正常產(chǎn)婦羊水、血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜分析的研究

朱斌 周堅(jiān) 陳芳 黎麗紅 葉志海 夏魯全

基礎(chǔ)研究論著

正常產(chǎn)婦羊水、血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜分析的研究

朱斌 周堅(jiān) 陳芳 黎麗紅 葉志海 夏魯全

目的比對羊水、血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜，尋找羊水特異性表達(dá)蛋白，為產(chǎn)科學(xué)的臨床研究提供分子依據(jù)。方法應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀采用4種不同原理的蛋白芯片檢測了12名正常足月產(chǎn)婦的羊水、血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜。結(jié)果羊水和血漿標(biāo)本分別測得蛋白信號(信噪比大于3)150個和250個。4種芯片檢出羊水特異性蛋白30個，相對分子質(zhì)量為11 198、12705 Da的蛋白是比較確定的羊水特異性蛋白。結(jié)論羊水中存在特異性表達(dá)蛋白，其在妊娠相關(guān)生理、病理學(xué)中可能起重要作用。

羊水；血漿；蛋白質(zhì)指紋圖譜

羊水對于胎兒的發(fā)育至關(guān)重要，羊水中蛋白可能與妊娠相關(guān)性疾病發(fā)生有關(guān)[1]。羊水和孕婦血漿中的蛋白質(zhì)譜研究是尋找標(biāo)志物的重要途徑。表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)是隨著蛋白組學(xué)興起而出現(xiàn)的新技術(shù)，是一種基于蛋白質(zhì)芯片和質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)指紋圖譜分析平臺[2-7]。為尋找羊水特異性標(biāo)志蛋白，本研究采用SELDI-TOF-MS分析12例正常足月產(chǎn)婦的羊水和血漿蛋白質(zhì)組學(xué)，繪制并比對羊水和血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜，旨在為產(chǎn)科學(xué)領(lǐng)域的研究提供可能的分子依據(jù)。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

選擇產(chǎn)檢正常、足月?lián)衿谛衅蕦m產(chǎn)的12例產(chǎn)婦為研究對象。術(shù)中行羊膜腔穿刺獲得羊水標(biāo)本，同時(shí)靜脈穿刺采集靜脈血5 ml，肝素抗凝，分離血漿后與羊水標(biāo)本置-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

二、主要儀器與試劑

采用PBSⅡc型SELD1-TOF-MS質(zhì)譜儀，WCX2離子交換型、IMC3金屬螯合型、50反相型和Goldchip型蛋白芯片均為美國Liphergen公司產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)用水和試劑全部采用美國Sigma公司產(chǎn)品。

三、方法

血漿和羊水標(biāo)本均采用相同的實(shí)驗(yàn)方法，共完成12對樣品的檢測。為保證檢測的完整性和全面性，使樣品中不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)均被吸附而可檢測，本研究采用4種不同原理的蛋白芯片，即WCX2離子交換型、IMC3金屬螯合型、H50反相型和Goldchip型蛋白芯片，均嚴(yán)格按照芯片說明書操作，檢測相對分子質(zhì)量范圍1 000～180 000 Da。檢測獲得的血漿和羊水的蛋白質(zhì)指紋圖譜用Ciphergen Protein Chip軟件校正分子量、總離子強(qiáng)度、篩選和標(biāo)記信號，根據(jù)各信號的信息進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析[8-9]。

結(jié) 果

一、羊水特異性表達(dá)蛋白質(zhì)指標(biāo)圖譜及分子量

羊水和血漿標(biāo)本分別測得蛋白信號(信噪比大于3)150個和250個。4種芯片檢出羊水特異性的蛋白共計(jì)30個(圖1)。其中，相對分子質(zhì)量為11 198、12 705 Da的2種蛋白是比較確定的羊水特異性蛋白。

圖1 4種蛋白芯片測得的羊水特異性表達(dá)蛋白質(zhì)結(jié)果

上方：血清檢測結(jié)果；下方：羊水檢測結(jié)果；A～E：WCXZ交換型芯片結(jié)果，所標(biāo)注的相對分子質(zhì)量依次分別為3 720、3 737、3 925、5 392、2 432、5 518、5 605、5 810、5 880、7 362、7 475、7 931、9 972、10 108、11 022、11 062、11 198、11 953、12 705、14 704、14 918、17 118、17 453 Da；F、G：IMC3金屬螯合型芯片結(jié)果，所標(biāo)注的相對分子質(zhì)量依次分別為3 449、10 839、11 204、11 307、12 693 Da；H、I：H50反相型芯片結(jié)果，所標(biāo)注的相對分子質(zhì)量依次分別為7 524、7 975 Da；J：GoldChip金芯片結(jié)果，所標(biāo)注的相對分子質(zhì)量依次分別為10 893、11 780、14 733 Da

二、4種芯片在羊水特異性蛋白的檢測結(jié)果

30種羊水特異性蛋白中，WCX2交換型芯片檢出38種(95%)，IMC3金屬螯合型芯片檢出12種(30%)，H50反相芯片檢出11種(28%)，GoldChip檢出9種(23%)。

表1 4種芯片檢測結(jié)果的比較

注： +，僅存在羊水中；+-，僅存在羊水標(biāo)本中且并非12份羊水標(biāo)本中均有；-，羊水和血漿樣品均存在；×，未檢測到；由于使用H50芯片和GoldChip金芯片做檢測時(shí)，樣品沒有用尿素做預(yù)處理，同一個蛋白在H50芯片和GoldChip芯片上檢測到的分子量較在WCX2和IMC3芯片上檢測到的相對分子質(zhì)量大40～60 Da，本表相對分子質(zhì)量以WCX2和IMC3上測得的為準(zhǔn)。

討 論

根據(jù)質(zhì)譜技術(shù)的原理，蛋白信號在橫軸上的位置及強(qiáng)度分別與蛋白的相對分子質(zhì)量及蛋白含量有著對應(yīng)關(guān)系。因此，蛋白芯片上出現(xiàn)蛋白信號即說明存在相應(yīng)分子蛋白，并且可以判斷該蛋白的含量。由此，我們判斷某個信號是否具羊水特異性的標(biāo)準(zhǔn)是：羊水中的信號強(qiáng)度與血清中的信號強(qiáng)度比值大于10。本研究在羊水中測得蛋白信號約150個，在血清中測得蛋白信號約250個。此外，本研究中所用的4種蛋白芯片分別依據(jù)蛋白質(zhì)的4種不同屬性進(jìn)行檢測，故任一芯片上出現(xiàn)羊水特異性信號即認(rèn)為此信號對應(yīng)的蛋白是羊水特異性蛋白。通過綜合分析4種類型芯片的蛋白信號結(jié)果，本研究最后認(rèn)定在4種類型芯片上表現(xiàn)出羊水特異性的蛋白共計(jì)30個，其相對分子質(zhì)量主要集中在7 000～18 000 Da。

同一蛋白在不同類型芯片上可有不同的差異，這是由蛋白自身的性質(zhì)和在標(biāo)本中的含量決定的，譬如11 953、14 704、14 918 Da蛋白在WCX2芯片上表現(xiàn)出有無的差異，在IMC3芯片上表現(xiàn)不出有無的差異，而僅有強(qiáng)度的差別，這說明該類蛋白具有較強(qiáng)的親金屬離子性質(zhì)，在血清和羊水中的含量有較大差異。

對于4類原理不同的芯片，可以認(rèn)為在H50和GoldChip芯片上獲得的是標(biāo)本中蛋白的天然情況，在WCX2和IMC3芯片獲得的是樣品中蛋白的部分變性增溶后的情況。在WCX2、IMC3、H50芯片上檢測到的是選擇性結(jié)合的蛋白，信號的強(qiáng)度與蛋白的性質(zhì)和含量有關(guān)，在GoldChip芯片上檢測到的為非選擇性結(jié)合的蛋白，信號的強(qiáng)度僅與蛋白含量有關(guān)，在WCX2芯片上檢出3 720～5 810 Da的8個蛋白，在其他芯片上并未檢出，這是因?yàn)槭褂肳CX2芯片時(shí)，樣品在預(yù)處理過程中使用了還原劑打開二硫鍵。

根據(jù)各芯片提供的信號判斷，在各類芯片上表現(xiàn)出羊水特異性的蛋白大多不是羊水特有的，相對血漿而言，羊水中有更高的濃度。綜合分析篩選出的30個蛋白在4種芯片上的信號情況，篩選出未在血清檢測到(即沒有“-”信號)且能被更多種類蛋白芯片檢測到(即“+”更多)的蛋白，結(jié)果顯示相對分子質(zhì)量為11 198、12 705 Da是比較確定的羊水特異性蛋白，但血漿中是否完全沒有此類蛋白有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：林燕薇)

Analysisoffingerprintpatternsofamnioticfluidandplasmaproteinsinhealthypregnantwomen

ZhuBin,ZhouJian,ChenFang,LiLihong,YeZhihai,XiaLuquan.

DepartmentofGynecologicalOncolagy,HexianMemorialHospitalPanyu,Guangzhou511400,China

,ZhuBin,E-mail：2547695010@qq.com

ObjectiveTo explore the proteins specifically-expressed in the amniotic fluid (AF) by comparing the fingerprint patterns of in the AF and plasma proteins, aiming to provide molecular evidence for obstetrics research.MethodsSurface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) with four different protein-chips was utilized to investigate the fingerprint patterns of AF and plasma proteins from 12 healthy full-term pregnant women.ResultsIn total, 150 protein signals (signal-to-noise ratio>3) were detected in the AF and 250 in the plasma. Thirty proteins were detected specifically expressed in the AF using four types of protein-chips. The proteins with a molecular weight of 11198 Da and 12705 Da were confirmed to be specifically expressed in the AF.ConclusionThe AF contains specifically-expressed proteins, which probably play a vital role in the physiological and pathological progresses during pregnancy.

Amniotic fluid; Plasma; Protein fingerprint pattern

10.3969/g.issn.0253-9802.2015.08.006

廣東省科技廳社會發(fā)展領(lǐng)域科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010B031600179)

511400 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)附屬何賢紀(jì)念醫(yī)院婦產(chǎn)科(朱斌，周堅(jiān)，陳芳，黎麗紅);519080 珠海，百奧生物工程有限公司(葉志海，夏魯全)

，朱斌，E-mail：2547695010@qq.com

2015-03-22)