超聲輔助提取紅豆蛋白及其功能特性初步研究

劉立　陳學(xué)林　羅巧玲

摘要[目的]優(yōu)化超聲輔助法提取紅豆蛋白的工藝，同時(shí)探討紅豆蛋白功能特性。[方法]采用超聲輔助法提取紅豆蛋白，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇最佳的料液比、提取pH、超聲時(shí)間、溫度為影響因子，以紅豆蛋白提取率為響應(yīng)值，確定最優(yōu)的工藝條件并研究紅豆蛋白功能特性。[結(jié)果] 超聲輔助法提取紅豆蛋白最優(yōu)的工藝條件為：料液比1∶11.2 g/ml、pH 7.2、超聲時(shí)間52 min、溫度51 ℃，紅豆蛋白提取率可達(dá)到81.20%。紅豆蛋白功能特性研究表明：遠(yuǎn)離等電點(diǎn)及NaCl濃度為0.8 mol/L時(shí)，紅豆蛋白具有良好的持水性、溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性；蔗糖會增加紅豆蛋白的持水性，但會降低其溶解性，對乳化性和乳化穩(wěn)定性影響不大；溫度在60 ℃時(shí)紅豆蛋白持水性、乳化性及乳化穩(wěn)定性較好，在50 ℃溶解性與吸油性較好，且都隨溫度的進(jìn)一步升高而減小。[結(jié)論] 研究可為紅豆蛋白的開發(fā)利用和生產(chǎn)研究提供一定的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考。

關(guān)鍵詞紅豆；超聲法；蛋白功能特性

中圖分類號S521文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2015）07-302-05

Preliminary Study on the Tltrasonic-aided Extraction of Adzuki Bean Protein and Its Functional Properties

LIU Li， CHEN Xue-lin*， LUO Qiao-ling （College of Life Science， Northwest Normal University， Lanzhou， Gansu 730070）

Abstract [Objective] To optimize technique for extracting adzuki bean protein by ultrasonic assisted method， discuss functional characteristics of adzuki bean. [Method] Based on the single factor experiment， the optimal solid-liquid ratio， pH， ultrasonic time， temperature as influencing factors， extraction yield as response value， the optimal conditions were determined and functional characteristics were studied. [Result] The best combination was：solid to liquid ratio 1∶11.2 g/ml， pH 7.2， extraction time 52 min， extraction temperature 51 ℃， and the yield of adzuki bean protein reached up to 81.20%. The results of studying on functional properties of adzuki bean protein indicated that better ability of water retainmen， solubility， emulsibility and emulsion stability of adzuki bean protein were observed at pH far away from isoelectric point and concentration of NaCl at 0.8 mol/L； and along with sucrose concentration increasing， the ability of water retainmen increased， but the solubility decreased and no pronounced changes in the emulsibility and emulsion stability； ability of water retainmen， emulsibility and emulsion stability of adzuki bean protein were better at 60 ℃， solubility， oil absorption were better at 50 ℃， and all decreased following with the further increase of temperature. [Conclusion] The study can provide a certain theoretical basis and data reference for development， utilization and production of adzuki bean protein.

Key words Adzuki bean； Tltrasonic； protein fuctional properties

紅豆 （Vigna angularis）又叫赤豆、小豆、紅小豆等，是我國重要的豆科豇豆屬植物，營養(yǎng)全面，富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素B族等物質(zhì)，含有較低的脂肪和鐵、鉀、磷、鈣等多種礦質(zhì)元素，并含有其他豆類植物含量少或者沒有的三萜皂苷等成分。紅豆入藥有治療水腫腳氣、瀉痢、癰腫、補(bǔ)血等藥理活性[1]，并為緩和的清熱解毒藥及利尿藥。此外，紅豆還能夠補(bǔ)脾、益氣、益腎、補(bǔ)肝和抗氧化，抑制癌細(xì)胞的增長，對糖尿病有一定的營養(yǎng)保健功能[2-3]，開發(fā)利用前景極為廣闊。目前，國內(nèi)外對紅豆的研究主要還集中在淀粉理化性質(zhì)方面的研究[2，4]、天然色素的提取[5-6]、抗氧化的功能[7-8]及其食品開發(fā)方面[9-10]，在紅豆蛋白提取方面及其應(yīng)用研究方面的報(bào)道相對比較缺乏[3，11]。

筆者采用超聲輔助法提取紅豆蛋白質(zhì)，通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化紅豆蛋白的提取工藝，并對紅豆蛋白的溶解性、吸油性、持水性、乳化性及乳化穩(wěn)定性進(jìn)行研究，旨在為紅豆蛋白的開發(fā)利用和生產(chǎn)研究提供一定的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考。

1材料與方法

1.1材料

紅豆，購于甘肅省張掖市甘州區(qū)新樂超市；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白、85%濃磷酸、95%乙醇、氯化鈉、蔗糖，均為國產(chǎn)分析純。PL-203電子天平，722型可見分光光度計(jì)，SB120DT超聲波清洗機(jī)，LNG-798A離心機(jī)，HJ-3數(shù)碼恒溫磁力攪拌器，DHG-9101·1型電熱恒溫干燥箱。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

精確稱取牛血清蛋白0.012 mg，加入0.15 g NaCl，用少量蒸餾水溶解定容至100 ml，配制120 g/ml的牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml上述溶液用蒸餾水稀釋至1.0 ml，分別加入5.0 ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，在595 nm處測定其吸光值[12]。以試管中標(biāo)準(zhǔn)蛋白的總量（μg）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度的值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并制作線性回歸曲線，得到回歸方程為：Y=0.005 9 X+0.024 5，R2=0.993 9，兩者之間有較顯著的相關(guān)性。

1.2.2紅豆蛋白提取及含量測定。

按照試驗(yàn)步驟稱取適量粉碎的紅豆粉，加入相應(yīng)體積不同pH的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液，在一定的溫度、時(shí)間條件下進(jìn)行超聲浸提，浸提液在3 000 r/min條件下離心5 min，取上清液1.0 ml加入5.0 ml考馬斯亮藍(lán)溶液測其吸光值，計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)的質(zhì)量以及提取率。提取率計(jì)算公式為：

提取率（%）=樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量紅豆粉質(zhì)量×100%

1.2.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1單因素試驗(yàn)。

分別以提取溫度、pH、料液比、提取時(shí)間為影響因素，以紅豆中蛋白質(zhì)含量為考核目標(biāo)，確定各個(gè)因素對紅豆蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.3.2BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析。

在單個(gè)因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對影響紅豆蛋白提取率的料液比、pH、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)[13]，各因素設(shè)置5水平用代碼-2、-1、0、1、2表示，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1Box-Behnken試驗(yàn)因素水平

水平因素

料液比（X1）g/mlpH（X2）時(shí)間（X3）min溫度（X4）℃

-21∶5.06.03030

-11∶7.56.54040

01∶10.07.05050

11∶12.57.56060

21∶15.08.07070

1.2.4紅豆蛋白性質(zhì)測定。

1.2.4.1

持水性能測定。

用0.1 mol/L的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)0.01 mol/L的Na2HPO4溶液，將其設(shè)置為不同的pH溶液，用1.0 mol/L的NaCl溶液配制成不同濃度梯度的鹽溶液；稀釋50 g/L的蔗糖溶液配制成不同質(zhì)量濃度的蔗糖溶液。分別取以上各溶液1.5 ml和不同溫度的蒸餾水1.5 ml，加入提取出來的紅豆蛋白粗品5 mg，攪拌均勻后放置20 min，使其充分的吸水，在3 000 r/min條件下離心30 min，傾出上清液，稱量沉淀的質(zhì)量，按以下公式計(jì)算紅豆蛋白的持水性[14]：

赤豆蛋白持水性（g/g）=離心后沉淀質(zhì)量-蛋白粗品質(zhì)量蛋白粗品質(zhì)量

1.2.4.2乳化性和乳化穩(wěn)定性測定。

配制不同pH、不同NaCl濃度以及不同蔗糖質(zhì)量濃度的混合溶液，分別取50 mg/ml紅豆蛋白粗提物，加入1 ml的大豆油，將其超聲處理2 min，3 000 r/min離心5 min，按以下公式計(jì)算紅豆蛋白的乳化能力[15]。

乳化性（%）=乳化層體積離心管中液體總體積×100

通過以上方法得到的混合液放置于80 ℃條件下保溫30 min，然后將其冷卻至室溫，用30 000 r /min離心5 min，取出后測量乳化層的體積。乳化穩(wěn)定性計(jì)算公式為：

乳化穩(wěn)定性（%）=乳化層剩余體積乳化層初體積×100

1.2.4.3吸油性測定。取紅豆蛋白粗體物5 mg，加入1.5 ml大豆油將其攪拌均勻，在不同的溫度下靜置30 min，之后再3 000 r/min離心15 min，去除游離油，按照以下公式計(jì)算紅豆蛋白的吸油性[16]：

赤豆蛋白吸油性（g/g）=

離心后沉淀質(zhì)量-蛋白粗品質(zhì)量蛋白粗品質(zhì)量

1.2.4.4

等電點(diǎn)測定。分別配制一定濃度不同pH的紅豆蛋白溶液，在3 000 r/min條件下離心30 min，取上清液測定蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)濃度最低時(shí)的pH就是等電點(diǎn)[17]。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

分別把提取溫度、提取時(shí)間、料液比、pH作為影響因素，以紅豆蛋白質(zhì)含量為考察目標(biāo)，確定了最佳的料液比為1∶10 g/ml，最適的pH為7，最佳提取時(shí)間為50 min，最適的提取溫度為50 ℃。

2.2紅豆蛋白提取工藝的優(yōu)化

以紅豆蛋白提取率Y作為因變量，使用Design-Expert 8.0.5.0軟件對各因素（自變量）進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，得到以紅豆蛋白提取率為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸程為：Y=81.20+0.86X1+0.66X2+0.59X3+0.57X4+0.060X1X2+0.046X1X3-0.045X1X4-0.29X2X3-0.39X2X4-0.21X3X4-0.88X21-0.80X22-0.83X23-0.81X24。此預(yù)期模型的相關(guān)系數(shù)為R2=98.06%，模型擬合程度較為良好，說明這個(gè)方程可以較好地解釋以上4個(gè)單因素對紅豆蛋白提取率的影響程度。

表2CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

F失擬=4.47，P失擬=0.056 1。***差異極顯著（P<0.001）；**差異高度顯著（P<0.01）；*差異顯著（P<0.05）[18] 。

由此能夠看出，模型的顯著性水平小于0.001，此時(shí)的回歸方差模型是極顯著，這個(gè)方程和實(shí)際情況的擬合很好，很好地反映出了紅豆蛋白提取率和溫度、料液比、pH、超聲時(shí)間的關(guān)系。在選取的各因素的水平范圍以內(nèi)，根據(jù)對紅豆蛋白提取率影響程度排序，得：X1>X2>X3>X4，即料液比>pH>提取時(shí)間>提取溫度。

2.3響應(yīng)面分析

響應(yīng)面方法（RSM）的圖形是一種特定響應(yīng)值Y和對應(yīng)因素X1、X2、X3、X4構(gòu)成的一個(gè)三維空間圖，可以直觀地反映各個(gè)因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響情況，這樣有利于確定最佳提取工藝的參數(shù)范圍。固定這2個(gè)因素在零水平，研究其他2個(gè)因素之間的交互效應(yīng)，使用Design-Expert 8.0.5.0軟件做響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖1。

圖1不同因素對紅豆蛋白提取率的響應(yīng)面圖及等高線

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

2.4優(yōu)化試驗(yàn)驗(yàn)證

按照CCD優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果，確定的最佳提取工藝條件為料液比1∶11.2 g/ml、pH為7.2、超聲時(shí)間為52 min、溫度為51 ℃，在優(yōu)化的提取工藝條件下提取3次求取平均值，和最佳提取工藝條件下模擬結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，預(yù)測值為82.145 5%，實(shí)測值為81.20%，偏差率為0.255%。實(shí)測值與預(yù)測值之間的偏差率相對較小，說明驗(yàn)證試驗(yàn)的預(yù)測值和實(shí)測值之間相吻合，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)有較好的預(yù)測效果。

2.5紅豆蛋白特性測定

2.5.1持水性測定。

圖2表明，紅豆蛋白的持水性受到溫度、離子強(qiáng)度、pH和蔗糖質(zhì)量濃度的影響較為明顯。當(dāng)pH等于4時(shí)，紅豆蛋白持水性降到最低，說明此時(shí)正處在紅豆蛋白的等電點(diǎn)附近，蛋白質(zhì)處于兼性離子的狀態(tài)，其帶的凈電荷為零，蛋白質(zhì)分子分散程度比較低，水化能力較小，因此持水性表現(xiàn)的最低。反之，離紅豆蛋白的等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)所帶的凈電荷越多，蛋白質(zhì)分子的靜電斥力就會增加、分散程度也越高，水化能力和持水性就會越強(qiáng)。在NaCl濃度為0～0.8 mol/L的范圍以內(nèi)，紅豆蛋白的持水性隨著NaCl濃度的增大而增大，NaCl濃度為0.8 mol/L時(shí)達(dá)到了最大，原因是由于發(fā)生了“鹽溶”現(xiàn)象，使蛋白質(zhì)帶的電荷增多，蛋白質(zhì)的水化能力增強(qiáng)，持水性增加了；但是大于0.8 mol/L時(shí)則表現(xiàn)出下降趨勢，可能是發(fā)生了鹽析沉淀造成的。由于鹽類解離出的離子與水分子的結(jié)合，降低了蛋白質(zhì)水合作用，從而降低蛋白質(zhì)的持水性。蔗糖質(zhì)量濃度在0～50 g/L的范圍內(nèi)，紅豆蛋白持水性一樣表現(xiàn)出隨著蔗糖質(zhì)量濃度增大而增大，這可能是因?yàn)檎崽欠肿又杏写罅康牧u基能夠吸引和保持水分，增加了紅豆蛋白持水性。在60 ℃以下時(shí)，紅豆蛋白持水性會隨著溫度升高而增加，這是由于溫度增加把原本結(jié)構(gòu)致密的蛋白質(zhì)變性，其構(gòu)象發(fā)生了改變，蛋白質(zhì)分子解離和伸展以及適當(dāng)升溫都有助于蛋白質(zhì)分子與水分子相互作用；但是隨著溫度進(jìn)一步的升高，蛋白質(zhì)變性，分子內(nèi)部的非極性基團(tuán)大量暴露于外圍，使得蛋白質(zhì)持水性下降。

圖2pH、離子強(qiáng)度、蔗糖質(zhì)量濃度、溫度對紅豆蛋白持水性的影響

2.5.2 紅豆蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性。

蛋白質(zhì)是食品以及保健品等行業(yè)中安全并且有效的乳化劑，它能夠降低水和油表面的張力，使它們?nèi)菀兹榛?；另一方面，蛋白質(zhì)分散在非連續(xù)相和連續(xù)相間的界面上，阻止非連續(xù)相聚積，可以有助于乳狀液的穩(wěn)定。

由圖3可以看出，紅豆蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性都隨

圖3pH、離子強(qiáng)度、蔗糖質(zhì)量濃度、溫度對紅豆蛋白乳化性及如化穩(wěn)定性的影響

著pH和離子強(qiáng)度的變化趨勢和溶解度曲線保持一致，這可能是由于蛋白質(zhì)乳化性與穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)溶解度呈正相關(guān)造成的，當(dāng)遠(yuǎn)離紅豆蛋白等電點(diǎn)和“鹽溶”作用的影響，蛋白質(zhì)溶解度比較強(qiáng)，蛋白質(zhì)間的排斥力會增強(qiáng)，油滴更容易吸附到蛋白質(zhì)的界面上[19]?？扇苄缘鞍踪|(zhì)能擴(kuò)散并且吸附到油—水界面是決定蛋白質(zhì)乳化性質(zhì)最重要的因素之一。當(dāng)pH大于7、NaCl濃度大于0.8 mol/L時(shí)，紅豆蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性出現(xiàn)下降趨勢，這是由于蛋白質(zhì)溶解度進(jìn)一步增加引起的，可使膠體水化層變薄，蛋白質(zhì)發(fā)生凝聚，降低了乳化性和乳化穩(wěn)定性，同時(shí)溶解度較低時(shí)，沒有溶解的蛋白質(zhì)顆粒對乳狀液的穩(wěn)定起到了重要的作用[20]。蔗糖可以增加紅豆蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性，隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增大而有小的增加幅度，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)通過在油滴界面形成了一層薄膜而產(chǎn)生立體阻礙效應(yīng)以達(dá)到穩(wěn)定乳狀液，添加蔗糖改變了水相介質(zhì)的流變特性，升高了體系黏稠度，并和蛋白質(zhì)發(fā)生交互作用使得乳狀液穩(wěn)定[21]。紅豆蛋白乳化性隨著溫度的變化趨勢和其溫度—溶解度曲線相吻合，這可以證明可溶性是蛋白質(zhì)有乳化性質(zhì)的先決條件，只有蛋白質(zhì)具有一定的溶解度，才能有效地向油-水界面擴(kuò)散。隨著溫度的升高，紅豆蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性表現(xiàn)出先上升后降低的趨勢，在60 ℃時(shí)表現(xiàn)出最大的乳化性和乳化穩(wěn)定性，這是因?yàn)檫m度加熱處理會使蛋白質(zhì)分子伸展、溶解度增加，蛋白質(zhì)之間排斥力的減小，會使油滴容易吸附到蛋白質(zhì)界面上，促進(jìn)蛋白的乳化能力；可是溫度過高會降低吸附到界面上蛋白質(zhì)膜的黏度和硬度，因此乳化性和乳化穩(wěn)定性會有所降低[19]。

2.5.3吸油性測定。

蛋白質(zhì)的吸油性是指蛋白質(zhì)和游離油脂互相的結(jié)合能力。對于食品風(fēng)味，蛋白質(zhì)吸油性是一項(xiàng)重要的功能特性，能夠提高食品對于脂肪的吸收和保留能力，減少脂肪在加工中的損失，從而提高食品的適口性和風(fēng)。

圖4表明，紅豆蛋白的吸油性會隨著溫度升高而下降，原因可能是隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)分子漸漸解離和伸展以致變性，肽鏈伸展后會和高溫處理后發(fā)生氧化的油的中小分子產(chǎn)生作用[19]。

圖4溫度對紅豆蛋白吸油性的影響

2.5.4等電點(diǎn)測定。

在蛋白質(zhì)的分子中，盡管各個(gè)氨基酸間是通過肽鍵連接的，但是其分子依舊有很多可以解離的基團(tuán)，如氨基、酚羥基、羧基、咪唑基等，因而蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)。調(diào)節(jié)溶液的pH，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子中帶有的正電荷數(shù)量和負(fù)電荷數(shù)量相等，因此靜電荷為零，在電場中不移動，此時(shí)溶液pH就是該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

由圖5可知，pH等于3.6時(shí)，溶液中紅豆蛋白聚集沉淀，蛋白質(zhì)含量達(dá)到最低，此時(shí)蛋白質(zhì)分子中帶有的正電荷數(shù)量和負(fù)電荷數(shù)量相等，靜電荷等于零，即等電點(diǎn)是3.6。

圖5pH與紅豆蛋白濃度的關(guān)系

3結(jié)論

在單因素試驗(yàn)處理的基礎(chǔ)上，通過CCD組合交錯(cuò)試驗(yàn)，得到超聲波輔助提取紅豆蛋白最佳工藝條件為：料液比為1∶11.2 g/ml、pH為7.2、超聲時(shí)間為52 min、溫度為51 ℃，提取率達(dá)81.20%。

當(dāng)pH在等電點(diǎn)附近時(shí)，紅豆蛋白具有很好的持水性、乳化性和乳化穩(wěn)定性。NaCl溶液的濃度在0～0.8 mol/L范圍內(nèi)時(shí)，紅豆蛋白溶解性和持水性、乳化穩(wěn)定性和乳化性與NaCl濃度的增加呈正相關(guān)，并且隨著鹽濃度增加而呈現(xiàn)下降趨勢。

加入蔗糖會增加紅豆蛋白的持水性，溶解性先下降后升高，在37 g/L時(shí)為最低，乳化性和乳化穩(wěn)定性隨著蔗糖濃度增大而稍有增加，但是增加幅度并不大。溫度在20～60 ℃范圍以內(nèi)時(shí)，紅豆蛋白持水性和乳化性以及乳化穩(wěn)定性會隨著溫度升高而增大，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大值；溶解性和吸油性在50 ℃時(shí)達(dá)到最大值，并且隨溫度的進(jìn)一步升高均表現(xiàn)出下降趨勢。

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