金櫻子隨機擴增多態(tài)性DNA分析

王曉麗　王曉玲　常楚瑞

摘要[目的]揭示不同產(chǎn)地金櫻子30個居群間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。[方法]采用RAPD分子標記技術(shù)，從35條RAPD隨機引物中，篩選出8條有效引物進行擴增，用NTSYSpc，ver.2.02軟件進行UPGMA聚類分析。[結(jié)果]共擴增出86條帶，其中多態(tài)性條帶84條，多態(tài)性百分率（PPB）97.67%。30個居群的相似性系數(shù)在0.11～0.58，聚成A、B、C三大類群。[結(jié)論]金櫻子具有豐富的遺傳多態(tài)性，產(chǎn)自貴州地區(qū)的金櫻子有較近的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞金櫻子；隨機擴增多態(tài)性DNA；親緣關(guān)系

中圖分類號S188；R284.2文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）07-023-02

金櫻子為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigata Michx.的干燥成熟果實，又名倒蜂糖罐、糖桔子、刺梨子、山石榴等，性酸、澀、平，能補腎益氣、補血益精、澀精縮尿、止瀉。久服令人耐寒輕身?，F(xiàn)代藥理研究表明，金櫻子具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降低血清膽固醇含量、降血脂、抗動脈粥樣硬化等功能，并有明顯的抑菌及抗病毒等作用。主要用于治療尿頻遺尿、遺精滑精、久瀉久痢、白帶過多、婦女子宮脫垂等癥。因其富含維生素C、糖等，民間將其果實作為食用；也可用于泡酒，金櫻子酒具有滋補、強身健體的功效。2002年，我國衛(wèi)生部將金櫻子列入保健食品的行列。金櫻子具有藥食同源的重要價值，開發(fā)應(yīng)用前景十分廣闊，經(jīng)濟效益潛力頗大。金櫻子在我國西南、華南、華中、華東均有分布，尤其以貴州分布最廣，產(chǎn)量最高，是貴州大宗藥材之一。目前關(guān)于全櫻子隨機擴增多態(tài)性DNA分析國內(nèi)外尚未見報道[1-5]。為了探討以貴州為主不同生長地區(qū)金櫻子的遺傳分化情況，筆者在DNA分子水平上，采用RAPD（DNA隨機擴增多態(tài)性）分子標記技術(shù)，對金櫻子的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進行分析，為對金櫻子優(yōu)良性評價和資源保護具有十分重要的意義。

1材料與方法

1.1供試樣品

于2012年，主要采集于貴州及相鄰省份，不同產(chǎn)地品種共30個居群，經(jīng)貴陽醫(yī)學院生藥學教研室鑒定為金櫻子Rosa laevigata Michx.（表1）。

表1樣品編號及產(chǎn)地

1.2試劑

CTAB（十六烷基三甲基溴化銨，F(xiàn)arco），PVP（聚乙烯吡咯烷酮，Basf），瓊脂糖（Promega），溴化乙錠（EB， Sigma），RNASE（Promega），限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq酶、聚丙烯酰胺等均購自上海生物工程有限公司。

1.3儀器

低溫高速離心機（BECKMAN，GS-15R）；凝膠成像儀（UVP，GDS7600G）；電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.4金櫻子基因組DNA的提取

DNA提取采用CTAB法[6-7]。

1.5引物篩選[8]

先用1個DNA 樣品，對引物初選，再用4個樣品DNA 進行第2 次篩選，選取多態(tài)性高的8個引物用于RAPD 試驗，這8個引物分別為S1：GTTTCGCTCC，S22：TGCCGAGCTG，S5：TGCGCCCTTC，S29：GGGTAACGCC，S6：TGCTCTGCCC，S40：GTTGCGATCC，S10：CTGCTGGGAC，S45：TGAGCGGACA。

1.6PCR反應(yīng)體系和程序

PCR反應(yīng)體系總體積20 μl：ddH2O 6.5 μl，2×PCRMix10 μl，引物（10 μmol/L ）1.5 μl，DNA 2 μl。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性8 min，然后進行35個循環(huán)（每個循環(huán)包括94 ℃變性30 s、36 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min） ，最后在72 ℃下延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物加2 μl上樣緩沖液（40%蔗糖、0.25%溴酚藍） ，經(jīng)電壓110 V，電泳50 min，1.5%瓊脂糖檢測，然后用溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色10 min，并在凝膠成像儀（UVP，GDS7600G）系統(tǒng)下拍照記錄。每個反應(yīng)重復(fù)2 次，確定所得條帶的可重復(fù)性。

1.7數(shù)據(jù)分析

記錄金櫻子RAPD擴增出的總條帶數(shù)，記錄可辨認的、2次擴增結(jié)果一致的條帶。經(jīng)Gel-Pro Analyzer Version 4.5軟件識別，根據(jù)擴增條帶的遷移率，同一遷移率有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，采用軟件SYSpc， ver.2.2計算金櫻子各樣品的遺傳相似度，繪制聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1金櫻子DNA檢測結(jié)果

金櫻子DNA檢測結(jié)果見圖1。由圖1可知，電泳條帶較為清晰可辨，說明供試DNA樣品的濃度適合于后續(xù)試驗。

2.2RAPD引物擴增檢測結(jié)果

參考薔薇科部分植物多態(tài)性隨機引物，從35個隨機引物中篩選出8個重復(fù)性好、多態(tài)性強的引物擴增，共得到86條帶，其中84條表現(xiàn)出多態(tài)性，占總帶數(shù)的97.67%，平均每個引物擴增的DNA帶數(shù)為

10.75條。擴增位點分子量在200～2 000 bp（圖2）。

圖1金櫻子DNA檢測結(jié)果

圖2引物S45的RAPD指紋圖譜

2.3 聚類分析

由圖3可知，金櫻子RAPD擴增結(jié)果的遺傳相似性系數(shù)在0.11～0.58，生長在不同地區(qū)金櫻子的DNA具有一定的變異，供試品金櫻子聚成了A、B、C三大類群。產(chǎn)自貴州銅仁的1～2號供試品聚為A類，產(chǎn)自烏當、馬鈴、黔桃、金沙、丹寨、興仁、都勻、三都的3～29號供試品聚為B類；產(chǎn)自廣東肇慶的30號供試品單獨聚為C類。A、B兩類群的親緣關(guān)系較近，C與A、B的親緣關(guān)系較遠。

圖3金櫻子RAPD分子標記UPGMA聚類圖

3結(jié)論與討論

（1）該試驗通過嚴格控制反應(yīng)體系和條件，得到重復(fù)性好的擴增結(jié)果，有效地揭示供試樣品金櫻子種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性與寬廣的遺傳基礎(chǔ)。廣義的遺傳多樣性是指地球上所有生物所攜帶的遺傳信息的總和。狹義的遺傳多樣性是指種內(nèi)的遺傳多樣性，即種內(nèi)個體之間或一個群體內(nèi)不同個體的遺傳變異總和。物種的遺傳多樣性越高，遺傳變異越豐富，對外界環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強，說明物種生存繁衍的能力越強。因而，可以利用其優(yōu)良變異類型，創(chuàng)造新的變異，選育優(yōu)良品種 [9-10]。

（2）該試驗從35個RAPD引物中篩選出8個可擴增出清晰、穩(wěn)定圖譜的引物，用于指紋圖譜構(gòu)建，共擴增出86條帶，其中多態(tài)性條帶84條，平均多態(tài)性位點百分率（PPB）達97.67%。

（3）通過聚類分析，結(jié)果表明，30個居群RAPD擴增結(jié)果的遺傳相似性系數(shù)在0.11～0.58，聚成A、B、C三大類群。

A、B兩類群的親緣關(guān)系較近，C與A、B的親緣關(guān)系較遠。

地理分布越近，金櫻子居群間的遺傳差異越小。產(chǎn)自貴州地區(qū)的金櫻子之間有較近的親緣關(guān)系。

（4）隨機擴增多態(tài)性（RAPD）技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于藥用

植物種質(zhì)資源及品種鑒定、系譜分析及進化關(guān)系的研究。遺傳資源保存和品種資源目錄的建立都依賴對其遺傳多樣性及親緣關(guān)系的掌握，該研究采用隨機擴增多態(tài)性（RAPD）技術(shù)，為金櫻子種質(zhì)提供準確的遺傳信息，并對其遺傳多樣性及親緣關(guān)系進行了科學分析，該研究結(jié)果對金櫻子品種指紋圖譜的構(gòu)建、品質(zhì)評價、種質(zhì)資源保護等具有重要意義[11-14]。

參考文獻

[1]

貴州省中藥資源普查辦公室，貴州省中藥研究所. 貴州中藥資源[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 1992：293-296.

[2] 李連芳，王曉麗. 貴州產(chǎn)金櫻子多糖的含量測定[J]. 貴陽醫(yī)學院學報，2013，38（2）：162-168.

[3] 曹運長，文紅波，吳玉蘭，等. 金櫻子總黃酮對過氧化氫損傷內(nèi)皮細胞的保護作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2013， 24（5）：1159-1161.

[4] 劉學貴，李佳駱，高品一，等.藥食兩用金櫻子的研究進展[J].食品科學，2013，34（11）：392-398.

[5] 陳祖云，王曉麗，宋聚先.貴州天麻遺傳多態(tài)性的ISSR初步分析[J].中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（7）：436-439.

[6] 王曉玲，王曉多.天麻總DNA提取的研究[J].世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代，2005，7（2）：110-111.

[7] 鄒佳寧，宋聚先，常楚瑞，等.貴州天麻種質(zhì)資源的RAPD分析[J].中藥材，2006，29（9）：881-883.

[8] 陳陽，周先治，陳晟，等.花椰菜RAPD隨機引物的篩選[J].中國農(nóng)學通報，2010，26（12）：22-25.

[9] 陳祥平，范小敏，柯皓天，等.湖北省桑屬植物親緣關(guān)系RAPD分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2014，42（7）：1917-1920.

[10] MA X，CHEN S Y，BAI S Q，et al. RAPD analysis of genetic diversity and population structure of Elymus sibiricus（ Poaceae ） native to the southeastern Qinghai Tibet Plateau，China[J]. Genet Mol Res，2012，11（ 3） ： 2708-2718.

[11] 李小梅，張立微，張景濤.芫荽遺傳多樣性RAPD分析[J].北方園藝，2014（15）：97-100.

[12] 王曉麗，王曉玲，王曉多.天麻親本材料的分子標記[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2010，38（2）：10-12.

[13] 王曉麗，陳祖云，宋聚先.野生與雜交天麻的DNA標記鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（27）：14860，14916.

[14] 王曉麗，常楚瑞，宋聚先，等.天麻不同種質(zhì)的AFLP和SSR分析[J].中華中醫(yī)藥雜志（原中國醫(yī)藥學報），2012，27（3）：555-558.