雜色鮑原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的優(yōu)化及其在基因功能研究中的應(yīng)用

李敏　張麗莉　王國棟等

摘要 優(yōu)化了雜色鮑原代細(xì)胞的培養(yǎng)條件，并利用原代細(xì)胞進(jìn)行了RNAi和外源基因表達(dá)。結(jié)果表明，較高的滲透壓對血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)起重要作用，淋巴細(xì)胞分離液分離血淋巴細(xì)胞更利于其生長。原代細(xì)胞培養(yǎng)至第5天，在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加50 μg MyD88 dsRNA，能夠顯著降低MyD88 mRNA的表達(dá)。pEGFPN1轉(zhuǎn)染培養(yǎng)5 d的鰓細(xì)胞，5 d后可以檢測到綠色熒光。該研究表明可以成功培養(yǎng)雜色鮑血和鰓原代細(xì)胞，并且利用原代細(xì)胞可以進(jìn)行功能基因表達(dá)量調(diào)低或調(diào)研究，為功能基因注釋提供了便利條件。

關(guān)鍵詞 雜色鮑；原代細(xì)胞培養(yǎng)；RNAi；轉(zhuǎn)染

中圖分類號 S917 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）15-146-05

Optimizing Primary Cell Culture Method of Haliotis diversicolor and Its Effect for Gene Function Study

LI Min1，2， ZHANG Lili1，2， WANG Guodong1，2* et al

（1. Fisheries College， Jimei University， Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea， Ministry of Agriculture， Xiamen， Fujian 361021； 2. Institute of Aquaculture Biotechnology， Jimei University， Xianmen， Fujian 361021）

Abstract The condition of primary cell culture was optimized in Haliotis diversicolor and these primary cells of hemocyte and gill were used in RNA interference （RNAi） and exogenous gene expression. Results suggested that hemocyte survived better in higher osmolarity of media， the way of using lymphocyte separation medium to culture hemocyte was beneficial for cell growth. MyD88 dsRNA were added to cell culture medium of hemocyte and gill after 5 days of culture which reduced the expression of MyD88. The plasmid pEGFPN1 was transfected into gill after 5 days of culture and the green fluorescence was detected 5 days later. Above all， the primary cell can survived in vitro and they are a proper tool for gene function analysis by regulating gene expression up or down， which provide convenient way for functional annotation.

Key words Haliotis diversicolor； Primary cell culture； RNAi； Transfection

雜色鮑是我國南方地區(qū)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種之一。但是，隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，爆發(fā)性病害日益嚴(yán)重，已成為雜色鮑養(yǎng)殖業(yè)重要的限制因素。雜色鮑疾病流行的原因眾多[1-3]，但其解決方案卻都需要雜色鮑免疫分子機(jī)制基礎(chǔ)資料的支撐。動(dòng)物機(jī)體是一個(gè)完善自穩(wěn)系統(tǒng)，由多種器官和組織構(gòu)成，各有專職，但又相互配合影響。以整個(gè)動(dòng)物機(jī)體為試驗(yàn)材料進(jìn)行免疫機(jī)制研究時(shí)，難以克服各個(gè)系統(tǒng)和組織之間的調(diào)控和反饋。由于影響因素眾多、試驗(yàn)背景復(fù)雜，導(dǎo)致試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析困難，難以確切描述處理因素和生物機(jī)體響應(yīng)之間的關(guān)系。細(xì)胞系因其細(xì)胞類型單一、功能一致，可以看作是單個(gè)細(xì)胞的放大，能夠避免上述問題，因此被認(rèn)為更適合進(jìn)行免疫功能基因的研究分析[4]。

體外細(xì)胞培養(yǎng)已成為研究復(fù)雜生命過程的重要手段之一，并在免疫學(xué)、病毒學(xué)和細(xì)胞工程等領(lǐng)域被廣泛運(yùn)用。海洋無脊椎動(dòng)物，特別是軟體動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)至今都未取得良好的成果。由于缺少無脊椎動(dòng)物細(xì)胞的生理生化知識，構(gòu)建貝類細(xì)胞培養(yǎng)存在一系列難題[5-6]，比如共生微生物污染、不恰當(dāng)?shù)奶幚碓斐沙审w活力減弱、體外細(xì)胞增殖緩慢、培養(yǎng)基成分不確定、沒有合適的培養(yǎng)基質(zhì)和蛋白水解酶損害細(xì)胞等。因此，目前唯一的軟體動(dòng)物細(xì)胞系來源于胚胎的淡水蝸牛（Bromphalaria glabrat）的BGE[7]。此外，晏萌利用櫛孔扇貝（Chlamys farreri）的發(fā)育潛能較高的幼蟲進(jìn)行原代培養(yǎng)，已經(jīng)傳代到18代，并進(jìn)行了細(xì)胞凍存[8]。由于構(gòu)建細(xì)胞系存在多種困難，研究人員轉(zhuǎn)而投向軟體動(dòng)物原代細(xì)胞培養(yǎng)。軟體動(dòng)物的原代細(xì)胞作為重要的研究手段，在神經(jīng)生物學(xué)、免疫學(xué)、毒理學(xué)、環(huán)境科學(xué)和功能基因組學(xué)等學(xué)科都作出了貢獻(xiàn)。

Bulloch認(rèn)為神經(jīng)元原代細(xì)胞培養(yǎng)可以準(zhǔn)確反映神經(jīng)元的消融和互補(bǔ)[9]，控制節(jié)奏的行為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)識別和映射[10]。Le Pennec對歐洲大扇貝（Pecten maximus）培養(yǎng)的96 h的消化腺腺泡原代細(xì)胞進(jìn)行FDA熒光法、MTT比色法和中性紅染色試驗(yàn)，證明其在結(jié)構(gòu)和功能上保持活性[11]。Parolini采用斑馬紋貽貝（Dreissena polymorpha）的血淋巴、鰓和消化腺原代細(xì)胞檢測阿替洛爾、卡馬西平、雙氯芬酸和菲諾貝特這4種化合物的毒性，臺盼藍(lán)排斥試驗(yàn)表明鰓細(xì)胞和血細(xì)胞對這些藥物具有較高的靈敏度，可以用來進(jìn)行生態(tài)毒理學(xué)研究[12]；AuzouxBordenave研究表明人的降鈣相關(guān)蛋白CGRP可以調(diào)節(jié)疣鮑（Haliotis tuberculata）原代外套膜和血淋巴細(xì)胞的活性，并且增加碳酸酐酶活性，這與活體結(jié)果研究一致，表明CGRPlike控制靶細(xì)胞生物礦化過程[13]。

筆者對雜色鮑的血淋巴、鰓和粘液腺進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，并優(yōu)化了細(xì)胞培養(yǎng)滲透壓和細(xì)胞分離方法，在獲得狀態(tài)良好原代細(xì)胞的基礎(chǔ)上進(jìn)行了RNAi和外源基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，旨在為研究貝類基因的功能提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物。

雜色鮑購自廈門培陽水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，體重為（9.8±0.5）g，暫養(yǎng)于曝氣海水中，水溫約25 ℃，每天投喂新鮮海帶。

1.1.2 培養(yǎng)基。

以商品化DMEM/F12（Hyclone）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的胎牛血清（Hyclone）和飽和NaCl溶液（調(diào)節(jié)pH至7.2，121 ℃ 高壓滅菌20 min），并且添加1 %的雙抗（Hyclone）和0.25 μg/ml兩性霉素以及生長因子（0.5 ‰ β巰基乙醇、50 μg/ml N乙酰葡糖糖胺、50 μg/ml 羧甲基纖維素鈉、10 μg/L Human FGFbasic、5 μg/L Human EGF、1 μg/L Human HGF）。將制備的培養(yǎng)基于4 ℃下保存，使用時(shí)間不超過1個(gè)月。

1.2 方法

1.2.1 雜色鮑的前期處理。

選取活力好的雜色鮑，于過濾滅菌海水中培養(yǎng)2 h后，移入無菌操作臺中，置于一次性培養(yǎng)皿上，用移液槍吸取含雙抗的過濾滅菌海水反復(fù)沖洗雜色鮑腹足，并用滅菌紗布塊擦拭。

1.2.2 血細(xì)胞處理。

用一次性滅菌手術(shù)刀片割腹足中部，并滴加抗凝劑（0.15 g EDTA和0.1 g肝素鈉溶于10 ml稀釋10倍后的飽和NaCl溶液，過濾除菌）于傷口處，將500 μl血加入200 μl的抗凝劑中，混勻，4 ℃，2 000 g，離心5 min。小心棄去上清，輕輕吹打血細(xì)胞，移入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加培養(yǎng)液至5 ml?；蛘吒鶕?jù)索萊寶人淋巴細(xì)胞分離液試驗(yàn)步驟，將500 μl血細(xì)胞加入200 μl的抗凝劑中輕輕顛倒混勻后，全部加到3 ml淋巴分離液中，2 000 g離心20 min。移去上層血清，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 鰓和粘液腺的處理。

用鑷子取出鰓和粘液腺，將整片鰓和粘液腺浸泡在滅菌含雙抗和兩性霉素的過濾海水中，每次5 min，重復(fù)5次（若有組織粘液，浸泡后將組織塊置于滅菌紗布塊上，吸去組織粘液）。用手術(shù)刀片將消毒后的鰓切成較小的組織塊，移入15 ml離心管中，加入2 ml胰酶消化5 min，吸除胰酶，加入3 ml培養(yǎng)液終止消化，吹打組織塊盡量使組織塊分散。將消化后的組織塊移入25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，組織塊均勻分布在培養(yǎng)瓶表面后，吸掉剩下的培養(yǎng)液，干貼倒置24 h后加入5 ml高鹽培養(yǎng)液正置培養(yǎng)。

1.2.4 轉(zhuǎn)染pEGFPN1質(zhì)粒。

吸取過夜培養(yǎng)的菌液100 ml，按照全式金公司去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒步驟提取質(zhì)粒。取穩(wěn)定培養(yǎng)的血細(xì)胞和鰓，按照去除舊培養(yǎng)液，稀釋10倍的飽和氯化鈉溶液清洗1～2次，添加不含血清和雙抗的培養(yǎng)液。將10 μg 質(zhì)粒稀釋于500 μl opti MEM（Gibco）中，輕輕混勻；然后將20 μl Sofast轉(zhuǎn)染試劑（梭華Sofast）稀釋于500 μl opti MEM中，輕輕混勻；將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液滴加到質(zhì)粒稀釋液中，邊滴加邊混勻。孵育20 min后，每孔添加100 μl的Sofast質(zhì)粒復(fù)合物，輕輕搖動(dòng)使其與培養(yǎng)液混合均勻。26 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h后，檢測熒光表達(dá)。

1.2.5 dsRNA合成。

將獲得的雜色鮑MyD88序列輸入到siDirect version 2.0（http：//sidirect2.rnai.jp/）中查找RNA 干擾靶位點(diǎn)，選取1段大小為573 bp（357～929 bp，登錄號為KF922374）的片段作為干擾序列，選取pEGFPN1中綠色熒光蛋白的1段大小為655 bp（741～1 395 bp）的片段作為陰性對照。將這2個(gè)序列分別克隆到pGEMT載體中，測序驗(yàn)證序列的正確性。制備含T7的線性化DNA正向和反向片段，使用Promega膠回收試劑盒回收，根據(jù)T7 RiboMAXTM Express 步驟制備dsRNA，將合成的ssRNA均勻混合，70 ℃水浴10 min后緩慢冷卻至室溫形成dsRNA；加入DNase I 和Rnase A 37 ℃處理30 min后，分別取出DNA模板和單鏈RNA；加入0.1倍3 mol/L乙酸鈉和1倍異丙醇沉淀dsRNA，70%乙醇清洗2次后，稍微干燥加入適量水溶解dsRNA，電泳檢測其正確性，使用分光光度計(jì)檢測其OD值。

1.2.6 dsRNA 干擾方法。

血細(xì)胞和鰓細(xì)胞培養(yǎng)5 d后可進(jìn)行干擾試驗(yàn)。原代細(xì)胞中加入50 μg的MyD88 dsRNA作為試驗(yàn)組，以50 μg EGFP dsRNA作為陰性對照，以50 μl PBS作為空白。每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行。處理24 h后，收集血細(xì)胞和鰓提取細(xì)胞的RNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代細(xì)胞形態(tài)觀察及培養(yǎng)條件優(yōu)化

原代血細(xì)胞在培養(yǎng)1 h內(nèi)就可以貼壁（圖1A），此后3 d細(xì)胞增殖迅速（圖1B），此后進(jìn)入停滯階段，大約7 d后細(xì)胞開始減少貼壁并脫落（圖1C）；原代鰓細(xì)胞加入培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h后就有細(xì)胞從組織塊中遷移出來（圖1D），細(xì)胞多呈顆粒狀，較少有偽足，細(xì)胞大小比較均一，視野下不折射白光。并在此后數(shù)天可以持續(xù)增殖（圖1F），并且可以維持10 d；原代粘液腺細(xì)胞加入培養(yǎng)液后只有少數(shù)細(xì)胞遷移出來并貼壁，分為2種細(xì)胞，大型細(xì)胞和小型細(xì)胞形態(tài)差異大，大型細(xì)胞近似橢圓狀，小型細(xì)胞近似圓形。整體細(xì)胞數(shù)量較少，增殖不明顯（圖1G）。

在DMEM/F12 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，研究添加不同濃度（10%、15% 和20%的胎牛血清）對原代細(xì)胞增值的影響。血、鰓和粘液腺等組織在不同濃度的血清中增殖無差異，所以試驗(yàn)選擇濃度15%的胎牛血清。

比較320、750和1 100 mOsm/kg不同滲透壓對原代細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血、鰓和粘液腺等不同的組織可以在這3種滲透壓中生存。在320 mOsm/kg培養(yǎng)條件下，細(xì)胞能夠貼壁，但細(xì)胞狀態(tài)較差，血細(xì)胞形態(tài)大多為近似圓形，視野下折射出較強(qiáng)的白光下，細(xì)胞較小，多為近似圓形、空泡，視野下折射白光（圖2A），3 d后不再貼壁。在較高的滲透壓條件下，呈現(xiàn)出較為良好的狀態(tài)，細(xì)胞在1 h大多數(shù)細(xì)胞貼壁，形態(tài)飽滿，大小較為均一，細(xì)胞成不規(guī)則形狀，呈上皮樣，伸出多個(gè)偽足，形態(tài)不一，有三角型、Y型、梭型、圓形等。但是，在1 100 mOsm/kg的滲透壓下細(xì)胞貼壁情況更好（圖2B和C）。

研究不同接種方法對血細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果表明直接離心的方法對細(xì)胞損傷大，細(xì)胞貼壁能力下降，凝集現(xiàn)象比較嚴(yán)重，細(xì)胞大多呈現(xiàn)圓形，較少偽足伸出，培養(yǎng)基中細(xì)胞碎片多；采用淋巴分離液的方法對血細(xì)胞存活更有利。

2.2 MyD88 dsRNA對血細(xì)胞和鰓中MyD88表達(dá)的影響

將重組載體送交上海捷瑞生物工程有限公司驗(yàn)證序列正確后，合成dsRNA。qPCR結(jié)果表明對培養(yǎng)5 d的血細(xì)胞以及培養(yǎng)5 d的鰓和粘液腺進(jìn)行dsRNA干擾48 h后，半定量結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組MyD88 的表達(dá)量顯著下降（圖3A），而EGFP組和未處理組沒有顯著差異；經(jīng)檢測，血和鰓各組內(nèi)參基因βactin基本沒有變化（圖3B）。

2.3 轉(zhuǎn)染pEGFPN1質(zhì)粒

梭華-Sofast介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雜色鮑血淋巴和鰓原代細(xì)胞48 h后，置于熒光顯微鏡下檢測綠色熒光，起初4 d未檢測到熒光信號，直至第5天觀察到鰓細(xì)胞具有熒光（圖4），在不更換培養(yǎng)液的情況下熒光可以持續(xù)至第10天。血細(xì)胞狀態(tài)由上皮樣逐漸萎縮變圓至脫落，因此不能觀察到熒光，鰓細(xì)胞形態(tài)基本上沒有發(fā)生變化。

3 討論

3.1 培養(yǎng)基滲透壓的確定

培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽有助于保持細(xì)胞的滲透平衡，陸地和淡水動(dòng)物的滲透壓往往較低，商品化培養(yǎng)基的滲透壓也都是參照哺乳動(dòng)物而設(shè)置的（人的生理鹽度是0.9%，滲透壓約為260～350 mOsm/kg），而大部分海洋動(dòng)物的滲透壓較高[14-15]，所以需要調(diào)整海洋動(dòng)物培養(yǎng)基的滲透壓。日本文昌魚（Branchiostoma belcheri）細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)表皮、鰓、內(nèi)臟、卵巢可以在滲透壓為450～850 mOsm/kg中存活，但在750 mOsm/kg滲透壓條件下細(xì)胞形態(tài)最佳；培養(yǎng)日本對蝦（Penaeus japonicus）肝胰腺細(xì)胞的滲透壓為730 mOsm/kg時(shí)，細(xì)胞生長較好[16]；歐洲鮑螺（Haliotis tuberculata）的鰓細(xì)胞以及紫貽貝（Mytilus edulis）的消化腺和鰓報(bào)道的培養(yǎng)基滲透壓為1 100 mosm/kg [17-18]。該試驗(yàn)中檢測不同滲透壓對血細(xì)胞形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)較高滲透壓有利于細(xì)胞生長，細(xì)胞在形態(tài)和存活時(shí)間上都優(yōu)于低滲透壓，這與其他海洋動(dòng)物培養(yǎng)相似[6]，需要調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓至較高的濃度（大約是哺乳動(dòng)物的2～3倍）才能維持正常的生理活動(dòng)。

3.2 原代細(xì)胞的處理

仿刺參（Apostichopus japonicus）體腔細(xì)胞液細(xì)胞經(jīng)離心重懸后再培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞碎片增多，貼壁能力下降，推測其可能原因是離心后相互擠壓得非常結(jié)實(shí)，經(jīng)吹打后貼壁能力下降[19]。利用淋巴細(xì)胞分離液成功對鯉魚、虹鱒魚對血液的淋巴細(xì)胞進(jìn)行分離[20-21]；筆者所在實(shí)驗(yàn)室也利用分離液對眼斑擬石首魚（Sciaenops ocellatus）的血液進(jìn)行分離，并成功建立了細(xì)胞系，并進(jìn)行核型分析（未報(bào)道）。筆者比較2種處理血淋巴細(xì)胞的不同方式對其生長的影響，結(jié)果表明直接離心的方法對細(xì)胞損傷大，可能是因?yàn)榧?xì)胞在直接離心過程中細(xì)胞凝聚現(xiàn)象比較嚴(yán)重，重懸過程中造成細(xì)胞損傷，從而影響細(xì)胞貼壁及形態(tài)[19]。這是首次利用淋巴細(xì)胞分離液對軟體動(dòng)物淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明使用分離法對血細(xì)胞存活和形態(tài)更為有利。

對于鰓和粘液腺，都可以在滲透壓為1 100 mOsm/kg的培養(yǎng)基條件下生長。利用胰酶消化這2個(gè)組織，倒置干貼啟動(dòng)原代培養(yǎng)。與其他組織培養(yǎng)不同，軟體動(dòng)物的鰓和粘液腺都附著豐富的黏液，附生著大量的微生物[12，22]，所以在培養(yǎng)這類組織時(shí)就要采取嚴(yán)格的消毒措施，以防止細(xì)胞污染。在鰓和粘液腺進(jìn)行除菌過程中，鰓需要在含高濃度抗生素的生理鹽水中漂洗多次。對于粘液腺上，還需要用紗布塊吸走粘液，這可能會對組織脫水，造成一定的損傷。倒置48 h后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，粘液腺的組織塊在輕微晃動(dòng)的情況下就會脫離細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶底，可能是因?yàn)檎骋翰荒鼙煌耆M，造成組織游離在細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面，只有很少細(xì)胞會貼在瓶底；鰓的組織塊貼壁比較穩(wěn)固，且培養(yǎng)2 d后就能夠在組織塊附近發(fā)現(xiàn)有較多細(xì)胞遷移出來，且單個(gè)細(xì)胞貼壁穩(wěn)固，并有增殖的現(xiàn)象。

3.3 MyD88 dsRNA對血細(xì)胞和鰓中MyD88表達(dá)的影響

目前，RNAi技術(shù)已經(jīng)被廣泛運(yùn)用到海洋無脊椎動(dòng)物中，在太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）中注射ds HIFa導(dǎo)致 HIFa在外套膜、鰓和血淋巴中顯著降低[23]；You等使用RNAi技術(shù)干擾文蛤（Meretrix meretrix）原代消化腺細(xì)胞Ferritin基因，qPCR結(jié)果表明Ferritin基因的表達(dá)量與空白組相比下調(diào)了66.11%，WB結(jié)果表明蛋白水平下調(diào)了和20%[4]。該試驗(yàn)中PCR結(jié)果表明成功干擾了血和鰓細(xì)胞MyD88 基因，使其在試驗(yàn)組ds RNA組的表達(dá)量變低，而在對照組 EGFP ds RNA處理?xiàng)l件下其表達(dá)量與對照組基本上沒有差異。相對于活體，原代培養(yǎng)細(xì)胞為研究軟體動(dòng)物基因功能的驗(yàn)證提供了較好的選擇。

3.4 轉(zhuǎn)染pEGFPN1質(zhì)粒

梭華-Sofast介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雜色鮑血淋巴和鰓原代細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后血淋巴細(xì)胞形態(tài)變差。這可能是因?yàn)檠?xì)胞分化程度高，在體外培養(yǎng)條件下存活時(shí)間較短；轉(zhuǎn)染試劑可能對血細(xì)胞產(chǎn)生很大的毒性，造成細(xì)胞脫落。鰓細(xì)胞形態(tài)基本上沒有變化，并且在轉(zhuǎn)染后第5天可以見到熒光。鰓作為雜色鮑重要的呼吸器官在水中進(jìn)行氣體交換，會經(jīng)常接觸到有毒物質(zhì)或者異物，其細(xì)胞具有較強(qiáng)的再生和修復(fù)能力[6，17，24]。這可能是鰓能夠被轉(zhuǎn)染而且可以在體外培養(yǎng)較長時(shí)間的原因之一。利用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑通常在48 h 左右就能夠檢測到熒光，但是鰓細(xì)胞需要在第5天才能夠檢測到，并且效率不高。究其原因，包括以下方面：①原代細(xì)胞不適合用于轉(zhuǎn)染；②鰓發(fā)揮其免疫功能，在一定程度上阻止轉(zhuǎn)染試劑DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；③培養(yǎng)液的高濃度離子對轉(zhuǎn)染造成影響；④需要利用轉(zhuǎn)染效率更高的方法，如病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法。

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