HPLC法同時(shí)測(cè)定灌胃補(bǔ)腎通絡(luò)方大鼠血漿中馬錢(qián)苷、阿魏酸和二苯乙烯苷含量

黃攀　劉湘丹　馬銘　盧岳華

摘 要 目的：建立灌胃補(bǔ)腎通絡(luò)方大鼠血漿中馬錢(qián)苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的含量測(cè)定方法. 方法：以甲醇-乙酸乙酯（V甲醇∶V乙酸乙酯=3∶1）提取處理血漿，氮?dú)獯蹈珊罅鲃?dòng)相復(fù)溶進(jìn)樣.色譜條件： Johnson spherigel C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相： 甲醇-0.01%乙酸水溶液，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)： 馬錢(qián)苷為235 nm，阿魏酸和二苯乙烯苷為320 nm；流速： 1 mL/min；柱溫： 30 ℃；進(jìn)樣量： 10 μL. 結(jié)果：空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品的測(cè)定.馬錢(qián)苷、阿魏酸和二苯乙烯苷分別在0.03～3.00，0.03～3.00和0.02～2.00 mg/L范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系（r≥0.999） ，檢測(cè)限依次為0.020，0.015和0.010 mg/L；提取回收率分別大于79%、74%和58%，日間、日內(nèi)精密度（RSD）均分別小于10%，7.3%和9.7%.結(jié)論：所建立的含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，靈敏，準(zhǔn)確，適用于大鼠灌胃補(bǔ)腎通絡(luò)方后血漿中馬錢(qián)苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的同時(shí)測(cè)定，為補(bǔ)腎通絡(luò)方中有效成分藥動(dòng)學(xué)研究提供參考.

關(guān)鍵詞 補(bǔ)腎通絡(luò)方；馬錢(qián)苷；阿魏酸；二苯乙烯苷；血藥濃度；高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2537（2015）03-0053-05

補(bǔ)腎通絡(luò)方是臨床常用有效治療腎病綜合征（Nephrotic syndrome， NS）的經(jīng)驗(yàn)方，由制首烏、白術(shù)、當(dāng)歸、丹參、淮山、山茱萸、川芎、爵床、車(chē)前子、澤蘭等藥物組成，臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明其對(duì)NS腎虛夾瘀癥有較好的治療作用[1-3].為進(jìn)一步闡明該方的作用機(jī)制，建立其主要活性成分的體內(nèi)分析方法尤為重要.馬錢(qián)苷是山茱萸的有效成分之一，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等生理活性[4-5].阿魏酸是當(dāng)歸和川芎的有效成分之一，具有抗氧化、抗血栓、降血脂、抗菌消炎、解毒保肝等作用[6-8].二苯乙烯苷是首烏的有效成分之一，具有抗氧化、調(diào)血脂的作用，可延緩或減輕動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[9-10].本實(shí)驗(yàn)建立了灌胃補(bǔ)腎通絡(luò)方大鼠體內(nèi)血漿中馬錢(qián)苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的含量測(cè)定方法，為補(bǔ)腎通絡(luò)方作用機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定分析基礎(chǔ).

1 儀器、試劑與材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；MX-S型渦旋儀（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；TG-16G高速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；MTN-2800D氮吹濃縮裝置（天津恬靜奧特賽恩斯儀器有限公司）；AUW220D分析天平（日本Shimadzu公司）；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司）.

馬錢(qián)苷對(duì)照品（批號(hào)11640-201005，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)110773-201012，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）、二苯乙烯苷（2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄苷）對(duì)照品（批號(hào)110844-201310，質(zhì)量分?jǐn)?shù)91%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，甲醇、乙酸乙酯為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純.補(bǔ)腎通絡(luò)方稠浸膏由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科制備（批號(hào)20130406），含生藥10 g/mL.項(xiàng)目組前期研究測(cè)定補(bǔ)腎通絡(luò)方稠浸膏中馬錢(qián)苷、阿魏酸和二苯乙烯苷質(zhì)量濃度分別為2.5147，0.2925，3.1190 g/L[11].

清潔級(jí)近交系雄性Sprague-Dawlay（SD）大鼠，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重250±20 g，SPF級(jí)動(dòng)物房標(biāo)準(zhǔn)飼料常規(guī)飼養(yǎng)，合格證號(hào)為SCXK（湘）2011-0003.

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取馬錢(qián)苷、阿魏酸和二苯乙烯苷各10 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，搖勻，制成1.0 g/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取適量，用甲醇稀釋成系列混合對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為0.05，0.75，1.00，1.50，2.50，5.00，25，50，100和150 mg/L，置于4 ℃冰箱內(nèi)備用.

2.2 血漿樣品的制備及預(yù)處理

取雄性SD大鼠6只（250～280 g），隔夜禁食24 h，自由飲水.將補(bǔ)腎通絡(luò)方稠浸膏按15 μL/g大鼠灌胃給藥，分別于給藥前及給藥后30 min采血，置涂肝素鈉的PCR管中，8 000 r/min，4 ℃下離心10 min，取上清血漿，分裝標(biāo)號(hào)，于-20 ℃保存?zhèn)溆?

用微量加樣器取150 μL血漿，置于0.5 mL棕色高速離心管中，加入450 μL甲醇-乙酸乙酯（V甲醇∶V乙酸乙酯=3∶1）混合溶液，渦旋1 min，10 000 r/min高速離心10 min，提取兩次合并上層有機(jī)相，然后加入1.0 mol/L的鹽酸25 μL，常溫下氮?dú)鈸]干，殘?jiān)鼫?zhǔn)確加入25 μL流動(dòng)相（V甲醇∶V0.01%乙酸水溶液=30∶70）復(fù)溶，渦旋1 min，10 000 r/min 離心5 min，取上清液10 μL進(jìn)樣.

2.3 色譜條件及方法專(zhuān)屬性考察

色譜條件：色譜柱：Johnson spherigel（大連江申）C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動(dòng)相：甲醇-0.01%乙酸水溶液梯度洗脫（0～18 min，30%甲醇；18～25 min，30%～45%甲醇；25～30 min，45%～50%甲醇；30～35 min，50%～30%甲醇）； 流速：1.0 mL/min； 檢測(cè)波長(zhǎng)： 235 nm（0～18 min），320 nm（18～32 min），235 nm（32～35 min）；柱溫：30 ℃； 進(jìn)樣量：10 μL.

專(zhuān)屬性考察：精密取大鼠空白血漿、大鼠空白加標(biāo)血漿（相當(dāng)于馬錢(qián)苷、阿魏酸及二苯乙烯苷質(zhì)量濃度2.0 mg/L）和含藥血漿各150 μL，按2.2項(xiàng)下血漿樣品預(yù)處理操作，按2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定.