杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾光感受器細(xì)胞保護(hù)及視網(wǎng)膜重塑相關(guān)研究＊

吳晗晗，徐 靜，郭 紅，杜霄燁，崔金剛，張 騰，陳 瑜

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海市中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所 上海 200437）

正常視網(wǎng)膜由光感受器細(xì)胞將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，傳遞至視網(wǎng)膜二級(jí)神經(jīng)元、三級(jí)神經(jīng)元，進(jìn)一步傳遞至腦，產(chǎn)生完整的視覺。以光感受器細(xì)胞退行性改變?yōu)楹诵牟±肀憩F(xiàn)的視網(wǎng)膜退行性病變是多種神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共同參與的復(fù)雜疾病，可見于視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis pigmentosa，RP）、年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）和Stargardt ?。⊿targardt disease，SD）等。RP 通常在于兒童和青年人中引起失明[1]，AMD 主要發(fā)生于55 歲以上成年人，到2020年將影響全球1.96 億人[2]，而SD 則是常見的遺傳性青少年黃斑變性[3]。這些疾病盡管有不同的病因和人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征，但都呈現(xiàn)出以光感受器細(xì)胞破壞、丟失為病理機(jī)制的視覺損害[4]。上述視網(wǎng)膜退行性疾病病理進(jìn)程的不同階段中，可累及光感受器細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，伴隨著視網(wǎng)膜外層神經(jīng)元的退行性改變，視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元逐漸解體，視網(wǎng)膜神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)受損，導(dǎo)致病理性視網(wǎng)膜重塑的發(fā)生，最終形成進(jìn)行性不可逆的視覺損害甚至失明[5]。

目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對(duì)以光感受器細(xì)胞退行性改變?yōu)楹诵牟±淼南嚓P(guān)視網(wǎng)膜退行性疾病的治療尚無(wú)有效手段，新藥的研發(fā)需要大量的時(shí)間和成本，而發(fā)掘現(xiàn)有已知藥理概況藥物的新應(yīng)用可為視網(wǎng)膜退行性疾病提供新的治療思路[6]。美托洛爾是選擇性β1受體阻滯劑，在心血管疾病中應(yīng)用廣泛，課題組前期的研究提示在光損傷的小鼠模型中，美托洛爾腹腔給藥具有一定的光感受器細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)[7]。此外，基于中醫(yī)藥的干預(yù)手段在視網(wǎng)膜退行性疾病的防治中具有一定的效應(yīng)。經(jīng)典明目方劑杞菊地黃丸臨床應(yīng)用于糖尿病視網(wǎng)膜病變[8]、中心漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎[9]、年齡相關(guān)性黃斑變性[10]等多種眼底疾病的治療，但其明目效應(yīng)的細(xì)胞靶點(diǎn)及機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究采用光損傷小鼠模型模擬光感受器細(xì)胞退行性改變，探討杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾干預(yù)光感受器細(xì)胞退行性改變的可能的協(xié)同作用，杞菊地黃丸用量參考成人推薦范圍，酒石酸美托洛爾則使用亞臨床劑量（低于心血管疾病用藥劑量），以期為相關(guān)視網(wǎng)膜退行性疾病的治療提供部分臨床前理論與實(shí)驗(yàn)參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)BALB/c 小鼠，4 周齡，雌性，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（合格證號(hào)為：SCXK（滬）2012-0002），飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)室溫度：22±4℃，相對(duì)濕度40～60%，光照周期（12 h 光照/12 h 黑暗），自由進(jìn)食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

杞菊地黃丸（北京同仁堂，濃縮丸），國(guó)藥準(zhǔn)字Z19993069，產(chǎn)品批號(hào)：17072513/17071644；酒石酸美托洛爾（阿斯利康制藥有限公司，25 mg/片），國(guó)藥準(zhǔn)字H32025391，產(chǎn)品批號(hào)：1705128。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

白色熒光燈（45w）：Philips；FA1004B電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；光照度照度計(jì)，上海嘉定學(xué)聯(lián)儀器廠；光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT），視網(wǎng)膜電圖（Electroretinogram,ERG），NSIGHT 軟件，均來(lái)自美國(guó)Phoenix Research Labs；組織包埋機(jī)（EG1150C）、自動(dòng)脫水機(jī)（TP1020）、石蠟切片機(jī)（RM2235）、冰凍切片機(jī)（CM30505）、熒光顯微鏡（DM6000B），均來(lái)自德國(guó)Leica公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組

經(jīng)過(guò)兩周適應(yīng)性飼養(yǎng)，按照隨機(jī)數(shù)字分組法將BALB/c 小鼠分為正常對(duì)照組（No bright light，No BL），光損傷模型組（Bright light vehicle，BL_Vehicle），美托洛爾治療組（Bright light metoprolol，BL_MTP），杞菊地黃丸治療組（Bright light QJD，BL_QJD）及杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾治療組（Bright light_QJD+MTP，BL_QJD+MTP），每組各7只。

1.4.2 給藥與造模

杞菊地黃丸及酒石酸美托洛爾磨粉過(guò)篩后，按給藥量溶解，酒石酸美托洛爾3.2 mg·kg-1bw，杞菊地黃丸2.3g·kg-1bw 溶解，每只小鼠灌胃體積0.2 mL，溶劑為0.5%羧甲基纖維素鈉（超純水配置）。正常對(duì)照組和光損傷模型組以同體積0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃。

小鼠飼養(yǎng)至（20±1）g 隨機(jī)分組進(jìn)行灌胃，連續(xù)給藥7 天后暗適應(yīng)24 h，第8 d 給藥后15 min 進(jìn)行30 min光損傷造模，光照強(qiáng)度（10000±10）lux。光照結(jié)束后送回暗室，3 天后進(jìn)行ERG 檢測(cè)，7 天后進(jìn)行OCT檢測(cè)。

1.4.3 ERG檢測(cè)

正常對(duì)照組、光損傷模型組、美托洛爾治療組、杞菊地黃丸治療組及杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾治療組，按體重腹腔注射配制好混合麻醉溶液：甲苯噻嗪（8.25 mg·kg-1bw）和氯胺酮（82.5 mg·kg-1bw），擴(kuò)瞳滴用0.5%托吡卡胺滴眼液，羥丙甲纖維素溶液保濕。兩頰中央皮下插入紅色電極，黑色接地電極插入小鼠尾部表皮下，電極線固定。弱紅燈光下（5 lux）進(jìn)行試驗(yàn)。記錄條件：檢測(cè)a 波、b 波的通頻帶為2-1000 Hz，用不同強(qiáng)度的光進(jìn)行刺激，檢測(cè)視功能[11]。

1.4.4 OCT檢測(cè)

造模成功后7 天，小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉（200 mg·kg-1bw），雙眼予5 g·L-1的托吡卡胺擴(kuò)瞳3 min 后進(jìn)行活體OCT 影像采集、分析。并采用INSIGHT 軟件對(duì)OCT 成像圖片進(jìn)行外核層（outer nuclear layer，ONL）厚度的測(cè)量分析。

1.4.5 取材

OCT 檢測(cè)后脫頸處死取眼球，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋固定24 h、脫水、包埋，制作視網(wǎng)膜組織石蠟切片4 μm 備用；冰凍包埋則固定30 min 后從4%多聚甲醛中取出眼球，挑出晶狀體，剩下完好的視杯結(jié)構(gòu)。然后依次放入5%，10%，20%，40%的蔗糖溶液及40%蔗糖和O.C.T.（optimal cutting temperature，O.C.T.）冰凍包埋劑混合溶液中，4℃分別放置2 h 進(jìn)行脫水。最后經(jīng)O.C.T.冰凍包埋劑包埋冰凍，切片12 μm 存-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.6 HE染色

取石蠟切片，二甲苯脫蠟后，按照無(wú)水乙醇、90%乙醇、80%乙醇每缸分別浸泡2 min，流水沖10 min，稍控水后，浸入蘇木素溶液5 min，流水沖洗10 min，再經(jīng)伊紅染液2 min。拿起控液，入95%乙醇快速涮洗10次，經(jīng)水乙醇浸泡4 min，再入二甲苯浸泡4 min即可以中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察并采集照片。

1.4.7 免疫組織化學(xué)

視蛋白染色仍采用石蠟切片，經(jīng)熱修復(fù)后，封閉液封閉30 min，滴加鼠源視紫紅質(zhì)（rhodopsin，RHO）多克隆抗體（1:1000，novusbio），室溫孵育1 h，PBS浸洗3次，滴加Cy3標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1:1000，Sigma），室溫孵1 h，PBS 浸洗3 次，4′,6-二脒基-2-苯基吲（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）溶液封片后在熒光顯微鏡20 倍下觀察并拍照。中波敏感視蛋白（midwavelength sensitive cone opsin，M-opsin）步驟同上（一抗1:100，Millipore）；其余免疫熒光染色采用冰凍切片，PBS 洗去O.C.T.包埋劑，直接進(jìn)行封閉，后步驟同前，抗體濃度：蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PKCα）（1:5000，Sigma），鈣結(jié)合蛋白D（Calbindin-D）（1:1000，Abcam），膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（1:500，DAKO）。兔源一抗則采用Cy3標(biāo)記的羊抗兔的二抗（1:1000，Sigma）。

1.4.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，檢測(cè)數(shù)據(jù)正態(tài)性及方差齊性，采用方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果，數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±S.E.M）表示，P＜0.05 視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾顯著保護(hù)光感受器細(xì)胞結(jié)構(gòu)

與正常對(duì)照組完好的視網(wǎng)膜形態(tài)及ONL 厚度相比較，光損傷模型組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，ONL 厚度顯著變?。≒＜0.05）；與光損傷模型組相比較，美托洛爾及杞菊地黃丸治療組均可見不同程度的視網(wǎng)膜ONL 結(jié)構(gòu)破壞，其中美托洛爾給藥組視網(wǎng)膜ONL 形態(tài)與光損傷模型組相似，杞菊地黃丸治療組視網(wǎng)膜尚可見視網(wǎng)膜ONL 結(jié)構(gòu)層次，ONL 厚度測(cè)量結(jié)果表明美托洛爾與杞菊地黃丸治療組ONL 厚度較光損傷模型組增加（P＜0.05）；與光損傷模型組和美托洛爾治療組及杞菊地黃丸治療組相比較，杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾治療組小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，ONL 厚度顯著增厚（P＜0.05）。

HE 染色可見，正常對(duì)照組視網(wǎng)膜形態(tài)正常，光感受器細(xì)胞核排列整齊，內(nèi)核層與外核層分界清晰，外核層細(xì)胞排列整齊；與正常對(duì)照組比較，光損傷模型組外核層變薄，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞核排列紊亂，內(nèi)、外核層界線模糊，光感受器細(xì)胞內(nèi)、外節(jié)層結(jié)構(gòu)破壞；與光損傷模型組相比較，美托洛爾治療組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)無(wú)改善，杞菊地黃丸治療組，可見視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層界限，形態(tài)優(yōu)于模型組；與光損傷模型組和美托洛爾治療組及杞菊地黃丸治療組相比較，杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾治療組視網(wǎng)膜基本形態(tài)相對(duì)完好，結(jié)構(gòu)層次分明，光感受器細(xì)胞內(nèi)、外節(jié)層結(jié)構(gòu)清晰（見圖1、2）。

圖1 各組OCT檢測(cè)及HE染色結(jié)果

圖2 各組OCT檢測(cè)后ONL厚度測(cè)量結(jié)果

2.2 杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾顯著保護(hù)小鼠視功能

ERG 的a 波由光感受器細(xì)胞電位構(gòu)成，代表光感受器細(xì)胞的電活動(dòng)，因此a 波振幅減小代表光感受器細(xì)胞受抑制或損害，視覺細(xì)胞受到刺激興奮后產(chǎn)生的電位是b 波，b 波可能起源于雙極細(xì)胞，反應(yīng)的是視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞電位變化，若視網(wǎng)膜內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的完整性受損則b 波下降。圖3 分析結(jié)果提示，正常對(duì)照組的視網(wǎng)膜電圖振幅隨著光刺激增大而上升；與正常對(duì)照組相比較，光損傷模型組a/b 波振幅顯著下降（P＜0.05）；與光損傷模型組相比較，美托洛爾治療組小鼠視功能未見改善，杞菊地黃丸治療組視網(wǎng)膜電圖振幅增高（P＜0.05）；與光損傷模型組和美托洛爾治療組及杞菊地黃丸治療組相比較，杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾治療組顯著的提高了視網(wǎng)膜電圖a/b 波的振幅（P＜0.05）。因此杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾對(duì)視功能具有顯著的保護(hù)作用，不僅體現(xiàn)在一級(jí)神經(jīng)元功能的改善，對(duì)二級(jí)神經(jīng)元及視覺信號(hào)傳導(dǎo)完整性也具有積極的意義（見圖3）。

2.3 杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾顯著改善光損傷小鼠視網(wǎng)膜重構(gòu)

2.3.1 杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾顯著保護(hù)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能

視紫紅質(zhì)（Rhodopsin，RHO）特異性地表達(dá)于視桿細(xì)胞外節(jié)，中波視蛋白（mid-wavelength sensitive cone opsin，M-opsin）特異性地表達(dá)于視錐細(xì)胞外節(jié)。免疫組織化學(xué)分析結(jié)果表明，正常對(duì)照組光感受器細(xì)胞外節(jié)可見豐富分布的RHO 和M-opsin 的陽(yáng)性染色；與正常對(duì)照組比較，光損傷模型組RHO 和M-opsin 光感受器細(xì)胞外節(jié)免疫陽(yáng)性反應(yīng)顯著減弱；與光損傷模型組相比較，美托洛爾治療組及杞菊地黃丸治療組這兩種蛋白免疫陽(yáng)性染色并無(wú)改善；與光損傷模型組和美托洛爾治療組及杞菊地黃丸治療組相比較，杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾治療組視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞外節(jié)RHO和M-opsin免疫陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)（見圖4）。

圖3 杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾對(duì)視功能具有顯著保護(hù)作用

2.3.2 杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾顯著保護(hù)視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞結(jié)構(gòu)

蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PKCα）是雙極細(xì)胞的標(biāo)記物，常用于觀察光損傷小鼠視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞的變化[12]。該蛋白免疫組織化學(xué)分析表明，正常對(duì)照組外叢狀層（outer plexiform layer，OPL）可見豐富分布的PKCα 陽(yáng)性著染的雙極細(xì)胞樹突；與正常對(duì)照組比較，光損傷模型組視網(wǎng)膜外叢狀層PKCα 免疫陽(yáng)性反應(yīng)顯著減弱，雙極細(xì)胞的樹突和胞體都出現(xiàn)嚴(yán)重的缺失；與光損傷模型組相比較，美托洛爾治療組PKCα免疫陽(yáng)性染色未見改善，杞菊地黃丸治療組視網(wǎng)膜PKCα 免疫陽(yáng)性染色增強(qiáng)。與光損傷模型組和美托洛爾治療組及杞菊地黃丸治療組相比較，杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾治療組視網(wǎng)膜PKCα 免疫陽(yáng)性著染的雙極細(xì)胞胞體和樹突均增強(qiáng)（見圖5）。

2.3.3 杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾顯著保護(hù)視網(wǎng)膜水平細(xì)胞結(jié)構(gòu)

鈣結(jié)合蛋白D（Calbindin D）標(biāo)記水平細(xì)胞及其突觸[13]，水平細(xì)胞與雙極細(xì)胞一樣，屬于視網(wǎng)膜二級(jí)神經(jīng)元。Calbindin D 免疫組織化學(xué)評(píng)估表明，正常對(duì)照組視網(wǎng)膜Calbindin D 標(biāo)記的水平細(xì)胞樹突及胞體均有豐富表達(dá)；與正常對(duì)照組相比較，光損傷模型組在OPL 中Calbindin D 免疫陽(yáng)性染色顯著減弱；與光損傷模型組相比較，美托洛爾治療組視網(wǎng)膜Calbindin D 陽(yáng)性染色無(wú)差異，杞菊地黃丸治療組視網(wǎng)膜Calbindin D免疫陽(yáng)性著染的水平細(xì)胞增強(qiáng)。與光損傷模型組和美托洛爾治療組及杞菊地黃丸治療組相比較，杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾治療組視網(wǎng)膜外叢狀層Calbindin D 免疫陽(yáng)性染色標(biāo)記的水平細(xì)胞及其樹突均增強(qiáng)（見圖6）。

圖4 杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾顯著保護(hù)光損傷視網(wǎng)膜視錐和視桿細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能

圖5 杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾顯著保護(hù)光損傷視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞結(jié)構(gòu)

圖6 杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾顯著保護(hù)視網(wǎng)膜水平細(xì)胞結(jié)構(gòu)

2.3.4 杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾顯著抑制視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞異常增生

膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是Müller 細(xì)胞標(biāo)志物，Müller 細(xì)胞突起包饒著視網(wǎng)膜內(nèi)的神經(jīng)元細(xì)胞，維持視網(wǎng)膜的正常結(jié)構(gòu)并起到營(yíng)養(yǎng)視網(wǎng)膜等多種生理功能[14]，而在光損傷退行性病變中Müller 細(xì)胞膠質(zhì)異常增生、肥大并將視網(wǎng)膜分隔，阻礙視網(wǎng)膜損傷后結(jié)構(gòu)和功能的良性重塑。GFAP 免疫組織化學(xué)分析表明，正常對(duì)照組的Müller細(xì)胞纖維束集中于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)層，少量胞體存在于內(nèi)核層；與正常對(duì)照組相比較，光損傷模型組Müller細(xì)胞大量增生肥大貫穿整個(gè)視網(wǎng)膜全層；與光損傷模型組相比較，美托洛爾治療組、杞菊地黃丸治療組視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞增生狀況未見改善；與光損傷模型組和美托洛爾治療組及杞菊地黃丸治療組相比較，杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾治療組Müller細(xì)胞膠質(zhì)異常增生被抑制（見圖7）。

圖7 杞菊地黃丸聯(lián)合美托洛爾顯著抑制視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞異常增生

3 討論

以光感受器細(xì)胞退行性改變?yōu)楹诵牟±肀硇偷囊暰W(wǎng)膜退行性病變?cè)谥嗅t(yī)學(xué)理論體系中被歸入“內(nèi)障眼病”，可見于“視瞻昏渺、高風(fēng)雀目”[15]等癥狀相關(guān)的疾病過(guò)程中。《證治準(zhǔn)繩》提出“視瞻昏渺及肝腎不足之病，由于陰虛血少,精液耗盡”，為從肝腎論治視網(wǎng)膜退行性病變提供了一定的理論依據(jù)。杞菊地黃丸出自清·董西園《醫(yī)級(jí)寶鑒》，是經(jīng)典的明目方劑。該方以熟地黃、枸杞子滋補(bǔ)肝腎精血，共為君藥；山藥補(bǔ)脾陰而固精，山茱萸養(yǎng)肝腎精血，共為臣藥；茯苓平滲脾濕，牡丹皮清泄肝火，澤瀉泄腎濕濁，菊花清肝明目，四藥共為佐使。全方有滋補(bǔ)，有清泄，共奏滋腎養(yǎng)肝，清肝明目的功效[16]。視網(wǎng)膜退行性病變病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，研究表明氧化應(yīng)激參與其病理過(guò)程[17]。現(xiàn)代藥理研究表明，杞菊地黃丸內(nèi)的中藥含有如多糖，黃酮類化合物和三萜類化合物等多種抗氧化成分[18-19]，抗氧化可能是其視網(wǎng)膜保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制之一，有待進(jìn)一步探討。

G 蛋 白 偶 聯(lián) 受 體（g protein coupled receptors，GPCRs）介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最重要的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制之一，參與多種細(xì)胞生物學(xué)及病理生理學(xué)過(guò)程。本課題組前期研究結(jié)果提示GPCR 功能性改變是光感受器細(xì)胞退行性改變的上游機(jī)制之一[6]。此外，前期研究結(jié)果提示β1 腎上腺素能受體阻滯劑美托洛爾腹腔注射可顯著抑制光感受器細(xì)胞退行性改變[7]。本研究采用臨床常用的酒石酸美托洛爾進(jìn)行口服干預(yù)，對(duì)其亞臨床劑量的光感受器細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的研究（該劑量并未影響各組小鼠心率/血壓，未附數(shù)據(jù)）。

本研究結(jié)果表明，杞菊地黃丸與美托洛爾聯(lián)合給藥視網(wǎng)膜保護(hù)效應(yīng)顯著優(yōu)于杞菊地黃丸治療組和美托洛爾治療組。杞菊地黃丸與美托洛爾聯(lián)合給藥可顯著拮抗光損傷引起的光感受器細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的退行性改變，其視網(wǎng)膜功能的保護(hù)效應(yīng)可能與其保護(hù)光感受器細(xì)胞及視網(wǎng)膜二級(jí)神經(jīng)元（雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞）結(jié)構(gòu)，抑制Müller細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)性膠質(zhì)增生效應(yīng)相關(guān)。此外，值得注意的是，OCT 影像學(xué)分析雖然提示亞臨床用量口服美托洛爾治療具有部分光感受器細(xì)胞結(jié)構(gòu)保護(hù)效應(yīng)，但進(jìn)一步的功能和免疫組織化學(xué)分析結(jié)果表明殘存的光感受器細(xì)胞并不具備正常的生物學(xué)功能，提示非治療量的美托洛爾灌胃并不能發(fā)揮顯著的光感受器細(xì)胞保護(hù)的效應(yīng)；杞菊地黃丸具有一定的拮抗光損傷誘導(dǎo)光感受器細(xì)胞結(jié)構(gòu)及視網(wǎng)膜功能退行性改變的效應(yīng)，對(duì)視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞和水平細(xì)胞體現(xiàn)出一定的保護(hù)效應(yīng)，但對(duì)于光感受器細(xì)胞RHO 及M-Opsin 等功能蛋白的表達(dá)以及Müller 細(xì)胞反應(yīng)性膠質(zhì)增生等病理過(guò)程未體現(xiàn)出顯著的干預(yù)效應(yīng)，提示杞菊地黃丸單獨(dú)灌胃治療也不能實(shí)現(xiàn)促進(jìn)視網(wǎng)膜良性重塑的作用。而杞菊地黃丸與美托洛爾聯(lián)用在起到顯著的光感受器細(xì)胞及視網(wǎng)膜二級(jí)神經(jīng)元保護(hù)效應(yīng)的同時(shí)，顯著抑制反應(yīng)性膠質(zhì)增生，促進(jìn)視網(wǎng)膜良性重塑，提示杞菊地黃丸與美托洛爾兩藥聯(lián)用視網(wǎng)膜保護(hù)效應(yīng)顯著優(yōu)于兩藥單獨(dú)使用，具有顯著的協(xié)同效應(yīng)。

多種機(jī)制參與視網(wǎng)膜退行性病變的發(fā)生發(fā)展，多途徑多靶點(diǎn)的治療有助于復(fù)雜病理過(guò)程的有效干預(yù)[20]。光感受器細(xì)胞保護(hù)對(duì)于延緩相關(guān)視網(wǎng)膜退行性疾病進(jìn)程具有直接的意義，而促進(jìn)視網(wǎng)膜修復(fù)性重塑對(duì)視網(wǎng)膜退行性疾病的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后具有積極的意義。本研究揭示了杞菊地黃丸與美托洛爾聯(lián)合給藥對(duì)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)及視網(wǎng)膜重塑相關(guān)機(jī)制，提示了其在相關(guān)視網(wǎng)膜退行性疾病中可能的多途徑多環(huán)節(jié)多靶點(diǎn)的治療優(yōu)勢(shì)，為相關(guān)視網(wǎng)膜退行性疾病的治療提供了新的理論思路和部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。