三丁基氯化錫對僧帽牡蠣淀粉酶和脂肪酶活性的影響

陳細(xì)香,2，吳文杰，劉雯霞

(1.福建泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362000；2.泉州師范學(xué)院分子生物與藥物化學(xué)福建省高校重點實驗室，福建 泉州 362000)

·生物工程·

三丁基氯化錫對僧帽牡蠣淀粉酶和脂肪酶活性的影響

陳細(xì)香1,2，吳文杰1，劉雯霞1

(1.福建泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362000；2.泉州師范學(xué)院分子生物與藥物化學(xué)福建省高校重點實驗室，福建 泉州 362000)

為研究三丁基氯化錫(TBTCL)對僧帽牡蠣消化酶活性的影響，將僧帽牡蠣分別在TBTCL質(zhì)量濃度為0、2、5、10、50、100 ng·L-1的共6 組實驗海水中培養(yǎng)4 d，以酶學(xué)分析的方法測定消化腺淀粉酶和脂肪酶活性。結(jié)果表明不同質(zhì)量濃度TBTCL對僧帽牡蠣淀粉酶、脂肪酶活力的影響表現(xiàn)出不同的變化趨勢：TBTCL對僧帽牡蠣消化腺淀粉酶活性總體呈顯著抑制作用(P<0.05)，表現(xiàn)為從強(qiáng)到弱再強(qiáng)的拋物線趨勢，在10 ng/L的質(zhì)量濃度時TBTCL對淀粉酶活力的抑制作用最弱，呈顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系；各質(zhì)量濃度TBTCL對脂肪酶活性具誘導(dǎo)效應(yīng)，低質(zhì)量濃度(2 ng·L-1,5 ng·L-1)誘導(dǎo)作用較強(qiáng)，隨著質(zhì)量濃度的升高，誘導(dǎo)作用減弱，呈顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

僧帽牡蠣；三丁基氯化錫；淀粉酶；脂肪酶；消化腺

有機(jī)錫化合物廣泛應(yīng)用于殺蟲劑、海洋船舶的防污涂料，被認(rèn)為是迄今為止人為引入海洋環(huán)境的毒性最大的化合物之一，對非靶生物有很強(qiáng)的毒害作用。由于其長期殘留性，易于在海洋生物中蓄積，食用海產(chǎn)品可能存在遭TBT污染的潛在危險[1]。已經(jīng)有大量研究證明了有機(jī)錫化合物對生物的生存、生長、發(fā)育、繁殖存在不良影響[2-5]，甚至環(huán)境中極低的有機(jī)錫含量(ng·L-1) 就會對生物產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用[6-7]。目前我國海水遭到了嚴(yán)重的TBT污染，海水中污染水平從<0.5 ng·L-1到976.9 ng·L-1，污染比較嚴(yán)重的地方都集中在較大的港口、碼頭、船廠附近[8]。三丁基氯化錫(tributyltin chloride，TBTCL)是TBT在水中的主要存在形式，是一種高毒性化合物[9]。本文研究TBTCL對僧帽牡蠣(Ostreacucullata)消化酶(包括淀粉酶、脂肪酶)部分性質(zhì)的影響，探討將海洋雙殼類酶活性等作為監(jiān)測海洋錫污染的監(jiān)測指標(biāo)的可行性，為餐桌食品污染的防患、無公害水產(chǎn)品的生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

UV759紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、Centrifuge5415R冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf)等。

1.1.2 試劑

?；仕偃芎Ｋ?俗稱海鹽)、牛血清白蛋白(99%，上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品)、考馬斯亮藍(lán)G-250(Fluka 產(chǎn)品)、三丁基氯化錫(98%，上海紫業(yè)化工有限公司)，其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗材料

實驗采用健康牡蠣，購自泉州潯埔海鮮世界大型超市，體質(zhì)量25.69～38.12 g，貝高2.29～2.78 cm，貝長6.29～7.34 cm。實驗前將購買回來的牡蠣在實驗室內(nèi)暫養(yǎng)1周，待其狀態(tài)穩(wěn)定后選取大小一致、活力好的個體用于實驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 染毒處理

TBTCL用無水乙醇溶解定容，配制 Sn 10 μg·L-1母液，備用，實驗時稀釋配制成所需質(zhì)量濃度的試驗液?？瞻讓φ战M加相應(yīng)量無水乙醇(控制在0.05 mL·L-1水)。實驗用水由符合中國沿海海水成分研制的海鹽溶解于雙蒸水(經(jīng)雙道原子熒光光度法測定，總錫未測出)配制而成。實驗期間水溫23～25 ℃，鹽度30～32。僧帽牡蠣放置于含60 L砂濾海水的養(yǎng)殖玻璃箱內(nèi)，24 h充氣，投餌。

根據(jù)環(huán)境部門規(guī)定的允許水平[10]及污染海域環(huán)境中有機(jī)錫質(zhì)量濃度[11]，設(shè)置1個空白對照組和5個質(zhì)量濃度梯度實驗組，其質(zhì)量濃度分別為0、2、5、10、50和100 ng·L-1，并且分別做3組平行實驗。每24 h換水一次，同時添加污染物，使TBTCL暴露組質(zhì)量濃度保持在設(shè)定質(zhì)量濃度，染毒1、2、3和4 d后取樣。

1.3.2 粗酶液提取

從實驗組中分別隨機(jī)取出牡蠣樣品6只，去其外殼取出軟組織，用蒸餾水沖洗其軟體組織數(shù)次，冰浴下快速活體解剖，取出消化腺，并用濾紙拭干后稱量，以8倍體積預(yù)冷磷酸緩沖液冰浴勻漿，4 ℃離心(12 000 r·min-1，30 min)，取上清液(即粗酶提取液)，置于-80 ℃冰箱中冷凍保存至待測。脂肪酶活性測定用的粗酶液不需離心。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量測定

粗酶提取液中蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法測定[12]。

1.3.4 酶活性測定

采用Bernfeld法[13]測定淀粉酶活性，采用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法[14]測定脂肪酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計處理。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E.)表示。用方差分析方法分析TBTCL污染引起的差異；用Duncun’s 法對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性顯著分析，P<0.05 認(rèn)為是差異顯著，P<0.01認(rèn)為是差異極顯著；用雙因素方差分析方法分析三丁基氯化錫TBTCL 劑量和時間交互作用的顯著性。統(tǒng)計軟件為SPSS 13.0 for Windows，作圖軟件為OriginPro7.5。

2 結(jié)果

2.1 三丁基氯化錫(TBTCL)對僧帽牡蠣淀粉酶活性的影響

在消化腺中，淀粉酶的活性與TBTCL質(zhì)量濃度和處理時間存在著一定的時間劑量效應(yīng)關(guān)系(表1，圖1)。在對照組(0 ng·L-1)中，淀粉酶的活性在整個實驗周期內(nèi)沒有顯著變化(P>0.05)。在2、5、10、50、100 ng·L-1的各質(zhì)量濃度三丁基氯化錫(TBTCL)脅迫下，僧帽牡蠣消化腺的淀粉酶活性均低于0 ng·L-1對照組，該5個實驗質(zhì)量濃度下的三丁基氯化錫(TBTCL)均起到抑制作用。在2 ng·L-1的低質(zhì)量濃度下即表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.05)，而后隨TBTCL質(zhì)量濃度的升高，淀粉酶活性升高，抑制作用減弱，在10 ng·L-1的質(zhì)量濃度下，淀粉酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他TBTCL質(zhì)量濃度脅迫下的活性，但仍低于對照組，表現(xiàn)為不顯著的抑制作用(P>0.05)。50 ng·L-1的TBTCL質(zhì)量濃度脅迫下，淀粉酶活性開始呈下降趨勢，抑制作用顯著增強(qiáng)。在TBTCL不同質(zhì)量濃度的脅迫下，僧帽牡蠣消化腺淀粉酶活性表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。2、5、10、50、100 ng·L-1的各染毒質(zhì)量濃度下，1、2和3 d的抑制程度差異不顯著(P>0.05)，但與4 d的抑制程度均有顯著差異(P<0.05)。

表1 TBTCL對僧帽牡蠣淀粉酶活性的影響

注：同行數(shù)值上標(biāo)大寫字母不相同，表明差異顯著(P<0.05)；同列數(shù)值上標(biāo)小寫字母不相同，表明差異顯著(P<0.05)。

圖1 三丁基氯化錫(TBTCL)對僧帽牡蠣淀粉酶活性影響的劑量-效應(yīng)曲線

雙因素方差分析(表2)表明，時間對帽牡蠣消化腺淀粉酶活性存在顯著差異(P<0.05)，質(zhì)量濃度對帽牡蠣消化腺淀粉酶活性存在極顯著差異(P<0.01)，但質(zhì)量濃度與時間交互作用不存在顯著差異(P>0.05)。

表2 TBTCL對僧帽牡蠣淀粉酶活性影響的雙因素方差分析表

2.2 三丁基氯化錫(TBTCL)對僧帽牡蠣脂肪酶酶活性的影響

由表3 可知，0 ng·L-1三丁基氯化錫污染下，實驗周期內(nèi)僧帽牡蠣消化腺內(nèi)脂肪酶活性變化差異不顯著(P>0.05)。在2、5、10、50 ng·L-1的各質(zhì)量濃度的三丁基氯化錫(TBTCL)脅迫下，脂肪酶活性均高于0 ng·L-1對照組，均起到誘導(dǎo)作用；100 ng·L-1質(zhì)量濃度組雖然在第1d時脂肪酶活性為9.99 U·mg-1，略低于對照組，但差異不顯著，所以，整體趨勢上也表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用。1、2 和3 d內(nèi)，5、10、50 ng·L-1染毒質(zhì)量濃度下，三丁基氯化錫TBTCL的誘導(dǎo)程度均有顯著差異(P<0.05)，第4 d脂肪酶活性顯著下降，誘導(dǎo)效應(yīng)減弱。

表3 TBTCL對僧帽牡蠣脂肪酶活性的影響

注：同行數(shù)值上標(biāo)大寫字母不相同，表明差異顯著(P<0.05)；同列數(shù)值上標(biāo)小寫字母不相同，表明差異顯著(P<0.05)。

由圖2可知：實驗周期內(nèi)，2～100 ng·L-1的質(zhì)量濃度內(nèi)，三丁基氯化錫對僧帽牡蠣消化腺脂肪酶活性呈誘導(dǎo)作用，2 ng·L-1時增強(qiáng)率最大，為24.85%；但隨TBTCL質(zhì)量濃度增高，誘導(dǎo)效應(yīng)減弱，增強(qiáng)率降低。脂肪酶酶活性存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖2 三丁基氯化錫(TBTCL)對僧帽牡

雙因素方差分析(表4)表明，時間和質(zhì)量濃度對帽牡蠣消化腺脂肪酶活性存在極顯著差異(P<0.01)，但質(zhì)量濃度與時間交互作用的差異不顯著(P>0.05)。

表4 TBTCL對僧帽牡蠣脂肪酶活性影響的雙因素方差分析表

3 討論

消化酶是按酶的功能進(jìn)行分類的諸多酶中的一種，具有酶的所有特征，而貝類消化酶活性是反映貝類動物消化生理機(jī)能的一項重要指標(biāo)，與貝類生活的環(huán)境、食性有很大關(guān)系[15]。有研究表明在TBT污染下，對于貝類而言，其有機(jī)錫含量為外套膜>鰓>肝臟>解剖剩余物>消化道>肌肉，這說明TBT較易被吸附在肝臟中[16]。僧帽牡蠣營固著生活，濾食性，較MBT 和DBT 而言，TBT 更易吸附在水體懸浮顆粒物上[17]而被濾食性貝類所獲取，通過血液循環(huán)進(jìn)入消化腺中。僧帽牡蠣消化腺中包含肝組織，而肝是魚貝類的的重要器官，它負(fù)責(zé)對消化酶的合成和分泌以及隨后對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而且也影響排泄、生長繁殖周期、無機(jī)物質(zhì)的貯藏和脂類、糖類代謝，從而引起消化酶的活性變化。

本研究中，TBTCL對僧帽牡蠣消化腺淀粉酶和脂肪酶活性呈現(xiàn)不同變化趨勢。淀粉酶總體呈顯著抑制作用(P<0.05) ，與大多數(shù)環(huán)境脅迫下體內(nèi)生化酶的變化規(guī)律一致，脂肪酶的變化趨勢則起誘導(dǎo)作用。

2007年，Blumberg等提出“環(huán)境致肥因子”的概念，并提出了第一批候選致肥因子，其中包括有機(jī)錫[18]。已有研究證實，TBT 可作為視黃類X 受體(retinoid X receptor，RXR)和過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)的配體，干擾脂肪代謝[19-21]。在實驗中，TBTCL對脂肪酶活性有很大影響，整體表現(xiàn)為誘導(dǎo)。脂肪酶是以脂肪為底物的一類消化酶，實驗結(jié)果表明TBTCL脅迫后僧帽牡蠣對脂類的消化能力增強(qiáng)，預(yù)示TBTCL對僧帽牡蠣而言也是一種“環(huán)境致肥因子”。

本實驗顯示，三丁基氯化錫在2 ng·L-1時就能對僧帽牡蠣淀粉酶和脂肪酶活性起到較強(qiáng)的刺激作用，且浮游生物對有機(jī)錫有明顯的富集作用，港口附近的浮游生物體內(nèi)有機(jī)錫含量可達(dá)670～800 ng·g-1(干質(zhì)量)[22]，遠(yuǎn)高于環(huán)境質(zhì)量濃度。軟體動物體內(nèi)能夠累積較高質(zhì)量濃度的有機(jī)錫，例如貝類可以從環(huán)境中迅速吸收、富集有機(jī)錫，使體內(nèi)有機(jī)錫含量達(dá)到22 ng·g-1(濕質(zhì)量)，高于環(huán)境5 000～6萬倍[23]，因此必須加強(qiáng)養(yǎng)殖海區(qū)水質(zhì)檢測和管理。此外，僧帽牡蠣全部營附著生活，比魚類更適合作為局部海域環(huán)境污染監(jiān)測生物。

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(編校：葉超)

EffectofTributyltinChlorideonAmylaseandLipaseActivityinOstreaCucullata

CHEN Xi-xiang1,2，WU Wen-jie1，LIU Wen-xia1

(1.SchoolofChemistry&LifeScience,QuanzhouNormalUniversity,Quanzhou362000China；2.KeyLaboratoryofMolecularBiologyandMediceinalchemistry,QuanzhouNormalUniversity,Quanzhou362000China)

To study the effect of tributyltin chloride on amylase and lipase activity in digestive gland,Ostreacucullatawere exposed to the tributyltin chloride of six different concentrations(0, 2 , 5, 10 , 50 and 100 ng·L-1). After treatment of 1,2,3 and 4 d, the specific activities of amylase and lipase in theO.cucullatawere analyzed by using enzyme analytical method respectively. It showed that (1) TBTCL had a marked inhibition effect on amylase activity in the digestive gland (P<0.05) and the variation showed a parabola trend. There was the least inhibition effect at 10 ng·L-1. It represented a dose-effect relationship. (2) In the different concentration of TBTCL, lipase activity was induced significantly (P<0.05). There was higher induction at lower concentrations(2 ng·L-1and 5 ng·L-1). The degree of induction by TBTCL decreased with the increase of TBTCL concentration. The phenomena above suggested that lipase activity was significantly related to the exposure dosage. Thus, it was deduced that the activity of amylase and lipase inO.cucullatashow different variation patterns under different concentrations of TBTCL.

Ostreacucullata；tributyltin chloride；amylase；lipase；digestive gland

2014-02-17

福建省科技廳青年科技人才創(chuàng)新項目(2008F3095)；福建省高校服務(wù)海西建設(shè)重點項目( A102) ；碩士學(xué)位授予單位立項建設(shè)學(xué)科(生物學(xué))

陳細(xì)香(1972—)，女，副教授，博士，主要研究方向為環(huán)境生態(tài)學(xué)。

Q556; X17115

：A

：1673-159X(2015)01-0093-05

10.3969/j.issn.1673-159X.2015.01.017