視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞死亡規(guī)律的實(shí)驗(yàn)研究

董凱 柯根杰 武立云 朱子誠 許迅 孫曉東

視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment，RD)是一種常見的眼科疾病，病理過程復(fù)雜，致盲率高，光感受器細(xì)胞的不可逆損傷是導(dǎo)致RD患者視力損傷的主要原因［1-2］。本課題組根據(jù)前期研究［3］，提出如下假說:RD后光感受器細(xì)胞不僅有凋亡，同時(shí)存在有程序性壞死，如壞死性凋亡。但是，目前在RD中尚不清楚光感受器細(xì)胞壞死的時(shí)間分布規(guī)律，所以本研究擬通過建立RD模型，研究光感受器細(xì)胞凋亡和壞死的時(shí)間分布規(guī)律，為進(jìn)一步研究程序性壞死提供較為理想的干預(yù)和檢測的時(shí)間靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)動物選用雄性健康的 Sprague-Dawley大鼠24只，體質(zhì)量260～280 g，由上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院提供，所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵守美國視覺眼科研究學(xué)會對動物實(shí)驗(yàn)的要求和上海交通大學(xué)及安徽醫(yī)科大學(xué)對動物實(shí)驗(yàn)的規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 視網(wǎng)膜脫離動物模型的建立 實(shí)驗(yàn)大鼠由腹腔內(nèi)注射 100 g·L－1水合氯醛麻醉，5 g·L－1托吡卡胺和5 g·L－1腎上腺素眼液散瞳;術(shù)前可樂必妥眼液沖洗結(jié)膜囊(中國蘇州參天制藥有限公司)，置角膜接觸鏡，30-G針穿刺視網(wǎng)膜下，沿視網(wǎng)膜下注入10 g·L－1透明質(zhì)酸鈉50 μL(中國山東博士倫公司)，可見局部RD約占1/2范圍，脫離范圍于結(jié)膜面用10-0縫線做標(biāo)記，以備取材時(shí)定位用［4-6］。每只實(shí)驗(yàn)大鼠右眼建立 RD模型，左眼作為對照組。

1.2.2 電鏡檢測 按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行電鏡檢測［4，7］。(1)取材:腹腔內(nèi)注射 100 g·L－1水合氯醛麻醉，摘除眼球，沿縫線標(biāo)記范圍取出視網(wǎng)膜組織。(2)固定:體積分?jǐn)?shù)25%戊二醛固定12 h，制成1 mm×3 mm條塊，重新固定液固定。(3)包埋:無水酒精和環(huán)氧樹脂浸透、包埋，37℃過夜，45℃12 h、60℃24 h。(4)切片:切片，銅網(wǎng)撈片、枸櫞酸鉛和醋酸鈾進(jìn)行雙重染色，JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本電子公司，日本東京)觀察并拍照。

每張電鏡切片隨機(jī)選擇200個(gè)光感受器細(xì)胞，通過形態(tài)學(xué)的改變觀察RD后第1天、第3天、第5天、第7天光感受器細(xì)胞的死亡方式。形態(tài)學(xué)上，光感受器細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)邊聚為凋亡細(xì)胞;細(xì)胞腫脹，質(zhì)膜不完整、破裂，為壞死細(xì)胞［8-9］。進(jìn)一步計(jì)算出各組間死亡細(xì)胞(凋亡和壞死細(xì)胞)的百分比。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜脫離模型的建立 通過視網(wǎng)膜下注射10 g·L－1透明質(zhì)酸鈉，我們成功建立了 RD的模型(圖1)，視網(wǎng)膜下注射約50 μL透明質(zhì)酸鈉可以形成穩(wěn)定的約1/2范圍的RD，持續(xù)時(shí)間約28 d。對照眼無視網(wǎng)膜脫離。

Figure 1 Ocular fundus and outer images.A:Ocular fundus image before retinal detachment，the black arrowhead indicated the optic nerve;B:Ocular fundus image after retinal detachment，the white arrowhead indicated attached and detached retina，the detachment extended approximately half of the retina;C:Outer ocular image，the scope and location of retinal detachment was marked by 10-0 sutures(black arrowhead)in order to facilitate the positioning of the follow-up test 造模前后眼底圖與造模后外眼圖。A:造模前的眼底圖片，黑箭頭為視神經(jīng);B:造模后眼底圖，可見視網(wǎng)膜脫離區(qū)域和非脫離區(qū)域(白箭頭)，RD范圍約1/2范圍的視網(wǎng)膜;C:造模后外眼圖，RD范圍用10-0絲線標(biāo)記(黑箭頭)，方便以后取材定位

2.2 RD后光感受器細(xì)胞的凋亡和壞死的分布規(guī)律電鏡結(jié)果顯示，在RD后的第3天，光感受器細(xì)胞的凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)達(dá)到最高峰。造模后第1天凋亡率為 8.05%±0.98%，壞死率為 5.22%±1.58%;第3天凋亡率為20.98%±1.33%，壞死率為17.04%±0.81%;第 5天凋亡率為 7.82%±1.08%，壞死率為7.14%±0.89%;第7天凋亡率為5.40%±1.00%，壞死率為 4.07%±0.26%(P ＜0.01);同時(shí)，光感受器細(xì)胞的死亡數(shù)(凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)總和)也于第 3天達(dá)到最高峰(37.99%±1.50%)(P ＜0.01)。

3 討論

光感受器細(xì)胞的不可逆損傷是導(dǎo)致視功能損失的主要原因［1］。RD后光感受器細(xì)胞的死亡方式中，不僅有凋亡，同時(shí)可能存在有程序性壞死，如壞死性凋亡［3］。本研究通過視網(wǎng)膜下注入透明質(zhì)酸鈉成功建立RD模型，闡明了在RD中，光感受器細(xì)胞的存在有凋亡和壞死的死亡方式，在RD后第3天，凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)達(dá)到最高峰，為進(jìn)一步研究程序性壞死提供了干預(yù)和檢測的時(shí)間靶點(diǎn)。

細(xì)胞的死亡有許多種，根據(jù)細(xì)胞核的改變主要分為凋亡及凋亡樣程序性細(xì)胞死亡，壞死及壞死樣程序性細(xì)胞死亡［10］。目前國內(nèi)外的研究多集中在凋亡的調(diào)控方面，隨著壞死性凋亡的出現(xiàn)，越來越多的證據(jù)表明，部分細(xì)胞壞死也是可以調(diào)控的。壞死性凋亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種新的可調(diào)控的程序性細(xì)胞壞死，也受死亡受體通路的激活比如TNFα、FasL和TRAIL［11-12］;壞死性凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與細(xì)胞壞死相類似，也表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹，質(zhì)膜不完整、破裂［13-14］。但是，目前尚不清楚RD后，光感受器細(xì)胞的壞死隨時(shí)間變化的規(guī)律。

在以前的研究結(jié)果中，有學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)性RD后的第3天，TUNEL陽性光感受器細(xì)胞數(shù)達(dá)到最高峰［4，15］。但是，TUNEL 檢測有其局限性，部分壞死細(xì)胞也可以表現(xiàn)為TUNEL陽性，所以目前多傾向于電鏡檢測作為凋亡和壞死的鑒別方法［8］。本研究中，電鏡檢測結(jié)果顯示:RD造模后的第3天，光感受器細(xì)胞的凋亡數(shù)達(dá)到最高峰，這與以前的研究結(jié)果是一致的。另一方面，同時(shí)也觀察了光感受器細(xì)胞壞死的時(shí)間分布規(guī)律，結(jié)果顯示，光感受器細(xì)胞的壞死和凋亡一致，都是在RD后的第3天達(dá)到最高峰。這些結(jié)果提示，在RD的模型中，光感受器細(xì)胞的總死亡數(shù)將在RD后第3天達(dá)到最高峰。

綜上所述，在RD中，光感受器細(xì)胞的死亡是導(dǎo)致視功能不可逆損傷的重要原因。除凋亡外，光感受器細(xì)胞中可能存在有程序性壞死，如壞死性凋亡，所以對這部分壞死樣細(xì)胞死亡進(jìn)行干預(yù)和調(diào)控能為恢復(fù)視功能提供新的診療思路。本研究證明了RD后的第3天為光感受器細(xì)胞凋亡和壞死的最高峰，所以在今后的研究中可以將此時(shí)間節(jié)點(diǎn)作為干預(yù)或檢測結(jié)果的時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

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