Prionics公司。

針對牛γ干擾素特異性單抗為本實驗室 制備[14]。

1.2 牛外周血單個核細(xì)胞分離的制備

無菌采取5 mL健康奶牛尾靜脈血加入含肝素鈉的采血管，在采集血液后顛倒混勻得到抗凝血。將抗凝血與滅菌PBS 1∶1稀釋后，再按1∶1的比例將稀釋牛血緩緩加入含牛淋巴細(xì)胞分離液的無菌離心管中，形成明顯界面，在室溫下 2 000 r/min離心20–30 min?？梢娡庵苎獑蝹€核細(xì)胞存在于云霧狀層中，用滅菌滴管吸取淋巴細(xì)胞層至干凈的離心管中，加入滅菌PBS，將細(xì)胞混勻后，于室溫2 000 r/min離心10 min，重復(fù)兩次。棄去上清培養(yǎng)液，加入完全1640培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，取10 μL細(xì)胞懸液加入10 μL臺盼藍(lán)混勻后，取樣加入血球計數(shù)板，在顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)。

1.3 牛γ干擾素ELISPOT檢測方法的建立

1.3.1 間接免疫熒光方法篩選抗體

參照文獻(xiàn)[15]方法，將Sf9細(xì)胞鋪于24孔板中，105細(xì)胞/孔，于27 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)12 h，使之貼壁，將P3代重組牛γ干擾素桿狀病毒保存液按1∶100的體積比感染Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞病變達(dá)90%以上時，棄去培養(yǎng)上清；PBS洗3次，加入預(yù)冷甲醇500 μL/孔，固定15 min；PBS洗3次，加入1∶1 000的牛γ干擾素特異性單抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗滌3次，加入 1∶500稀釋的FITC-羊抗鼠IgG，1 mL/孔，37 ℃孵育2 h；PBS洗滌3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 阻斷ELISA方法篩選抗體

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將倍比稀釋的牛γ干擾素特異性單抗分別與含天然BoIFN-γ的陽性血漿 (PWM刺激牛外周血制備) 和陰性血漿混合，37 ℃孵育2 h；把單抗與血漿的混合物相應(yīng)地加入到已包被0.5 μg/mL的rHis-BoIFN-γ的ELISA板中，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h；PBST洗3次，拍干，加入工作濃度的HRP-羊抗鼠IgG，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；PBST洗3次，拍干，TMB顯色，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀出450的吸光值。

1.3.3 相加ELISA方法鑒定抗原表位

通過相加ELISA實驗確定不同牛γ干擾素特異性單抗是否針對同一抗原表位，首先根據(jù)腹水效價確定每株單抗腹水與所選包被抗原量反應(yīng)的飽和度，然后將相加的兩株單抗按飽和度分別進(jìn)行稀釋與包被的重組牛γ干擾素抗原反應(yīng)，同時將兩株腹水混合使各自達(dá)到飽和再與包被的重組牛γ干擾素抗原反應(yīng)，測得3組ELISA反應(yīng)值分別記為A1、A2、A1+2，計算相加指數(shù)AI= (2 A1+2/ A1+ A2)-1，若兩株單抗AI＞50%，則表明兩株單抗針對抗原表位不同。

1.3.4 ELISPOT操作步驟的確定

參照文獻(xiàn)[16]方法，使用包被液稀釋的捕獲抗體2G5加入96孔濾膜板，100 μL/孔，4 ℃無菌過夜包被；棄包被液，使用含有0.05%吐溫的滅菌PBST洗板3次，5 min/次；加入含10%胎牛血清的完全1640培養(yǎng)基，200 μL/孔，37 ℃孵育封閉2 h；棄封閉液，使用PBST洗板1次，將96孔濾膜板直接用于檢測或置4 ℃保存。在上述包被的96孔濾膜板中加入50 μL刺激原，并設(shè)立對照組，然后每孔加入50 μL牛外周血單個核細(xì)胞懸液，將96孔濾膜板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h；將96孔濾膜板取出，棄培養(yǎng)上清，使用PBST洗板5次，5 min/次，洗板后甩干。加入稀釋的牛γ干擾素檢測抗體Bio-5E11，100 μL/孔，置于37 ℃孵育1 h；用PBS洗板3次，5 min/次，洗板后甩干，加入 1∶1 000稀釋的親和素-堿性磷酸酶結(jié)合物， 100 μL/孔，置于37 ℃孵育1 h；每孔加入100 μL底物液BCIP/NBT，放置于室溫避光顯色。在96孔濾膜板中加入純凈水終止反應(yīng)，去除液體，室溫下過夜或37 ℃烤箱中2–3 h烘干；將96孔濾膜板放入ELISPOT儀中，對實驗結(jié)果進(jìn)行掃描計數(shù)和分析。

1.3.5 最佳包被抗體濃度的確定

使用包被液稀釋捕獲抗體2G5至 1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL，加入96孔濾膜板，100 μL/孔，各設(shè)3個重復(fù)孔，4 ℃過夜包被，棄包被液，進(jìn)行洗滌和封閉后備用。其他步驟均按照1.3.4中ELISPOT操作程序。

1.3.6 最佳細(xì)胞數(shù)量的確定

在上述包被的96孔濾膜板中加入50 μL完全1640培養(yǎng)基至每個對照孔，加入50 μL 5 μg/mL的PWM至每個檢測孔。每孔加入50 μL牛外周血單個核細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)量分別為1.25×105細(xì)胞/孔、2.5×105細(xì)胞/孔、5×105細(xì)胞/孔和1×106細(xì)胞/孔，各設(shè)3個重復(fù)孔，將96孔濾膜板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。其他步驟均按照1.3.4中ELISPOT操作程序。

1.3.7 最佳檢測抗體濃度的確定

將96孔濾膜板取出，棄培養(yǎng)上清，使用PBST洗板5次，5 min/次，洗板后甩干。分別加入稀釋至0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL的牛γ干擾素檢測抗體Bio-5E11，100 μL/孔，各設(shè)3個重復(fù)孔，置于37 ℃孵育1 h。其他步驟均按照1.3.2中ELISPOT操作程序。

1.4 ELISPOT方法和BOVIGAMTMELISA試劑盒同步進(jìn)行牛結(jié)核病檢測

無菌采集30份奶牛尾靜脈血，將抗凝血加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每頭牛抗凝血分裝3孔， 1 mL/孔，各孔分別加入相應(yīng)的刺激原 (PBS、Avian PPD、Bovine PPD)，充分混勻，CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，吸取50 μL上層血漿作為待檢樣品用于牛結(jié)核外周血IFN-γ釋放試驗的檢測[16]，參照BOVIGAMTMGamma Interferon Test Kit for cattle說明書進(jìn)行。

在96孔濾膜板中分別加入2.5 μg/mL的捕獲牛γ干擾素抗體2G5，100 μL/孔，4 ℃過夜包被。棄包被液，進(jìn)行洗滌和封閉后備用。對上述奶牛場30頭奶牛分別無菌采取5 mL尾靜脈血加入含肝素鈉的抗凝管，進(jìn)行牛外周血單個核細(xì)胞的制備和計數(shù)。在上述包被的96孔濾膜板中分別加入50 μL培養(yǎng)液至每個對照孔、50 μL 10 μg/mL的禽型PPD、50 μL 10 μg/mL的牛型PPD至每個檢測孔。分別加入50 μL每頭牛的外周血單個核細(xì)胞懸液至培養(yǎng)液對照孔、禽型PPD和牛型PPD檢測孔，將96孔濾膜板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。將96孔濾膜板取出，棄培養(yǎng)上清并進(jìn)行洗滌，加入1 μg/mL的牛γ干擾素檢測抗體Bio-5E11，100 μL/孔，置于37 ℃孵育1 h。用PBS洗板3次，5 min/次，洗板后甩干，加入1∶1 000稀釋的親和素-堿性磷酸酶結(jié)合物， 100 μL/孔，置于37 ℃孵育1 h；每孔加入100 μL底物液BCIP/NBT，放置于室溫避光顯色。在96孔濾膜板中加入純水終止反應(yīng)，對實驗結(jié)果進(jìn)行掃描計數(shù)和分析。

2 結(jié)果

2.1 牛γ干擾素ELISPOT檢測方法的建立

2.1.1 間接免疫熒光方法篩選抗體

為了鑒定制備的牛γ干擾素特異性單抗是否與真核系統(tǒng)表達(dá)的牛γ干擾素蛋白有較好的反應(yīng)性，本實驗以制備的牛γ干擾素特異性單抗為一抗分別檢測重組牛γ干擾素桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，結(jié)果顯示，2G5和5E11等單抗檢測的感染重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞出現(xiàn)明顯綠色熒光，而4D3和5B8等單抗檢測的感染重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞沒有出現(xiàn)明顯綠色熒光 (圖1)。

2.1.2 阻斷ELISA方法篩選抗體

為了進(jìn)一步篩選具有高親和力，與天然牛γ干擾素可以特異性結(jié)合的單抗，本實驗采用阻斷ELISA方法，檢測各株單抗與陽性血漿中天然牛γ干擾素蛋白的反應(yīng)性。結(jié)果表明，2G5和5E11等單抗與陽性血漿具有一定的反應(yīng)性，而6F8和8F8等單抗與陽性血漿混合后，并沒有明顯的阻斷效果 (圖2)。表明2G5和5E11等單抗與天然牛γ干擾素蛋白有著更好的反應(yīng)性。

圖1 間接免疫熒光鑒定單抗

2.1.3 相加ELISA方法鑒定抗原表位

為了鑒定篩選到的高親和力單抗2G5和5E11是否針對牛γ干擾素同一抗原表位及便于單抗的進(jìn)一步應(yīng)用，本實驗采用相加ELISA方法，檢測各株單抗針對牛γ干擾素抗原表位情況。結(jié)果顯示，單抗2G5和5E11進(jìn)行相加ELISA檢測AI值＞50%，表明兩株單抗針對抗原表位不同。

2.1.4 最佳包被抗體濃度的確定

為了確定最佳包被抗體濃度，將捕獲牛γ干擾素抗體2G5分別稀釋至1.25 μg/mL、 2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL進(jìn)行包被，結(jié)果顯示在非特異性刺激原PWM的作用下，實驗組斑點數(shù)隨著包被濃度的提高而有所增加，但是并不明顯，包被濃度為2.5 μg/mL時，檢測孔的斑點數(shù)在100個左右，便于計數(shù)，而且陰性對照組斑點數(shù)較少，因此選擇2.5 μg/mL包被濃度比較合適 (圖3)。

2.1.5 最佳細(xì)胞數(shù)量的確定

為了確定最佳刺激細(xì)胞數(shù)量，在96孔濾膜板中分別加入了1.25×105、2.5×105、5×105、10×105制備的牛外周血單個核細(xì)胞，并加入刺激原進(jìn)行孵育培養(yǎng)和檢測。結(jié)果顯示，隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，斑點數(shù)目顯著增多，加入細(xì)胞數(shù)量為2.5×105時，96孔濾膜板中斑點數(shù)目在100左右，便于計數(shù)。隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，陰性對照孔中的斑點數(shù)也有所增加，因此確定2.5×105為最佳細(xì)胞數(shù)目 (圖4)。

圖3 包被抗體濃度對于檢測斑點數(shù)的影響

圖4 細(xì)胞數(shù)量對于檢測斑點數(shù)的影響

2.1.6 最佳檢測抗體濃度的確定

為了確定最佳檢測抗體濃度，本實驗將牛γ干擾素檢測抗體Bio-5E11分別稀釋至0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL和4 μg/mL加入96孔濾膜板進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示斑點數(shù)目隨著檢測抗體濃度的提高明顯增多，包被濃度為1 μg/mL時檢測孔的斑點數(shù)較為合適，并且隨著檢測抗體濃度的提高，陰性對照孔中的斑點本底數(shù)也有所提高，因此確定1 μg/mL為最佳檢測抗體濃度 (圖5)。

2.2 ELISPOT方法進(jìn)行牛結(jié)核病的檢測

本研究中使用牛結(jié)核γ干擾素ELISPOT方法對總共30頭奶牛進(jìn)行了牛結(jié)核病檢測，參考文獻(xiàn)[8-10]并結(jié)合本研究實際設(shè)定判定標(biāo)準(zhǔn)，如果牛型PPD刺激孔中斑點數(shù)減去PBS對照孔中的斑點數(shù)以及牛型PPD刺激孔中斑點數(shù)減去禽型PPD刺激孔中斑點數(shù)都大于或等于6個，則可以判定為陽性；如果牛型PPD刺激孔中斑點數(shù)減去PBS對照孔中的斑點數(shù)或牛型PPD刺激孔中斑點數(shù)減去禽型PPD刺激孔中斑點數(shù)小于6個，則可以判定為陰性。根據(jù)這一判定標(biāo)準(zhǔn)，30頭奶牛中有15頭可以判定為結(jié)核陽性，陽性檢出率為50% (15/30) (圖6)。

圖5 檢測抗體濃度對于檢測斑點數(shù)的影響

2.3 ELISPOT方法與BOVIGAMTMELISA試劑盒檢測效果的比較

同時使用BOVIGAMTMELISA試劑盒 (圖7) 和牛結(jié)核γ干擾素ELISPOT方法對30頭奶牛進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，兩種方法檢出共同陽性數(shù)為11頭，檢出共同陰性數(shù)為12頭 (表1)。以BOVIGAMTMELISA試劑盒檢測結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn)，14頭BOVIGAMTMELISA試劑盒檢測陽性牛中，ELISPOT方法檢出的陽性牛為11頭，敏感性為78.6% (11/14)；16頭BOVIGAMTMELISA試劑盒檢測陰性牛中，ELISPOT方法檢出的陰性牛為12頭，特異性為75% (12/16)。

圖6 ELISPOT方法進(jìn)行牛結(jié)核檢測結(jié)果

圖7 BOVIGAMTM ELISA試劑盒檢測結(jié)果

表1 ELISPOT方法與BOVIGAMTM ELISA試劑盒的比較結(jié)果 (單位：頭)

3 討論

牛結(jié)核病是一種重要的人獸共患病，可以通過吸入含菌氣溶膠或食用受污染的乳制品而從牛傳染到人，其傳播和流行嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康[18]。在一些畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的西方國家，牛結(jié)核病疫情曾經(jīng)也相當(dāng)嚴(yán)重，通過實施“檢疫-撲殺”措施后，疫情得到了一定程度的控制[19]。近年來，由于我國人民生活水平逐漸提高，人們對于牛乳制品需求量急速上升，進(jìn)而帶動了奶牛業(yè)的迅猛發(fā)展，因此我國的牛結(jié)核病疫情正受到廣泛而密切的關(guān)注。

目前世界各國都在致力于研究開發(fā)牛結(jié)核病的快速檢測方法，并已經(jīng)建立了一些準(zhǔn)確、可靠的新型檢測技術(shù)，并且在生產(chǎn)實踐中得到了廣泛的應(yīng)用。牛結(jié)核病的檢測方法，主要分為三類：第一類是細(xì)菌學(xué)檢測，如涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng) 等[20]；第二類為分子生物學(xué)診斷技術(shù)[21-23]；第三類是免疫學(xué)檢測，如皮試變態(tài)反應(yīng)、IFN-γ釋放試驗 (IGRA) 等[24]。IGRA具有特異度高、快速的優(yōu)點、是目前可取代皮試試驗的最有效方法，包括免疫膠體金技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定法、酶聯(lián)免疫斑點法等。

免疫膠體金法適用于液體樣品，如牛血漿樣品中IFN-γ含量的測定，免疫膠體金法的特點在于使用方便快速，不需要特殊的儀器設(shè)備進(jìn)行檢測，便于基層使用和現(xiàn)場使用，可以進(jìn)行多項檢測，省去了酶標(biāo)的致癌性底物及終止液的步驟，對人體無毒害，關(guān)于免疫膠體金方法的建立及在牛結(jié)核病檢測中的應(yīng)用，國內(nèi)學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)研究[3]，但是該方法在檢測靈敏度、特異性和穩(wěn)定性方面有待提高，應(yīng)用不是很廣泛。牛結(jié)核IFN-γ ELISA檢測方法的特點在于實驗操作更加準(zhǔn)確，降低檢測主觀性誤差，因此檢測結(jié)果更加客觀可靠，檢測靈敏度也高于免疫膠體金方法，也可以實現(xiàn)一次采血多病檢測，該方法的研究最多且應(yīng)用較廣泛[4-7]，用于牛結(jié)核病檢測的商品化BOVIGAM?ELISA試劑盒也已問世并得到廣泛應(yīng)用[25-26]。

近年來隨著免疫學(xué)檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，以結(jié)核分枝桿菌特異性抗原為基礎(chǔ)的ELISPOT實驗作為一種新型的結(jié)核病免疫學(xué)診斷工具逐漸建立起來。ELISPOT方法同時具備細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與ELISA技術(shù)的優(yōu)點，能夠分析經(jīng)特異性抗原活化后分泌細(xì)胞因子的單個效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)目，能從20萬–30萬細(xì)胞中檢測出單個分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞，敏感性高且特異性好，相關(guān)研究證明其敏感性比ELISA法高10–200倍[26]，這些獨特優(yōu)點使得ELISPOT技術(shù)成為公認(rèn)的檢測免疫效應(yīng)細(xì)胞的一種重要研究方法。牛結(jié)核IFN-γ ELISPOT檢測方法相比于免疫膠體金法和ELISA方法，都是通過抗原抗體間特異性結(jié)合的原理，對特異性刺激牛全血后牛IFN-γ的產(chǎn)生水平進(jìn)行測定，從而對牛結(jié)核感染狀態(tài)進(jìn)行檢測。由于檢測媒介體、顯色方式、樣品類型等方面的不同，3種方法在使用流程、檢測特異性和靈敏度方面有所差別，ELISPOT方法憑借其敏感性高且特異性好的獨特優(yōu)勢，在牛結(jié)核病的檢測中具有重要的應(yīng)用價值。

目前許多學(xué)者進(jìn)行了以結(jié)核分枝桿菌特異性抗原為刺激原的ELISPOT方法的建立相關(guān)研究[9-13]，而且用于人結(jié)核病診斷的ELISPOT商品化試劑盒也已問世并得到廣泛應(yīng)用，由英國Oxford Immunotec公司生產(chǎn)的T-SPOT TB試劑盒是通過結(jié)核分枝桿菌特異的6 kDa早期分泌性抗原靶和培養(yǎng)濾液蛋白10多肽進(jìn)行刺激結(jié)核致敏T淋巴細(xì)胞分泌干擾素，并應(yīng)用ELISPOT方法檢測分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞用于人類結(jié)核病的檢測。但是目前關(guān)于牛γ干擾素ELISPOT方法應(yīng)用于牛結(jié)核病檢測的相關(guān)研究，國內(nèi)尚未見報道。

為了提高ELISPOT檢測方法的靈敏度和特異性，以及該方法在牛結(jié)核病檢測過程中的實際應(yīng)用效果，本研究通過間接免疫熒光方法和阻斷ELISA方法篩選到2G5、5E11等與天然牛γ干擾素蛋白有著很好反應(yīng)性和實際應(yīng)用價值的單克隆抗體，并將這兩株單抗分別作為包被抗體和檢測抗體，進(jìn)行了牛γ干擾素ELISPOT檢測方法的建立，隨后確定ELISPOT方法的最佳實驗條件為：包被抗體濃度2.5 μg/mL，每孔細(xì)胞數(shù)量2.5×105，檢測抗體濃度1 μg/mL。以結(jié)核菌素作為刺激原，使用建立的牛結(jié)核γ干擾素ELISPOT檢測方法對30頭奶牛進(jìn)行牛結(jié)核病檢測，并與BOVIGAMTMELISA試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，牛結(jié)核γ干擾素ELISPOT檢測方法與BOVIGAMTMELISA試劑盒具有較高的符合率。應(yīng)用結(jié)核菌素作為刺激原的牛結(jié)核γ干擾素ELISPOT檢測方法與免疫膠體金方法、ELISA等免疫學(xué)方法相比具有更好的靈敏度和特異性，可以應(yīng)用于牛結(jié)核病檢測，具有潛在的臨床應(yīng)用價值，為牛結(jié)核病的檢疫提供了一種重要的輔助手段。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Development of an interferon-gamma ELISPOT for bovine tuberculosis

Zhengzhong Xu, Fa Shan, Fengli Shan, Chuang Meng, Xiaoli Xie, Jiaying Liu, Jingjing Min, Xiang Chen, and Xin’an Jiao

,,,225009,,

We established an ELISPOT for bovine interferon-gamma (BoIFN-γ), and applied it in the diagnosis of bovine tuberculosis (bTB). Monoclonal antibodies that can bind with native BoIFN-γ were screened as the coating antibody and detecting antibody. After optimization of detecting conditions including coating antibody concentration, cell number, and detecting antibody concentration, the ELISPOT assay was established. Peripheral mononuclear cells (PBMCs) isolated from 30 cows were co-cultured with PPD, and detected with the ELISPOT assay. The optimal conditions of ELISPOT assay were 2.5 μg/mL coating antibody 2G5, 2.5×105cells/well, and 1 μg/mL detecting antibody Bio-5E11. In these 30 cows tested both with the ELISPOT assay and the BOVIGAMTMkit, 11 cows were proved to be positive in ELISOPT assay with the sensitivity of 78.6%, and 12 cows were proved to be negative in ELISOPT assay with the specificity of 75%. The ELISPOT assay for BoIFN-γ could be used to detect bTB efficiently and it might be an alternative method for the diagnosis of bTB.

bovine interferon-gamma, enzyme-linked immunospot assay, tuberculin,bovine tuberculosis

May 19, 2014; Accepted: September 11, 2014

Xin’an Jiao. Tel: +86-514-87971136; E-mail: jiao@yzu.edu.cn Xiang Chen. Tel: +86-514-87971136; E-mail: chenxiang@yzu.edu.cn

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