四川小麥品種抗條銹基因的SSR分析

康曉慧+彭玉姣+付菊梅+白雪+張春容+蔚慧欣

摘 要 從46對小麥基因組SSR引物中，篩選出帶型清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的引物11對.利用該11對引物對52份抗病材料進(jìn)行了遺傳多樣分析.結(jié)果表明，11對SSR引物共擴(kuò)增出66個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中，每對SSR有1～10個(gè)，平均為6個(gè).位點(diǎn)多態(tài)性指數(shù)（PIC）為0.75～0.90，平均為0.84.UPGMA聚類分析表明，SSR標(biāo)記可將52份抗病品種分為3大類7個(gè)亞類.本研究對抗條銹基因功能分析及小麥抗條銹病分子輔助育種有參考價(jià)值.

關(guān)鍵詞 小麥；抗病基因；條銹菌；SSR

中圖分類號(hào) S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2537（2015）03-0011-05

小麥條銹病是由條形柄銹菌（Puccinia striiformis West.f.sp.tritici）引起的一種真菌性病害，給我國小麥生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失.近年來，四川麥區(qū)小麥條銹病每年都處于高發(fā)狀態(tài)，造成每年3 Mt以上的糧食損失[1].國內(nèi)外的研究表明，選育抗病品種是控制小麥條銹病最經(jīng)濟(jì)、有效和安全的途徑.傳統(tǒng)的育種方法周期長、工作量大、人為選擇誤差大，而分子標(biāo)記是從DNA水平進(jìn)行鑒定，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)育種方法的不足，大大加快了育種進(jìn)程[2].其中SSR標(biāo)記是目前小麥研究中應(yīng)用最為廣泛的一種DNA標(biāo)記技術(shù).本研究以52份四川小麥成株期抗銹品種為研究對象，利用小麥基因組中SSR標(biāo)記對其從分子水平上進(jìn)行遺傳多樣性分析，了解不同抗銹種質(zhì)資源所攜帶抗銹基因的差異和抗銹種質(zhì)資源之間的遺傳關(guān)系，為利用有效的抗銹種質(zhì)資源培育優(yōu)質(zhì)新品種提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將52份抗性材料（見表1）用于SSR遺傳多樣性分析.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃化苗的培養(yǎng) 將成株期鑒定的52份抗病品種分別置于鋪有濕紗布的培養(yǎng)皿中，上面蓋紗布，于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，每天早晚補(bǔ)足水分，待黃化苗長到兩片葉即可用于DNA的提取.

1.2.2 小麥DNA的提取 參照Rogers和Bendich（1985）[3]，Micheli等（1994）[4]的方法略改進(jìn).取100 mg新鮮小麥葉片，至液氮中研磨成粉末，加入預(yù)熱的CTAB裂解緩沖液，加入等體積的氯仿與異戊醇（V氯仿∶V異戊醇=24∶1）反復(fù)抽提.取上清液加入10 μL RNAase，37 ℃水浴30 min，氯仿與異戊醇（V氯仿∶V異戊醇=24∶1）抽提一次，取上清液加入0.1倍體積的3 mol/L NaAc和2倍體積的冰凍無水乙醇沉淀DNA，可見團(tuán)狀DNA出現(xiàn).將醋酸鈉倒出，室溫風(fēng)干，然后加入100 μL 1XTE溶解，4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 模板DNA的檢測 采用超微量分光光度計(jì)測定DNA純度與濃度，讀取OD值.OD260/OD280值范圍在1.8～2.0最合適.再通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測DNA純度，若電泳后出現(xiàn)弱帶或雜帶，則說明DNA可能降解，即提取的DNA質(zhì)量不高；若電泳后只有一條帶明顯，拖尾現(xiàn)象不嚴(yán)重，則說明DNA質(zhì)量較高.

1.2.4 PCR擴(kuò)增體系 PCR具體反應(yīng)體系：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 6.5 μL，10 μmoL/L F.P 2 μL， 10 μmoL/L R.P 2 μL，20 mg/L DNA 2 μL.

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，50～61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色顯影后統(tǒng)計(jì)譜帶.

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 品種間遺傳相似系數(shù)的計(jì)算參照Nei和Li[5]的方法；SSR擴(kuò)增帶型采用“0”，“1”和“9”來統(tǒng)計(jì)，分別表示在相同遷移水平上“有帶”、“無帶”和“缺帶”；SSR引物的多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）利用Senior等[6]提供的公式計(jì)算；利用NTSYS-PC 2.11[7]遺傳分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 抗銹品種DNA提取結(jié)果

將52份抗銹品種分別提取DNA，于紫外分光光度計(jì)上檢測其純度，同時(shí)結(jié)合2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），結(jié)果表明DNA的OD260/280在1.8～2.0之間，大部分結(jié)果顯示拖帶不太嚴(yán)重，適合下一步操作.

2.2 引物篩選

將52份抗銹品種對46對SSR引物進(jìn)行篩選，從中選擇多態(tài)性較好和條帶清晰的11對引物（表2）.

2.3 SSR標(biāo)記的多態(tài)性

利用表2中的11對引物對52份抗病品種進(jìn)行分析，擴(kuò)增結(jié)果條帶清晰、多態(tài)性豐富，共檢測到66個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，每對引物能檢測到1～10個(gè)，平均為6個(gè)，見表3.其中Xwmc656和Xbarc187有10個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)最小的引物是Xwmc626，其有2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn).位點(diǎn)多態(tài)性指數(shù)（PIC）為0.75～0.90，平均為0.84，多態(tài)性指數(shù)最大的引物是Xwmc656，最小的是Xwmc626.

2.4 SSR標(biāo)記揭示品種間的遺傳距離

根據(jù)SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)計(jì)算品種間的SSR遺傳相似系數(shù)（表4），其變異范圍為0.524～0.976，平均為0.75.在這些品種中川07005與西科麥2號(hào)，渝03062與sw18155和內(nèi)麥10號(hào)，內(nèi)麥8號(hào)與川麥55遺傳相似性最高，相似系數(shù)為0.976；綿麥48和綿麥30，渝03062與綿麥48和綿麥30，綿麥41與綿麥48和綿麥30，西科1與綿麥367，綿麥31與331-60，綿麥41與綿麥46，內(nèi)麥836與綿麥48和綿麥30的遺傳相似系數(shù)為0.952；川07005與川麥55， 渝03062與內(nèi)麥12和內(nèi)麥8號(hào)，綿麥41與川麥51，蜀麥375和川麥42與川麥47的遺傳相似系數(shù)為0.929；川06品09與渝03062，川06品09與西科麥5號(hào)，川06品09與川麥57，川麥54與內(nèi)麥11，西科麥3號(hào)與川育23，內(nèi)麥10號(hào)和內(nèi)麥11與川麥53，內(nèi)麥8號(hào)與川麥58，杏麥2號(hào)與渝03062，它們的遺傳相似系數(shù)為0.905；其他品種間的遺傳相似系數(shù)均小于0.9.

2.5 SSR遺傳揭示供試品種（系）間的遺傳關(guān)系

計(jì)算52份供試材料間的遺傳距離，并以離差平方和方法進(jìn)行聚類分析，建立樹狀聚類圖（圖2），52份材料在0.524水平上可分為三大類（表5）.

3 討論

目前生產(chǎn)上推廣的小麥品種絕大部分是繁6及其衍生系，致使四川小麥品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，難以抵御條銹菌新小種的入侵，從而導(dǎo)致小麥條銹病的多次流行，嚴(yán)重降低了小麥產(chǎn)量和品質(zhì).利用物種內(nèi)的遺傳多樣性，選用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的抗性品種作雜交親本，以此來培育高抗品種，是控制作物病害的一種有效的生態(tài)方法[8].前人已利用同工酶、種子貯藏蛋白、醇溶蛋白等不同手段對四川地方小麥品種進(jìn)行了遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)四川地方品種變異較小、遺傳多樣性較低[9-12].陳玉清[13]、鄭有良[14]采用RAPD標(biāo)記對四川近50年來的小麥品種間遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示各年代間變化不一致，20世紀(jì)90年代后遺傳多樣性呈下降趨勢.

本研究利用SSR標(biāo)記技術(shù)對52份四川抗病材料進(jìn)行遺傳多樣分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，川07005與西科麥2號(hào)、渝03062與sw18155和內(nèi)麥10號(hào)、內(nèi)麥8號(hào)與川麥55遺傳相似性最高，相似系數(shù)為0.976；川麥55與樂麥、331-60，sw2962與川育24、杏麥2號(hào)等相似系數(shù)最低，為0.524.聚類分析顯示，52份抗病品種在0.524水平上可分為三大類，渝03062與其余品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，川07005與內(nèi)麥9號(hào)和綿麥40的親緣關(guān)系較近，川05觀08與川07005的親緣關(guān)系較近.從整體來看，各科研單位的小麥品種遺傳多樣性差異不大，與前人的研究結(jié)果一致.這可能與各科研單位選用有限的骨干親本抗源材料有關(guān)，也可能與長期演化過程中的天然雜交等因素有關(guān).

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（編輯 王 ?。?