多藥耐藥基因1(Abcb1)敲除和人源化大鼠模型的建立

馬 婧，陳 煒，張 旭，馬元武，呂 丹，高 虹，張連峰

(中國醫(yī)學科學院＆北京協(xié)和醫(yī)學院,醫(yī)學實驗動物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,北京 100021)

研究報告

多藥耐藥基因1(Abcb1)敲除和人源化大鼠模型的建立

馬 婧，陳 煒，張 旭，馬元武，呂 丹，高 虹，張連峰

(中國醫(yī)學科學院＆北京協(xié)和醫(yī)學院,醫(yī)學實驗動物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,北京 100021)

目的 敲除大鼠多藥耐藥基因1(Abcb1),并在基因敲除大鼠的基礎上建立Abcb1人源化大鼠模型,為Abcb1相關藥物代謝和藥物評價研究提供更接近人類的動物模型。方法 利用大片段轉基因技術和CRISPR/ Cas9技術相結合,建立人源化大鼠模型,利用PCR,RT-PCR和Real-time PCR的方法進行鑒定及分析。結果 將包含人源Abcb1啟動子和cDNA的153 kb BAC片斷轉入到大鼠基因組,獲得穩(wěn)定表達h-Abcb1基因的大鼠,同時建立了Abcb1基因敲除大鼠。通過將兩者雜交建立了Abcb1人源化大鼠模型。人源大鼠與大鼠內(nèi)源Abcb1表達譜有明顯的區(qū)別,人源化大鼠不僅表達h-Abcb1基因,在組織表達譜方面也與人類更接近。結論 建立了Abcb1基因敲除大鼠和人源化大鼠模型,Abcb1人源化模型可作為Abcb1基因相關藥物代謝研究更接近人類的動物模型。

Abcb1;人源化;BAC;基因敲除大鼠

P-糖蛋白是一種相對分子量為170×103的單鏈跨膜糖蛋白,由多藥耐藥基因Abcb1(又稱Mdr1)編碼,參與藥物吸收、分布、代謝及排泄等過程[1]。在生理狀態(tài)下,P-糖蛋白的存在可保護機體安全,而在病理清況下,P-糖蛋白于血腦屏障的表達使得藥物不能進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[2],于腫瘤細胞中的表達[3]導致機體產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象[4-5],所以控制P-糖蛋白表達的Abcb1基因與多種藥物有效性和安全性相關。

大鼠不僅是生理、代謝、神經(jīng)及行為等研究廣泛使用的動物[6],也是藥典規(guī)定的用于藥物安全性評價的指定動物之一。由于物種差異,大鼠的P-糖蛋白與人體的P-糖蛋白的表達圖譜和蛋白結構都有一定差異[7],所以,利用動物進行藥物有效性和安全性評價的結果與臨床試驗結果不一致的清況時有發(fā)生[8]。

采用BAC[9](細菌人工染色體)的方法可以將h-Abcb1基因導入到大鼠的受精卵中,建立基因結構、表達譜和調節(jié)方式與人類相似的模型[10],能夠更好的模擬人類h-Abcb1的表達圖譜,從而更加客觀的評價藥物。同時采取基因敲除的技術[11-12]剔除大鼠該內(nèi)源基因的表達,建立人源化大鼠模型,為Abcb1相關藥物篩選、毒理評價提供良好的人源化大鼠模型。

1 材料和方法

1.1 表達Abcb1的細菌人工染色體及其轉基因大鼠的制作

利用同源重組的方法在 Abcb1-BAC克隆(RP11-42N21)距5’上游65 kb的位置插入h-Abcb1基因的最長男接體cDNA(4718 bp),(構建好的載體起始密碼子ATG上游長度為66 kbp,ATG下游長度為87 kbp),構建表達Abcb1的BAC表達載體(中科院動物所提供)。將構建好的載體經(jīng)過酚氯仿抽提后,調整濃度至1～2 ng/μL,利用顯微注射技術將BAC注射到SD大鼠的受精卵中(大鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司【SCXK(京)2012-001】),用SD大鼠作為假孕受體大鼠(大鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司【SCXK(京)2012-001】),制備轉基因大鼠(TE2000U纖維注射儀)。實驗相關動物在本所衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室繁育【SYXK(京)2013-002】,實驗中設計動物操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所動物使用與管理委員會批準,批準號為ILAS-GC-2012-001。

1.2 Abcb1b基因敲除大鼠的制作

主要包括以下幾個部分:1)用于Abcb1b基因打靶的gRNA質粒構建2)體外轉錄3)Cas9/sgRNA的原核注射。

用于Abcb1b基因打靶的gRNA質粒構建:針對Abcb1b基因設計兩個靶點 GGAGACAAATACA CAAGATT以及GG TTTGACGTGAATGACGCT,合成兩對寡聚核苷酸鏈(RAT-ABCB1-E1(1)-gRNA: TAGGAGACAAATACACAAGATT和AAACAATCTTG TGTATTTGTCT;RAT-ABCB1-E1(2)-gRNA:TAGGT TTGACGTGAATGACGCT和AAACAGCGTCATTCAC GTCAAA)用于制備sgRNA合成的寡聚核苷酸經(jīng)退火(97℃6min后自然冷卻至室溫),連入經(jīng)Bsa I酶切回收的pUC57-sgRNA表達載體(南京大學黃興許老師惠贈),構建sgRNA表達載體。測序驗證后,選擇正確克隆。

體外轉錄:Cas9表達質粒(Addgenne No.44858,南京大學黃興許老師惠贈),經(jīng)Age I酶切線性化,經(jīng)酚氯仿抽純化后,溶于無核酸酶的水中作為模板,用于體外轉錄。Cas9 mRNA的合成由試劑盒T7Ultra Kit(Amibion,AM1345)在體外作用T7 RNA聚合酶完成。sgRNA的表達載體經(jīng)DraI酶切線性化后,經(jīng)酚氯仿純化,溶于無核酸酶的水中作為模板,用于體外轉錄。sgRNA的體外合成由試劑盒MEGAshortscript Kit(Ambion,AMI354)在體外利用T7 RNA聚合酶完成。

Cas9/sgRNA的原核注射:轉錄好的Cas9 mRNA和sgRNA混合并且調整濃度至20 ng/μL和10 ng/ μL/sgRNA,顯微注射法將RNA混合物注射到SD大鼠的受精卵的雄性核和細胞質中制備轉基因大鼠。

1.3 Abcb1-BAC轉基因大鼠及Abcb1b基因敲除大鼠的基因型鑒定

首建鼠于出生7～14 d時,男趾標記,收集男下的組織,選用酚氯仿提取基因組DNA,溶于0.1× TE中,使用PCR法對首建鼠進行篩選。對于Abcb1 -BAC轉基因大鼠,使用三對PCR引物分別對插入BAC的上中下游進行完整性檢測,分別為:Abcb1-BAC-F1:5’-CACCAGTTGAAGAGCGTTGA-3’下游Abcb1-BAC-R1:5’-GCTGCTGATGTGCTGATTGT-3’Abcb1-BAC-F2:5’-CCAATGATGCTGCTCAAG-3’下游 Abcb1-BAC-R2:5’-GAGTTTATGTGCCACCAAGT AG-3’Abcb1-BAC-F3:5’-AGTGGTGTTTCAGAATG GC-3’下游Abcb1-BAC-R3:5’-GTCAGTTACAGTCC AAATGGG-3’(Life Technologies,中國)。PCR反應體系20μL(PCR反應相關試劑購自寶生物工程有限公司,中國)。反應條件:95℃5 min;(95℃30 s,58℃30 s,72℃30 s,30個循環(huán));72℃10 min;4℃保溫。擴增片段大小分別為316 bp,449 bp,410 bp。對于Abcb1b基因敲除大鼠,設計一對引物包含作用靶 點, 上 游 引 物 為 Abcb1-check-F1: GCTACAATGACATGTCCTACCCAAT下游引物為Abcb1-check-R1:AGTCTTGATTCTGCCAGCCTAGTC (上海英俊生物技術技術有限公司合成,中國)。PCR反應體系50μL(PCR反應相關試劑購自寶生物工程有限公司,中國)。反應條件:95℃ 5 min; (95℃30 s,62℃30 s,72℃30 s)×30循環(huán);72℃10 min;4℃保存。擴增片段大小為737 bp。并通過TA克隆、測序進一步檢測確定突變。

1.4 Abcb1人源化大鼠的培育

通過將得到的r Abcb1b基因敲除大鼠進行雜交,獲得r Abcb1b基因敲除純合子大鼠,將hAbcb1-BAC陽性大鼠與rAbcb1b基因敲除大鼠雜交,得到BAC陽性且rAbcb1b基因敲除雜合子大鼠,將此大鼠與rAbcb1b基因敲除純合子大鼠雜交,即可獲得hAbcb1-BAC陽性且rAbcb1b基因敲除純合子大鼠。這種大鼠缺乏r-Abcb1b基因的表達,同時攜帶通過BAC技術得到的h-Abcb1基因。

1.5 RT-PCR檢測hAbcb1組織表達情況

Abcb1人源化大鼠與野生型大鼠交配,對其子代的基因表達清況進行分析。頸椎脫臼法犧牲大鼠,提取F1代大鼠及野生對照大鼠心臟、肝臟、腎臟、肺、腦組織的總RNA。制備cDNA,利用引物RTAbcb1-F:5’-GGCTATCATTACTCTTTACCTGTGAAG-3’和RT-Abcb1-R:5’-CCGGATTGACTGAATGCTG -3’,擴增大小為225 bp的目的片段,PCR反應體系20μL(PCR反應相關試劑購自寶生物工程有限公司,中國)。反應條件:95℃5 min;(95℃30 s,62℃30 s,72℃30 s,24個循環(huán));72℃10 min;4℃保存。GAPDH作為內(nèi)參。

1.6 Real-time PCR檢測組織內(nèi)Abcb1m RNA表達情況

頸椎脫臼法犧牲大鼠,提取心、肝、脾、腎、腦、胸腺等組織總RNA,制備cDNA。

標準曲線的建立:使用引物Abcb1-wt-standard-F1:5’-CAGGAGATAGGCTGGTTTGACG-3’;Abcb1-wt-standard-R1:5’-GGCCCTTCAAGATCTTAACTTCA C-3’以及 Abcb1-human-standard-F1:5’-CAGTGG AATTGGTGCTGG-3’;Abcb1-human-standard-R1:5’-AACACTAAAAGCCCCAATTAATACAG-3’分別擴增野生型大鼠體內(nèi)的rAbcb1b基因以及人源化大鼠體內(nèi)的hAbcb1基因,片段長度分別為766 bp及682 bp。將攜帶有rAbcb1基因及hAbcb1基因的質粒作為模板,稀釋范圍為1×1010～1×103拷貝/μL,使用Power SYBR Green Master Mix體系,反應條件為: 95℃ 預變性 5 min進入循環(huán):95℃30 s,59℃(r Abcb1)或61℃(h Abcb1)退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)40次,在每個循環(huán)結束后測定吸光值。建立標準曲 線 時 使 用 的 引 物 為 Abcb1-wt-F1:5’-GAATGTTCTTTCAGTCCATAACGA-3’和 Abcb1-wt-R1:5’-GTTCTGATGGCTGCTAAGACTTC-3’以及Abcb1-human-F1:5’-TGGTTGCTGCTTACATTCAGG-3’和 Abcb1-human-R1 5’-CAGCTGACAGTCCAAG AACAGG-3’。

使用Abcb1-wt-F1/R1和Abcb1-human-F1/R1分別對野生型大鼠及人源化大鼠的Abcb1基因進行擴增,根據(jù)標準曲線,計算不同組織拷貝數(shù),重復3次。GraphPad Prism 5軟件分析。

2 結果

2.1 hAbcb1–BAC轉基因大鼠的制備與分析

利用同源重組的方法在Abcb1-BAC克隆(RP11-42N21)5’上游65 kb的位置插入h-Abcb1基因的最長男接體cDNA(4718 bp),(構建好的載體起始密碼子ATG上游長度為66 kbp,ATG下游長度為87 kbp)完成了表達Abcb1的BAC表達載體(圖1)。獲得15只F0代大鼠,提取其基因組DNA,PCR鑒定,共獲得4只表達全長h-Abcb1的首建鼠(圖2)。但只有3只首建鼠能穩(wěn)定傳代。提取大鼠的心臟、肝臟、腎臟、肺、腦的RNA[13],RT-PCR方法分析Abcb1的RNA水平表達清況,結果表明3個轉基因大鼠系(2號,5號和8號)的腦組織均有Abcb1基因的表達,但是只有5號轉基因大鼠系的心臟組織有Abcb1基因的表達,并且在肝臟,肺和腦組織中Abcb1的表達量最高(圖3)

圖1 BAC-Abcb1細菌人工染色體結構圖Fig.1 The structure of BAC-Abcb1

2.2 Abcb1b基因敲除大鼠的制備

經(jīng)顯微注射,得到12只首建鼠,經(jīng)基因型鑒定,篩選獲得三只(1號,5號和9號)首建鼠系(圖4A),并對這三只首建鼠系的擴增產(chǎn)物進行測序分析,確定了CRISPR/Cas9對Abcb1b的基因修飾清況(圖5A)。

圖2 PCR鑒定BAC-Abcb1大鼠基因型Note:M:DNA molecular weightmarker DL2000;H:H2O;W:Negative control;P:Positive control; 1-15:ratswere generated bymicroinjection,2,5,8,10 were four positive founders.Fig.2 Identify the genotype of the BAC-Abcb1 rats by PCR

圖3 RT-PCR分析Abcb1在F1代大鼠中的基因表達清況Note:W:Negative control;F2,F5 and F8 are generated by crossing founder 2,5,8 with wild type rats.F5 has human Abcb1 expression in heart,liver,kidney,lung and brain.Fig.3 Abcb1 gene expression in F1 ratswere analyzed by RT-PCR

圖4 Abcb1b基因敲除大鼠的基因型鑒定Note:M:DNA molecular weightmarker DL2000;H:H2O;W:Negative control;A:1-12:Rats generated bymicroinjection.B:The off springs of founder 5 were identified by PCR,Themutation can be transmitted.-/+:Abcb1 heterogeneous rat.-/-:Abcb1 homozygous rat.Fig.4 Identify the genotype of the Abcb1b knockout rats by PCR

分析發(fā)現(xiàn)5號首建鼠系含有62 bp的DNA片段缺失,該缺失造成了Abcb1b基因的移碼突變,并提前產(chǎn)生了終止密碼子。我們將5號首建鼠系與野生型大鼠交配,對子代大鼠進行基因型鑒定(圖4B),測序結果表明該缺失能夠穩(wěn)定遺傳(圖5B)。

2.3 Abcb1人源化大鼠的培育

將Abcb1b基因敲除大鼠和hAbcb1-BAC轉基因大鼠雜交,最終獲得 r Abcb1b基因敲除和表達hAbcb1的大鼠,即為人源化 Abcb1大鼠。6號為Abcb1人源化大鼠(圖6A、B)。

圖5 Abcb1b基因敲除大鼠的測序結果分析Note:The PAM sequence is underlined and highlighted in green;the targeting site are red;themutations are blue; deletions(-)are shown to the right of each allele.N/N Indicates positive colonies out of total sequenced.A:The sequence result of founder rats.D:Sequencing result of offspring rat.Fig.5 The sequence result analysis of Abcb1b knockout ratmodel

圖6 Abcb1人源化大鼠的鑒定Note:M:DNA molecular weightmarker DL2000;H:H2O;W:Negative control.P:Positive control.1-6:Rats were got by crossing BAC-Abcb1 ratwith Abcb1b knock out rat.A:2,4,6 are transgenic positive rats;1,3,5 are transgenic negative rat B:1,2 are wild type rat;3,4 are Abcb1b heterogeneous rat;5,6 are Abcb1b homozygous rats.6 is the humanized Abcb1 rat.Fig.6 Generation of humanized Abcb1 rat

圖7 RT-PCR檢測野生型大鼠和人源化大鼠組織中Abcb1 mRNA表達水平及Abcb1-human和Abcb1b-rat質粒10倍系列稀釋的標準曲線Note:A:The wild type rat RT-PCR products detected by agarose gel,analyzing the Abcb1b expression level in tissues.B:The Abcb1 humanized rat RT-PCR products detected by agarose gel,analyzing Abcb1 expression level in tissues C:The standard curve of 10-fold serial dilutions of Abcb1b-rat plasmid D:The standard curve of10-fold serial dilutions of Abcb1-human plasmid.Fig.7 The Abcb1 mRNA expression level of wild type rat and Abcb1 humanized rat in different tissues detected by RT-PCR and the standard curve of 10-fold serial dilution of Abcb1-human and Abcb1b-rat plasmid

2.4 Abcb1人源化大鼠和野生型大鼠Abcb1b表達情況對比分析

以心、肝、脾、腎、腦、胸腺等組織的cDNA為模板,擴增 Abcb1,發(fā)現(xiàn)野生型大鼠體內(nèi)肝臟和腦Abcb1b表達量高,心臟和腎臟表達量相對較低(圖7A、B)。人源化大鼠體內(nèi)肝臟、腎臟和腦內(nèi)Abcb1表達量高,心臟表達量較低。將攜帶有rAbcb1b基因及hAbcb1基因的質粒以10倍梯度系列稀釋作為模板擴增得到的標準曲線R2＞0.99,符合曲線要求(圖7C、D)。Abcb1基因拷貝數(shù)經(jīng)統(tǒng)計分析可以看出Abcb1人源化大鼠心臟的拷貝數(shù)達到5×104拷貝/mg,在肝臟為5×104拷貝/mg,脾臟為8×104拷貝/mg,腎臟為1.2×105拷貝/mg,腦為2×105拷貝/mg,心臟、脾臟、腎臟和腦中h-Abcb1的拷貝遠高于r-Abcb1,結果與瓊脂糖凝膠電泳結果一致(圖8)。

3 討論

制作人源化動物模型是研究人類基因功能的重要方法,人源化實驗動物模型主要包括基因水平上的人源化動物模型以及細胞組織水平的人源化動物模型[14]?；蛩降娜嗽椿瘎游锬Ｐ椭谱髦饕袃煞N方法,一種為基因敲入的方法[15-16],另一種是將動物的內(nèi)源基因敲除后轉入BAC。與前者相

圖8 Real-time PCR檢測野生型大鼠和人源化大鼠組織中Abcb1 mRNA表達水平Note:The copy numbers of Abcb1-human and Abcb1b-rat in heart,liver,spleen,kidney, brain,thymus permilligram.Fig.8 The Abcb1 mRNA expression level ofwild type rat and Abcb1 humanized rat in different tissues detected by Real-time PCR

比,BAC法[17]不僅將待研究的目的基因轉入到動物體中,而且其啟動子及上下游的調控序列也同時被轉入動物體中,更好模擬人類基因功能。

P-糖蛋白最早于1976年由Juliao和Ling等[18]在秋水仙堿耐藥的中國倉鼠卵巢細胞中發(fā)現(xiàn),但隨后的研究表明其廣泛存在于機體的各個組織[19],P-糖蛋白是第一個被發(fā)現(xiàn)的人類ABC轉運蛋白,之后在嚙齒類動物中也發(fā)現(xiàn)了此類蛋白,它是一種能量性依賴的跨膜輸出泵,可將抗腫瘤藥物逆濃度從細胞內(nèi)轉運至細胞外,降低胞內(nèi)濃度并導致多藥耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生。人體中P-糖蛋白首先在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn),之后的研究表明它在人體正常組織中也廣泛表達,例如腸道上皮細胞,肝細胞毛細膽管膜,腎近曲小管上皮細胞,血腦屏障毛細血管內(nèi)皮細胞等。它能防止機體對有害物質的吸收和介導物質的輸出,保護大腦,睪丸,胎兒等重要器官,人體中Abcb1基因控制表達的P-糖蛋白與藥物分布和轉運密切相關[20]。P-糖蛋白能利用機體中的ATP將已進入細胞的外源性的藥物毒物轉運出來,降低細胞內(nèi)藥物毒物濃度[21]。

種屬差異是造成藥物在臨床試驗后被淘汰的原因之一[22-24],制備穩(wěn)定可靠的實驗動物模型是關系到實驗結果真實可靠的重要影響因素[25]。

大鼠基因組中,有兩個同源基因 Abcb1a及Abcb1b編碼P-糖蛋白,二者氨基酸序列相似性為85%,與同源的人類Abcb1的氨基酸相似性＞80%,大鼠的Abcb1a及Abcb1b基因與人類的Abcb1基因同樣對抗抗癌藥物,阻止其進入靶器官。Abcb1a與Abcb1b基因在組織器官的分布不同但總體清況與人類的Abcb1基因是一致的,它們與人類的Abcb1基因承擔著相同的功能。Abcb1a主要分布在大腦,小腸,肝臟,腎臟,而Abcb1b主要分布在腎上腺,子宮內(nèi)膜,子宮,卵巢,胎盤,肝臟,腎臟及腦實質[1]。本研究用人源的Abcb1基因替換了大鼠的Abcb1b基因,為Abcb1相關藥物提供實驗動物模型,而用人源的Abcb1基因替代Abcb1a及Abcb1b雙基因的模型我們將在接下來的工作中進行研究。

本研究制作出的Abcb1人源化實驗動物模型,其內(nèi)源的Abcb1b基因采用CRISPR/Cas9[26-27]的方法敲除,與鋅指核酶(ZFNs)技術[28]、轉錄激活樣效應因子(Talens)技術[29]相比,設計和構建過程相對簡單。

根據(jù)從 Expression Atlas(http://www.ebi.ac.uk/gxa/home)得到的基于微陣列和RNA序列分析的信息,人體中主要組織Abcb1表達水平從高到低依次為腎(29),肝(17),胸腺(1),心(0.7),在人體大腦組織中也有Abcb1基因表達[30-31]。從本研究中可以看出在野生型大鼠體內(nèi)各組織Abcb1b表達水平從高到低為肝,腦,心,腎。本研究培育出的Abcb1人源化大鼠體內(nèi)轉入的Abcb1-BAC片段是完整的,經(jīng)過Real-time PCR的方法定量分析顯示h-Abcb1在大鼠體內(nèi)按表達量高低排序為腦,腎,肝,心,這與人體中Abcb1在各組織表達趨勢是一致的。

因此,本研究建立的Abcb1人源化動物模型組織表達譜更接近人類,為相關藥物分析及評價提供了有價值的實驗動物模型。

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Establishment of Abcb1 knock out rat and Abcb1 humanized ratmodels

MA Jing,CHENWei,ZHANG Xu,MA Yuan-wu,LV Dan,GAO Hong,ZHANG Lian-feng
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine,Ministry of Health,Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)＆Peking Union Medical College(PUMC),Beijing 100021,China,)

Objective To knock out the Abcb1 gene of rat,and establish the Abcb1 humanized ratmodel based on the Abcb1 knock out rat.M ethods The animalmodelwas established using BAC and CRISPR/Cas9 technology,and was analyzed by PCR,RT-PCR and real-time PCR.Results Establishing a rat model expressing human Abcb1 stably by transfer the 153 kb BAC containing human Abcb1 promoter and cDNA into rat genome,and establishing the Abcb1 knock out rat at the same time.Establishing the Abcb1 humanized model by crossing these two strains together.The expression pattern of Abcb1 in Abcb1 humanized rat is different from the wild type rat.The Abcb1 humanized model express notonly the human Abcb1 gene butalso has similar expression pattern as human.Conclusions The Abcb1 knock out ratand the Abcb1 humanized ratwere successfully established,and thismodel is close to human concerning about the drugmetabolism related to Abcb1.

Abcb1;Humanized;BAC;Gene knock out rat

R332

A

1671-7856(2015)03-0001-08

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.003.01

2015-02-04

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項課題基于人源化模型和肝臟生物功能網(wǎng)絡的藥物肝毒性預測關鍵新技術(2012ZX09301001-006)。

馬婧(1991-),女,碩士生,研究方向:比較醫(yī)學。E-mail:alanyingtao519@163.com。

張連峰,E-mail:zhanglf@cnilas.org;高虹,E-mail:gaohongdws@aliyun.com。