桔梗石油醚提取物對酒石酸泰樂菌素在小鼠體內(nèi)的 藥代動力學(xué)及組織分布的影響

陳雯，李英倫，葉剛，施飛

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014)

酒石酸泰樂菌素即泰樂菌素酒石酸鹽，其在腸道吸收好，體內(nèi)分布快，血藥濃度高，對G+和一些G–有效，其中對支原體作用最強(qiáng)，臨床上常用于防治雞慢性呼吸道疾病、豬支原體肺炎[1]。酒石酸泰樂菌素為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的混合物。泰樂菌素A(TA)是其主要的物質(zhì)，在發(fā)酵的過程中會形成相關(guān)的組分，即泰樂菌素B(TB)、泰樂菌素C(TC)、泰樂菌素D(TD)[2]。桔梗(Platycodongrandiflorum)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、辛，性平，歸肺經(jīng)?！端庤b》稱其“誠諸藥之舟楫，肺經(jīng)之引藥也”；《景岳全書》曰“用此者，用其載藥上升，故有舟楫之號”。在現(xiàn)今運(yùn)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的方法研究傳統(tǒng)中醫(yī)藥已成為趨勢，學(xué)者對桔?！拜d藥上行”的現(xiàn)代化研究已有了一定成果。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理學(xué)實驗室在前期的研究中，利用化學(xué)藥物結(jié)構(gòu)明晰，便于檢測的特點(diǎn)，將桔梗(肺經(jīng)藥物)與化學(xué)藥物混合使用，發(fā)現(xiàn)桔梗能改變羅紅霉素在兔體內(nèi)的組織分布狀況，其在肺中的分布時間提前，并提高了藥物在肺中的濃度[3]。同時，通過研究桔梗水煎液對雞藥代動力學(xué)特征的影響等，發(fā)現(xiàn)桔梗有明顯的“引經(jīng)”作用，能使左氧氟沙星在體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征更加明顯[4]。本試驗中利用酒石酸泰樂菌素結(jié)構(gòu)清晰、便于定量檢測的特點(diǎn)，將石油醚萃取的桔梗醇提取物與酒石酸泰樂菌素混合使用，探討桔梗提取物對酒石酸泰樂菌素在小鼠體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄的影響，旨在為進(jìn)一步探索桔梗發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試動物

SPF 級昆明小鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量為18 ～22g，由簡陽達(dá)碩動物科技有限公司提供，編號為SCXK(川)2013–24。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

Agilent 高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；HC–3017 高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳公司)；渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；GZX–9076MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；SY–5000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；雷磁PHS–3C pH 計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；HANGPING YP502N 電子天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司)。

1.1.3 主要藥品與試劑

川桔梗(Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC)的干燥根部，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院范巧佳先生鑒定為正品，購自雅安康盛中藥材有限公司；酒石酸泰樂菌素購自浙江普洛康裕制藥有限公司，批號為1208013；酒石酸泰樂菌素對照品由四川省獸藥監(jiān)察所提供；高氯酸鈉、乙腈、甲醇為色譜級，石油醚為AR 級。

1.2 方法

1.2.1 桔梗石油醚醇提取物的制備

稱取川桔梗粉末100g 于3 000mL 圓底燒杯中，按1∶8(m∶V)加入95%乙醇，回流提取2次，每次2 h。合并2次提取液，濃縮揮干乙醇，用水定容至100mL，得到1g/mL 的桔梗醇提取物。取10mL 醇提取液，用石油醚按1∶1 萃取，重復(fù)萃取3次，合并石油醚萃取液并濃縮揮干石油醚，備用。

1.2.2 供試液的配制

精密稱取酒石酸泰樂菌素藥品3g，置于100mL 容量瓶中，加入桔梗石油醚醇提取物(約0.15g)，加入0.5%吐溫–80，用水溶解并定容至100mL，得到桔梗試驗組供試液，備用。精密稱取酒石酸泰樂菌素藥品3g，置于100mL 容量瓶中，加入0.5%吐溫–80，用水定容至100mL，得到空白組供試液，備用。

1.2.3 給藥及采樣方法

小鼠禁食過夜，隨機(jī)分組，使每個時間點(diǎn)有4只小鼠，按0.2mL/10g 體質(zhì)量灌服供試液，分別于服藥后10、20、30、40、50、60、80、100、120、180、240、360min 采血，置于抗凝管中，離心(3 000 r/min)10min，取血漿，置于–20℃冰箱凍存，待測；采血后剖解小鼠，分離各組織(心、肝、肺、腎)，并用生理鹽水清洗干凈，置于–20℃冰箱凍存，待測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血漿及組織中的藥物濃度。

1.2.4 酒石酸泰樂菌素含量的測定

1) 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液的配制。精密稱取酒石酸泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品32.0mg，置于100mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至100mL，得質(zhì)量濃度為320μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，備用。

2) 色譜條件的選定。色譜柱為ODS C18色譜柱(150 nm ×4.6 nm，5 μm)；流動相為乙腈–高氯酸鈉(2 mol/L，pH 值為2.5±0.1)，體積比為40 60∶ ；流速為1.0mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為290 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

3) 血漿及組織樣品的制備。血漿樣品制備：取小鼠血漿0.5mL，加入乙腈1.5mL，漩渦混合2min，超聲波振蕩10min，12 000 r/min 離心10min，上清液用0.45 μm 濾膜過濾，取20 μL 過濾液直接進(jìn)樣。組織樣品制備：按1g組織加入1mL 蒸餾水的比例進(jìn)行勻漿，充分勻漿后，取0.25mL 于PE 管中，加入乙腈0.75mL，漩渦混合2min，超聲波振蕩10min，離心15min，上清液用0.45 μm 濾膜過濾，取20 μL 過濾液直接進(jìn)樣。

4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別取空白血漿0.5mL，依次加入酒石酸泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)貯備液，使質(zhì)量濃度依次為32、16、8、4、2μg/mL。按上述血漿樣品制備方法處理空白血漿并進(jìn)行HPLC 分析，記錄色譜圖及峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，藥物濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。運(yùn)用最小二乘法將峰面積對藥物濃度進(jìn)行回歸分析，得到酒石酸泰樂菌素血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取出組織勻漿0.25mL，依次加入酒石酸泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配制成含酒石酸泰樂菌素的系列濃度(64、32、16、8、4、2μg/mL)，按組織樣品制備方法處理組織勻漿并進(jìn)行HPLC 分析，以峰面積Y 對泰樂菌素濃度C 進(jìn)行線性回歸，得到各組織標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

5) 血漿回收率和精密度試驗。按上述方法配制低、中、高3 種濃度(分別為2、8、32μg/mL)的酒石酸泰樂菌素血漿樣品3 份，24 h 內(nèi)按血漿處理方法及色譜分析方法平行測定5次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，每天1次，計算日間精密度。配制32、8、2μg/mL 3個濃度的酒石酸泰樂菌素血漿樣品，按血漿樣品處理方法操作，以與3個劑量對應(yīng)的相同進(jìn)樣量的對照品進(jìn)行分析，計算絕對回收率和相對回收率。

絕對回收率=血漿樣品處理后所得的峰面積/對應(yīng)濃度的對照品的峰面積×100%；相對回收率=實際測得峰面積計算出的濃度/血漿樣品實際加入標(biāo)準(zhǔn)品的濃度×100%。

6)組織樣品的回收率及精密度試驗。取小鼠空白組織勻漿0.25mL，加入酒石酸泰樂菌素對照品，配制低、中、高3 種濃度(2、8、64μg/mL)，24 h 內(nèi)平行測定5次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)3 d，計算日間精密度。另配制低、中、高3 種濃度(2、8、64μg/mL)組織樣品，按組織樣品制備方法處理樣品，計算組織樣品的相對回收率、絕對回收率。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用PKsolver 軟件進(jìn)行藥代動力學(xué)分析；血液及組織的藥物濃度采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以酒石酸泰樂菌素峰面積(Y)對血漿藥物濃度(C) 進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=15.495C－0.229 2，r=0.999 7。

2.2 組織樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以酒石酸泰樂菌素峰面積(Y)對各組織中的藥物濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得到各組織的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程等見表1。各組織酒石酸泰樂菌素色譜圖見圖1。

表1 酒石酸泰樂菌素在各組織中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 Table 1 Standard curve of tylosin tartrate in several tissues

圖1 各組織空白組與桔梗試驗組的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖 Fig.1 Standard chromatograms of tylosin tartrate in controlgroups and treatmentgroups

2.3 血漿的回收率和試驗的精密度

從表2 可以看出，血漿中3 種質(zhì)量濃度酒石酸泰樂菌素的絕對回收率均大于75%，藥物提取率均較高，說明血漿樣品處理方法能使酒石酸泰樂菌素較好的從血漿中分離；血漿樣品精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值均小于5%，符合生物供試品分析的要求，證明本試驗所采用的測定方法和血漿樣品 處理方法可靠。

表2 酒石酸泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品在血漿中的回收率、日內(nèi)及日間精密度 Table 2 Standard substance recoveries and precisions of tylosin tartrate in plasma

2.4 組織樣品的精密度與試驗的回收率

將與3個酒石酸泰樂菌素質(zhì)量濃度對應(yīng)的相同進(jìn)樣量的對照品進(jìn)行分析，計算組織樣品的相對、絕對回收率，結(jié)果見表3。各組織中的絕對回收率均大于75%，說明組織樣品處理方法能使藥物從各組織中很好的分離；組織樣品的精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10%，證明采用的測定方法及組織處理方法可靠。

表3 組織勻漿中酒石酸泰樂菌素的精密度與回收率 Table 3 Recoveries and precisions of tylosin tartrate at different tissues

2.5 血藥的質(zhì)量濃度

對照組與桔梗試驗組的血藥質(zhì)量濃度見表4。從表4 中可看出，與對照組相比，桔梗試驗組藥物吸收入血程度減輕，血藥濃度達(dá)峰時間提前，且從血漿消除代謝的時間縮短，在4 h 后便檢測不到藥物。

表4 對照組與桔梗試驗組的血藥質(zhì)量濃度(n =3) Table 4 Comparison the tylosin tartrate concentration in mice plasma at differentgroups(n =3)

2.6 小鼠的藥代動力學(xué)特征

小鼠灌胃酒石酸泰樂菌素后，不同時間血藥濃度的藥時曲線見圖2。從圖2 可知，與對照組相比，桔梗試驗組的達(dá)峰時間提前，證明桔梗石油醚提取物可使酒石酸泰樂菌素的吸收加快，能夠更快的發(fā)揮藥效。

圖 2 藥時曲線 Fig. 2 Curves of tylosin tartrate concentration versus time in mice plasma at different treatments

將給藥后不同時間收集的血液的血藥濃度經(jīng)PKsolver 藥代動力學(xué)軟件處理，用非房室模型估算藥代動力學(xué)參數(shù)，得到的藥代動力學(xué)參數(shù)見表5。這與對照組相比，桔梗石油醚提取物能明顯縮短酒石酸泰樂菌素的達(dá)峰時間，且加速了血中泰樂菌素向組織的分布。

表5 藥代動力學(xué)參數(shù)(n=3) Table 5 Comparison pharmacokinetic variance of tylosin tartrate at different treaments in plasma of mice(n=3)

2.7 藥物在組織中的分布

小鼠灌胃給藥后，不同組織的藥物濃度－時間變化趨勢見圖3。從圖3 中可看出，與對照組相比，桔梗組小鼠心臟中藥物濃度明顯增大，肺、肝、腎組織中的藥物濃度卻未見增加，且分布時間及峰值有明顯改變。說明桔梗石油醚提取物改變了泰樂菌素在小鼠體內(nèi)的組織分布，顯著提高了藥物在小鼠心臟中的濃度。

圖3 不同給藥時間的各組織的藥物濃度 Fig.3 Trends of tylosin tartrate concentration with time at different tissues

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，酒石酸泰樂菌素的血–藥時曲線呈現(xiàn)多峰。對于多峰現(xiàn)象，最常見的解釋便是腸–肝循環(huán)(EHC)和胃腸道吸收的非齊性所導(dǎo)致。另外，藥物在體內(nèi)的代謝過程和吸收部位的多少，藥物對胃腸的刺激，細(xì)胞對藥物的儲存與釋放等因素也與多峰現(xiàn)象有關(guān)[5]。早在20 世紀(jì)90年代，便有文獻(xiàn)[6–7]報道，藥時曲線出現(xiàn)多峰現(xiàn)象的藥物已有幾十種，包括安定、速尿、阿司匹林、青霉胺、卡馬西平、苯妥英等等。有文獻(xiàn)[8–9]報道，雞口服泰樂菌素，豬口服酒石酸泰樂菌素均會出現(xiàn)血–藥曲線多峰的現(xiàn)象。由于泰樂菌素在體內(nèi)經(jīng)肝腸循環(huán)再吸收，故會出現(xiàn)內(nèi)服后血藥濃度再次升高的可能[10]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素與胃動素受體結(jié)合后依賴鈣離子系統(tǒng)起作用，增強(qiáng)胃腸動力[11]，據(jù)此推測引起泰樂菌素內(nèi)服吸收后出現(xiàn)多峰現(xiàn)象的原因不僅僅是肝腸循環(huán)，極有可能也與其對腸道動力的影響有關(guān)。

房室模型采用結(jié)構(gòu)和動力學(xué)假設(shè)，實際上常有一個以上模型和數(shù)據(jù)吻合，在確定哪一個模型正確方面不可避免帶有隨意性，且模型的選定對藥代動力學(xué)結(jié)果有很大的影響。在針對EHC 引起的多峰動力學(xué)參數(shù)計算方面，有學(xué)者采用非房室模型的方法[12]。該方法不受經(jīng)典房室模型的限制，僅假設(shè)藥物末端以單指數(shù)消除，適用于任何房室。綜合考慮，本試驗選擇非房室模型分析藥代動力學(xué)參數(shù)。

從藥代動力學(xué)結(jié)果可知，與對照組相比，桔梗石油醚提取物與酒石酸泰樂菌素混合灌服后，藥物達(dá)峰時間變短，說明桔梗石油醚提取物加快了酒石酸泰樂菌素的吸收，但吸收程度并未增大，分析原因可能是桔梗石油醚提取物加速了血中泰樂菌素向組織中的分布速度。表觀分布容積大于對照組，也證實了這一結(jié)論。藥物半衰期比對照組變短，說明桔梗石油醚提取物的成分使泰樂菌素迅速向組織中進(jìn)行分布，血的藥物濃度下降，而組織的藥物濃度升高，實測的組織藥物濃度也證實了這一結(jié)果。由此推測桔梗的“引經(jīng)”作用實際上是桔梗促進(jìn)其他藥物加快向組織中分布，使組織中藥物的濃度增高，從而增強(qiáng)其他藥物的藥理作用。但是，本次測定的心臟藥物濃度明顯比肺、肝、腎中藥物濃度高，而大量文獻(xiàn)[13–17]表明，桔梗具有載藥上行的功效，其中多數(shù)是對肺臟的引經(jīng)效果的報道，那么，桔梗的“載藥上行”這個“上”是否還應(yīng)該包括引藥入心的內(nèi)涵在其中？當(dāng)然中醫(yī)的“心”包含了現(xiàn)代解剖學(xué)里面的心和腦，下一步將探究桔梗石油醚提取物對靶標(biāo)物質(zhì)在小鼠腦組織中濃度的影響，以充分驗證這一結(jié)論。

[1] 袁秀榮．引經(jīng)芻議[J]．國醫(yī)論壇，2001，16(5)：51．

[2] Roet E，Beirinckx P，Quintens I，et al. Quantitative analysis of tylosin by column liquid chromatography[J]. J Chromatogr，1993，630(1/2)：159–166．

[3] 李英倫，盧勝明，簡沫．桔?！耙?jīng)”對羅紅霉素肺藥濃度的影響[J]．中獸醫(yī)醫(yī)學(xué)雜志，2005，24(3)：3–6.

[4] 李英倫，蔣智綱，何曉俐．桔梗的“引經(jīng)”作用對左氧氟沙星在雞體內(nèi)藥物分布的影響[J]．中國獸醫(yī)學(xué)報，2006，26(5)：541–543．

[5] 盧海儒．藥–時曲線上的多峰現(xiàn)象[J]．臨床藥學(xué)，1995，25(8)：31–32．

[6] 周懷梧．藥物吸收多峰現(xiàn)象的動力學(xué)研究(綜述)[J]．現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1989，6(2)：37–40．

[7] 吳笑春，靳桂明，李罄．苯妥英吸收的多峰現(xiàn)象[J]．中國醫(yī)學(xué)院藥學(xué)雜志，1995，15(7)：299–300．

[8] 徐剛．泰樂菌素–阿莫西林聯(lián)合應(yīng)用在豬體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究[D]．哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007 ．

[9] Mathias Devereese，Ann Osselaere，Joline Goosens，et al．Interaction between tylosin and bentonite clay from a pharmacokinetic perspective[J]．The Veterinary Journal，2012，194：437–439．

[10] 佚名．泰樂菌素 酒石酸泰樂菌素 磷酸泰樂菌素[J]. 中國獸藥雜志，2003，37(5)：50–51．

[11] 陳千紅．大環(huán)內(nèi)酯類抗生素胃腸道反應(yīng)的預(yù)防[J]．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2010，26(19)：2952–2953．

[12] 尤海生，董亞琳，邢建峰，等．燈盞乙素在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)及組織分布的研究[J]．中國中藥雜志，2007，32(16)：1688–1691．

[13] 李英倫．桔?！耙?jīng)”的現(xiàn)代化實驗研究[D]．雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008．

[14] 黃穎．桔梗引經(jīng)治療慢性阻塞性肺疾病機(jī)理研究[D]．北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2008．

[15] 劉玲琳，劉勝．乳移平配伍肺經(jīng)引經(jīng)藥桔?？谷橄侔┓无D(zhuǎn)移作用及機(jī)制的實驗研究[J]．上海中醫(yī)藥雜志，2010，44(10)：61– 65．

[16] Zhang Feng，Zhan Qin，Gao Shouhong，et al. Chemical profile-and pharmacokinetics-based investigation of the synergistic property of platycodonis radix in traditional Chinese medicine formula Shengxian decoction[J]. Journal of Ethnopharmacology，2014，152(3)：497–507．

[17] 林彥君，章津銘．新議桔?！耙?jīng)報使” 理論研究思路與方法[J]．中藥與臨床，2011，2(2)：50–52．